Nijlrode kleuring van C. elegans: een methode om lipidedruppels bij vaste dieren te visualiseren
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:34 min • April 30th, 2023
- When visualizing lipid droplets, the intracellular storage organelles for neutral lipids, begin by adding a detergent solution, such as one containing Triton X-100, to the sample. This will permeabilize the worm's cells. Next, fix the sample in the appropriate concentration of isopropanol, for example 40%.
Then, add Nile Red to the sample and protect it from light, since the dye is light sensitive. Fixation allows the dye to access lipid droplets throughout the animal. Nile Red is a lipophilic dye whose fluorescence emission spectrum depends on the polarity of the local lipid environment.
When exposed to polar lipids, such as phospholipids, Nile Red's emission spectrum is in the higher, red wavelengths. When exposed to neutral lipids, such as triacylglycerols and sterol esters in the neutral core of lipid droplets, Nile Red's emission spectrum shifts to the lower, yellow-gold wavelengths.
Therefore, use the green channel of a fluorescent microscope, which will collect the yellow-gold wavelength emissions, to visualize Nile Red staining of lipid droplets throughout the animal. In the example protocol, we will see a Nile Red staining procedure and imaging of lipid droplets in fixed samples.
- To carry out Nile Red lipid staining, plate worms on nematode growth medium, or NGM, seeded with late log OP50 E. coli, and grow the worms at 20 degrees Celsius to early L4 stage. Wash the worms with 1 milliliter of PBST solution and transfer the worm suspension to a 1.5 milliliter microfuge tube.
Centrifuge the worms at 560 times gravity for one minute, then remove the supernatant and repeat the PBST wash until the E. coli is cleared from the suspension. Next, to the worm pellet, add 100 microliters of 40% isopropanol, or 60% for ORO staining, and incubate the sample at room temperature for three minutes.
- The addition of isopropanol is crucial for proper permeabilization of the worms before staining.
- Centrifuge the worms at 560 times gravity for one minute and remove the supernatant without disrupting the worm pellet.
- It is important to minimize light exposure during the centrifugation steps.
- Now, while in the dark, add 600 microliters of previously prepared NR working solution to each sample. Invert the tubes three times and fully mix the worms and solution. Then incubate the sample in the dark at room temperature for two hours.
Following incubation, centrifuge the worms and remove the supernatant. Then add 600 microliters of PBST and incubate the samples in the dark for 30 minutes to remove the excess NR stain. After spinning the samples again as before, remove all but approximately 50 microliters of supernatant.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren van lipidedruppels in nematoden met behulp van Nile Red-kleuring. De methode omvat het permeabiliseren van de cellen, het fixeren van de monsters en het gebruik van fluorescentiemicroscopie om de lipidedruppels waar te nemen.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Lipidendruppels zijn intracellulaire opslagorganellen voor neutrale lipiden.
- Nile Red is een lipofiele kleurstof die wordt gebruikt voor het kleuren van lipiden.
- De fluorescentie van de kleurstof varieert afhankelijk van de lipidenomgeving.
- Juiste fixatie en permeabilisatie zijn cruciaal voor een effectieve kleuring.
Doel van de studie
- Om lipidedruppels in nematoden te visualiseren.
- Om het gebruik van Nile Red voor lipidekleuring te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van nematoden op groeimedium.
- Wassen en centrifugeren van wormmonsters.
- Fixatie met isopropanol voor permeabilisatie.
- Kleuring met Nile Red en daaropvolgende beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van lipidedruppels met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- Demonstratie van veranderingen in het emissiespectrum van Nile Red op basis van het type lipide.
- Effectiviteit van het protocol bevestigd door reproduceerbare resultaten.
- Benadrukking van het belang van het minimaliseren van lichtblootstelling tijdens de procedure.
Conclusies
- Nile Red is een effectief hulpmiddel voor de visualisatie van lipidedruppels.
- Een correcte monsterpreparatie is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
- Dit protocol kan helpen bij verdere studies naar het lipidenmetabolisme.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Nile Red-kleuring maakt de visualisatie van lipiddruppels in modelorganismen mogelijk, wat bijdraagt aan doelwitvalidatie in het onderzoek naar metabole ziekten. De methode levert kwantitatieve gegevens over de lipidendistributie, die helpen bij het mechanistisch verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door fenotypische lipideveranderingen te koppelen aan padmodulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de accumulatie van neutrale lipiden in de kernen van lipiddruppels te visualiseren.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe observatie van lipide-opslagorganellen in gefixeerde monsters.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door lipiddruppel-fenotypes te correleren met genetische interventies of verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor voor downstream screening van lipidenmodulerende verbindingen.
- Kwantitatieve output: Genereert op fluorescentie gebaseerde metingen van de lipidenovervloed voor standaardisatie van de assay.
- Schaalbaarheid: Faciliteert reproduceerbare lipidervisualisatie over meerdere monsters voor hergebruik van het platform.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Verbindt fenotypes van lipidedruppels met metabole ziektemodellen in C. elegans.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen observaties uit discovery-onderzoek en preklinische validatie van het lipidenmetabolisme.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling op basis van veranderingen in de lipideverdeling in ziekte-relevante systemen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door lipidofenotypische read-outs te leveren die informeren naar de fasen van targetvalidatie en lead-identificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen over lipidenmetabolisme-paden door directe visualisatie van lipiddruppels.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor verbindingen die de lipidenopslag beïnvloeden met gestandaardiseerde fixatie en kleuring.
- Analytica: Biedt kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen in het groene kanaal om de overvloed aan lipiden tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt veranderingen in lipiddruppels met preklinische continuïteit via geconserveerde mechanismen van het lipidenmetabolisme.
- Herbruikbaarheid op ondernemingsniveau: Vestigt een herbruikbaar platform voor lipidenvisualisatie dat toepasbaar is op meerdere nematodenstammen en condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in lipide-opslagsfenotypes te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van protocollen met vaste monsters en gecontroleerde kleurstofbehandeling.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door lipide-gebaseerde fenotypische ankers te bieden voor metabole targets.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van de effectiviteit van de modulatie van lipidedruppels.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en lipidbiologie voor een nauwkeurige spectrale interpretatie.
- Vereist instrumentatie die in staat is tot emissiedetectie in het groene kanaal om met Nile Red gekleurde neutrale lipiden te visualiseren.
- Vereist cross-team standaardisatie van fixatie, permeabilisatie en controles voor lichtblootstelling.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende modelsystemen of lipidtypen.
- Omvat praktische beperkingen zoals de lichtgevoeligheid van de kleurstof en de afhankelijkheid van een correcte fixatie van het monster voor toegankelijkheid.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van Caenorhabditis elegans Cuticle structuren met behulp van de lipofiele vitale kleurstof, DII
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Nile Red Staining: A Technique to Detect and Quantify Intracellular Neutral Lipids in Algae
Gerelateerde video's
0 Bekeken
C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026