RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:24 min • April 30th, 2023
- In C. elegans, RNAi can be induced by feeding worms bacteria that express double-stranded RNA or dsRNA from a recombinant DNA plasmid.
To begin, grow tetracycline-resistant HT115 E. coli transfected with L4440 plasmid overnight on selective LB agar plates containing tetracycline and ampicillin, or its functional analog carbenicillin. In addition to the target DNA, the plasmid contains a gene for ampicillin resistance. Only bacteria colonies that inherit the plasmid can grow in the presence of these antibiotics.
Next, harvest bacteria colonies and expand them in liquid LB medium to the desired concentration. To induce dsRNA expression, transfer the bacteria solution onto prepared nematode growth medium, or NGM, agar plates containing IPTG.
In this expression system, IPTG mimics lactose to inactivate the lac repressor enabling the expression of T7 RNA polymerase. On the plasmid, target DNA expression is regulated by two convergent T7 promoters. Consequently, sense and anti-sense sequences are transcribed leading to the expression of dsRNA.
Finally, the worm uses the sequence information from the ingested dsRNA to downregulate endogenous mRNAs with complementary sequences. In this experiment, we will prepare RNAi plates with transgenic E. coli for C. elegans feeding.
- For the RNAi plates, load 6-centimeter plates with NGM agar containing IPTG and carbenicillin. Let them dry for 24 to 48 hours at room temperature in the dark. Then, transfer them to 4 degrees Celsius for up to 14 days.
Next, streak selective plates containing carbenicillin and tetracycline with RNAi bacteria clones with L4440 plasmid carrying the lin-53 gene. Use a three-phase streaking pattern and be sure to plate an empty vector control. Then, grow the plates overnight at 37 degrees Celsius.
The next day, pick at least three single colonies and inoculate each of them into a separate culture tube with 2 milliliters of LB supplemented with carbenicillin, but not tetracycline. Plan to have three healthy cultures per condition.
Next, grow the cultures overnight at 37 degrees Celsius until they reach an optical density at 600 nanometers of 0.6 to 0.8. Then, add 500 microliters of each bacterial culture to a 6-centimeter NGM agar RNAi plate. Incubate the plates overnight at room temperature in the dark.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het induceren van RNA-interferentie (RNAi) in C. elegans met behulp van bacteriën die dubbelstrengs RNA (dsRNA) tot expressie brengen. Het protocol omvat het bereiden van RNAi-platen met transgene E. coli en het voeren hiervan aan de wormen om doel-mRNAs te downreguleren.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme dat veelvuldig wordt gebruikt in genetische studies.
- RNAi is een krachtig instrument voor gen-silencing in diverse organismen.
- Het gebruik van dsRNA kan effectief specifieke mRNA's targeten voor degradatie.
- Transgene E. coli kunnen worden ontwikkeld om dsRNA tot expressie te brengen voor voedingsexperimenten.
Doel van de studie
- Om de bereiding van RNAi-platen voor het voeden van C. elegans te demonstreren.
- Om het proces van het induceren van RNAi via bacteriële voeding te illustreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in gene silencing.
Gebruikte methoden
- Groei van tetracycline-resistente HT115 E. coli met L4440-plasmide.
- Bereiding van NGM-agarplaten met IPTG en carbenicilline.
- Uitplaten van selectieve platen met RNAi-bacterieklonen.
- Inoculatie van culturen en bereiding van RNAi-platen voor voeding.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kweek van E. coli die dsRNA tot expressie brengt.
- Bereiding van RNAi-platen die gen-silencing effectief kunnen induceren.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode voor diverse doelgenen.
- Vaststelling van een betrouwbaar protocol voor RNAi-experimenten in C. elegans.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het induceren van RNAi in C. elegans.
- Transgene E. coli kan worden gebruikt als bron van dsRNA voor voeding.
- Dit protocol kan onderzoekers ondersteunen bij het bestuderen van genfuncties via RNAi.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
RNAi-voeding bij C. elegans met behulp van gemodificeerde E. coli maakt snelle, schaalbare gen-knockdown mogelijk voor functionele genomica en targetvalidatie in de vroege ontdekkingsfase. Deze aanpak ondersteunt mechanisch de-risking door directe ondervraging van de genfunctie in de context van het gehele organisme mogelijk te maken. De methode bevindt zich op het snijvlak van targetvalidatie en assay-ontwikkeling, wat voorspellend vertrouwen biedt voor downstream screening en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematische knockdown van kandidaatgenen mogelijk om biologische pathways te verduidelijken.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door gensilencing te koppelen aan fenotypische resultaten.
- Faciliteert mechanistische de-risking door genspecifieke effecten in vivo te isoleren.
- Biedt een platform voor snelle hypothese-testen in ziekterelevante modellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op compound-screening en studies naar genetische interacties.
- Standaardiseert condities voor gene knockdown voor reproduceerbare kwantitatieve resultaten.
- Maakt schaalbare en paralleliseerbare workflows mogelijk ter voorbereiding op high-throughput screening.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten in genetisch gedefinieerde achtergronden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijkt genfunctiestudies af aan ziektemodellen voor translationeel onderzoek naar biomarkers.
- Bewaart de continuïteit van genetische ontdekking tot preklinische validatie in systemen van het gehele organisme.
- Verkleint de risico's bij beslissingen over verdere ontwikkeling door in vivo bewijs te leveren voor de relevantie van het target.
- Ondersteunt voorspellende modellering van gen-druginteracties in een hanteerbaar systeem.
Integratie van pipeline en workflow
Deze RNAi-voedingsmethode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot assayontwikkeling en preklinische modellering.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothese-gestuurde gene silencing mogelijk om de rollen van targets en biologische pathways te verduidelijken.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve gene knockdown voor robuuste assay-ontwikkeling.
- Analytiek: Levert meetbare fenotypische output voor statistische vergelijking tussen experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen genetische bevindingen en preklinische modellen voor validatie van biomarkers en targets.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Biedt een gestandaardiseerde, herbruikbare workflow voor het onderzoeken van genfuncties over meerdere programma's heen.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare protocollen voor gene knockdown.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door vroege biologische risicoreductie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van gevalideerde targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire genetica en het werken met C. elegans.
- Toegang tot infrastructuur voor bacteriële transformatie en selectieve kweek is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de bereiding van RNAi-platen en bacteriële inductie.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende genetische targets of modelstammen.
- Praktische beperkingen omvatten variabele knockdown-efficiëntie en off-target effecten.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een protocol te infecteren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode
Gerelateerde video's
0 Bekeken
RNAi-voeding in vloeibare cultuur: een methode met hoge doorvoer om genexpressie in C. elegans neer te slaan
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cell Fate Reprogramming of Nematode Germ Cells into Neurons
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Grootschalige Gene Knockdown in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026