Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 2:44 min • April 30th, 2023
- For single worm PCR analysis, allow a hermaphrodite worm to self fertilize and lay eggs that will produce genetically identical offspring and therefore, preserve a copy of the modified strain. Then, transfer the parent to a tube containing worm lysis buffer.
Freeze the tube at minus 80 degrees Celsius to break open the cuticle or outer layer. Heat the sample to plus 60 degrees Celsius to lyse the worm cells releasing the intracellular proteins along with the cell's genomic DNA. At this temperature, the proteinase K within the buffer degrades the proteins, particularly nucleases that would otherwise destroy the genomic DNA.
Then, raise the temperature to 95 degrees Celsius to inactivate the enzyme. Finally, add the cell lysate to a tube with a PCR master mix composed of reaction buffer, dNTPs, forward and reverse primers for the region of interest, taq polymerase, and water bringing the reaction to a desired final volume. To perform the PCR, run the appropriate thermal cycler program that amplifies the DNA region of interest.
In the following example, we will see a PCR procedure to screen for CRISPR-Cas9 editing events in the genomic DNA of single F1 worms.
- After 1 to 2 days of egg-laying, use a worm pic to transfer the F1s into individual PCR strip tube caps containing 7 microliters of warm lysis buffer. Centrifuge the PCR tubes at maximum speed and room temperature for one minute to bring the animals to the bottom of the tube. Then, freeze the tubes at negative 80 degrees Celsius for one hour.
Next, lyse frozen worms in a thermal cycler using the following program. Then, set up a PCR master mix as shown in this table.
Add 21 microliters of PCR master mix into clean PCR tubes. Then, add 4 microliters of the worm lysis tube and mix well by pipetting.
Then, run the PCR program following the manufacturer's guidelines.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor PCR-analyse van individuele wormen om CRISPR-Cas9-bewerkingsgebeurtenissen in het genomisch DNA van Caenorhabditis elegans te screenen. De methode omvat de lysis van hermafrodiete wormen en de amplificatie van specifieke DNA-regio's.
Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Moleculaire biologie
- CRISPR-technologie
Achtergrond
- CRISPR-Cas9 is een krachtig hulpmiddel voor genoomredigering.
- Single worm PCR maakt de analyse van genetische modificaties in individuele organismen mogelijk.
- Correcte lysering en DNA-amplificatie zijn cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
- Deze methode behoudt gemodificeerde stammen voor verdere studie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor PCR-analyse van genetisch gemodificeerde wormen.
- Om de screening van CRISPR-Cas9 editing-gebeurtenissen te faciliteren.
- Om een stapsgewijze handleiding te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Zelfbevruchting van hermafrodiete wormen om genetisch identieke nakomelingen te produceren.
- Gebruik van worm-lysebuffer en temperatuurcycli voor cellyse.
- Bereiding van een PCR-mastermix met specifieke primers en Taq-polymerase.
- Thermische cycli om de doel-DNA-regio te amplificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle lyse van individuele wormen en extractie van genomisch DNA.
- Bevestigde amplificatie van doelregio's via PCR.
- Aangetoonde effectiviteit van het protocol voor het screenen van CRISPR-gebeurtenissen.
- Het leveren van een reproduceerbare methode voor toekomstige genetische studies.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is efficiënt voor PCR-analyse van enkele wormen.
- Het stelt onderzoekers in staat om effectief te screenen op genetische modificaties.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse genetische studies in C. elegans.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Single worm PCR maakt een snelle en kosteneffectieve screening van genetische modificaties in C. elegans mogelijk, wat vroege-fase validatie van targets in genetische ziektemodellen ondersteunt. Door analyse van individuele organismen mogelijk te maken, vermindert deze methode het aantal fout-positieven dat ontstaat door populatiegemiddelden en verbetert het de betrouwbaarheid van metingen van de editing-efficiëntie. Deze mogelijkheid versnelt de preklinische risicoreductie van genbewerkingsbehandelingen door kwantitatieve, reproduceerbare genotypische gegevens op grote schaal te leveren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen op resolutie van individuele organismen te onderzoeken, waardoor genotype-fenotype-koppelingen in ziekte llegado-modellen worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door on-target editing in individuele wormen te bevestigen voorafgaand aan de fenotypische beoordeling.
- Voorspellende waarde: Verbetert de portfolio-triage door nauwkeurige meting van de editing-efficiëntie, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de selectie van lead-compounds wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde lysaat-inputs die compatibel zijn met downstream PCR- en sequencingsworkflows voor high-throughput screening.
- Kwantitatieve output: Genereert amplificeerbaar genomisch DNA dat geschikt is voor allelische discriminatie en berekeningen van de bewerkings-efficiëntie.
- Schaalbaarheid: Vergemakkelijkt de preparatie van honderden individuele monsters voor parallelle verwerking in discovery-campagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Handhaaft de genetische continuïteit van bewerkte stichtingsstammen naar het nageslacht, wat longitudinale fenotypische analyse in ziekterelevante systemen ondersteunt.
- Translationele biomarker: Maakt PCR-gebaseerde genotypering mogelijk als equivalent van een companion diagnostic voor het monitoren van de persistentie van de bewerking in preklinische cohorten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Biedt de vereiste genotypische bevestiging voor go/no-go-beslissingen voordat er wordt geïnvesteerd in kostbare fenotypische assays.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het vroeg stadium van het ontdekkingscontinuüm, waarbij CRISPR-editing wordt gekoppeld aan fenotypische screening en de identificatie van lead-verbindingen via betrouwbare genotypische bevestiging.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door genetische modificaties in individuele dieren te verifiëren vóór de analyse van signaalpaden.
- Screening: Levert reproduceerbare DNA-templates voor kwantitatieve PCR, wat gestandaardiseerde vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk maakt.
- Analytica: Levert amplificeerbaar DNA voor allelkwantificering, wat bijdraagt aan de statistische evaluatie van bewerkingsresultaten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genomische modificatie aan fenotypische continuïteit door middel van het behoud van erfelijke stammen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een schaalbaar genotyperingsplatform dat toepasbaar is op meerdere C. elegans-gebaseerde ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de effectiviteit van genbewerking door ruis van mosaicisme en gemengde populaties te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en technici wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van mislukkingen in genbewerkingscampagnes mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering via objectieve metrieken voor bewerkings-efficiëntie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de moleculaire biologie met betrekking tot nucleïnezuurextractie en PCR-optimalisatie.
- Afhankelijk van toegang tot thermocyclers, PCR-reagentia en instrumenten voor de hantering van nematoden.
- Vereist standaardisatie van lysiscondities en cycling-parameters tussen teams voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij toepassing op verschillende ontwikkelingsstadia of mutante achtergronden.
- Praktische beperkingen omvatten de mogelijke overdracht van inhibitoren uit de lysisbuffer, wat downstream enzymatische reacties kan beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over biopharma
Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gelijktijdig DNA-RNA-extractie uit kustsedimenten en kwantificering van 16S rRNA genen en transcripties van Real-time PCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026