Waarom is PCR op een enkele worm belangrijk voor het toetsen van de nulhypothese bij targetvalidatie?

PCR op een enkele worm maakt directe meting van editingsgebeurtenissen in individuele organismen mogelijk, waardoor fout-positieven door populatiegemiddelden worden verminderd en de statistische kracht om de nulhypothese van geen editing-effect te verwerpen wordt vergroot.

Hoe past het isoleren van de onafhankelijke variabele (genotype) via PCR op een enkele worm in de discovery-pipeline?

Door het genotype op individueel niveau te bevestigen, isoleert de methode de genetische modificatie als de onafhankelijke variabele, waardoor fenotypische veranderingen in downstream assays nauwkeuriger kunnen worden toegeschreven.

Welke kwantitatieve afhankelijke variabelen kunnen met single worm PCR worden gemeten om de bewerkings-efficiëntie te bepalen?

De methode levert amplificeerbaar genomisch DNA op dat geschikt is voor kwantitatieve PCR of sequencing om de allelfrequentie te meten, wat een continue afhankelijke variabele oplevert voor berekeningen van de editing-efficiëntie.

Waarom zijn de replicatie-eisen bij PCR van een enkele worm belangrijk voor cross-functionele samenwerking?

Het repliceren van genotypering bij individuele wormen waarborgt de consistentie van gegevens tussen de biologische en screeningsteams, waardoor variabiliteit die werkelijke editing-effecten in collaboratieve projecten zou kunnen maskeren, wordt verminderd.

Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist voordat single worm PCR wordt geïmplementeerd in een discovery-workflow?

Implementatie vereist de mogelijkheid om binomiale of op proporties gebaseerde statistische toetsen uit te voeren op gegevens van de bewerkingsfrequentie, afgeleid van positieve/negatieve PCR-resultaten over individuele wormmonsters.

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologie

0 weergaven • 2:44 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- For single worm PCR analysis, allow a hermaphrodite worm to self fertilize and lay eggs that will produce genetically identical offspring and therefore, preserve a copy of the modified strain. Then, transfer the parent to a tube containing worm lysis buffer.

Freeze the tube at minus 80 degrees Celsius to break open the cuticle or outer layer. Heat the sample to plus 60 degrees Celsius to lyse the worm cells releasing the intracellular proteins along with the cell's genomic DNA. At this temperature, the proteinase K within the buffer degrades the proteins, particularly nucleases that would otherwise destroy the genomic DNA.

Then, raise the temperature to 95 degrees Celsius to inactivate the enzyme. Finally, add the cell lysate to a tube with a PCR master mix composed of reaction buffer, dNTPs, forward and reverse primers for the region of interest, taq polymerase, and water bringing the reaction to a desired final volume. To perform the PCR, run the appropriate thermal cycler program that amplifies the DNA region of interest.

In the following example, we will see a PCR procedure to screen for CRISPR-Cas9 editing events in the genomic DNA of single F1 worms.

- After 1 to 2 days of egg-laying, use a worm pic to transfer the F1s into individual PCR strip tube caps containing 7 microliters of warm lysis buffer. Centrifuge the PCR tubes at maximum speed and room temperature for one minute to bring the animals to the bottom of the tube. Then, freeze the tubes at negative 80 degrees Celsius for one hour.

Next, lyse frozen worms in a thermal cycler using the following program. Then, set up a PCR master mix as shown in this table.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Overzicht

Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek

Wetenschapsgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor implementatie

Veelgestelde vragen over biopharma

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in C. elegans

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Gelijktijdig DNA-RNA-extractie uit kustsedimenten en kwantificering van 16S rRNA genen en transcripties van Real-time PCR

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen