RNAi-voeding in vloeibare cultuur: een methode met hoge doorvoer om genexpressie in C. elegans neer te slaan
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:15 min • April 30th, 2023
- To begin, add carbenicillin and one millimolar IPTG to control and test culture flasks containing S basal media. Spin a tube containing larvae at growth stage one, also called L1 larvae, for a few minutes. Now remove the supernatant and place two microliters of L1s on an agar plate. Place the plate under a dissecting microscope and count the number of larvae.
Add RNAi bacteria carrying a non-specific RNAi plasmid to the control flask and bacteria with gene- targeting RNAi to the test flask. The amount of bacteria added should be proportional to the number of worms.
Let the larvae grow with continuous shaking to ensure proper oxygenation. The larvae feed on the bacteria. Inside the larva, the small interfering RNA binds to the complementary mRNA produced by the targeted gene and inhibits protein expression. Finally, examine the worms for your phenotype of interest.
In the example protocol, we will treat L1 larvae with RNAi targeting the daf-2 gene, in liquid culture.
- To begin treatment, add 207.45 milliliters of S basal media with additional reagents as described in the accompanying text protocol to a 2,800 milliliter Fernbach culture flask. Add a final concentration of 50 micrograms per milliliter of carbenicillin and 1 millimolar of IPTG, and close the flask with a membrane screw cap.
Take the L1s out of the 25 degree Celsius incubator and transfer them to 15 milliliter tubes. Centrifuge the L1s at 1,900 times g for three minutes. After spinning, remove the supernatant. Under a microscope, count the L1s per two microliters, and average the numbers obtained from at least nine drops.
Next, add 50,000 worms for the young worm collection and 100,000 worms for the aged worm collection into four Fernbach culture flasks prepared in the previous step. Then add control RNAi bacteria and RNAi bacteria for the gene of interest proportionally to the number of worms.
After adding bacteria, complete worm culture with S basal to bring the total volume to 300 milliliters. Incubate the worm culture at 25 degrees Celsius in a shaking incubator with 150 RPM until collection.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van RNA-interferentie (RNAi) om genfuncties in L1-larven te bestuderen. De focus ligt op het targeten van het daf-2-gen om de effecten op het fenotype te observeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- RNA-interferentie is een krachtig instrument voor gene silencing.
- Het daf-2-gen staat erom bekend een rol te spelen bij de ontwikkeling en veroudering.
- L1-larven zijn een modelorganisme voor het bestuderen van genetische functies.
- Dit protocol maakt gecontroleerde experimenten met RNAi mogelijk.
Doel van de studie
- Om de effecten van gene silencing op L1-larven te onderzoeken.
- Om de rol van het daf-2-gen in de ontwikkeling te begrijpen.
- Om een gedetailleerde methodologie voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van S-basaalmedium met carbenicilline en IPTG.
- Centrifugatie van L1-larven om deze te isoleren voor experimenten.
- Tellen van larven onder een microscoop voor een nauwkeurige dosering.
- Inoculeren van culturen met RNAi-bacteriën die gericht zijn op specifieke genen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle groei van L1-larven onder gecontroleerde omstandigheden.
- Effectieve gen-silencing waargenomen na RNAi-behandeling.
- Fenotypische veranderingen vastgesteld in behandelde larven.
- Protocol gevalideerd voor toekomstige studies naar genfunctie.
Conclusies
- RNAi is een effectieve methode om de genfunctie in L1-larven te bestuderen.
- Het daf-2-gen heeft een significante invloed op de larvale ontwikkeling.
- Dit protocol kan worden aangepast voor andere genen van belang.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze high-throughput RNAi-voedingsmethode in vloeibare cultuur maakt schaalbare gene knockdown in C. elegans mogelijk, wat doelwitvalidatie en fenotypische screening in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door de doorvoer van wormen te verhogen voorbij de beperkingen van plaatgebaseerde methoden, verbetert deze aanpak de reproduceerbaarheid van assays en het voorspellende vertrouwen voor mechanistische risicoreductie van therapeutische doelwitten. Het positioneert RNAi als een schaalbare tool voor lead-identificatiepijplijnen in onderzoek naar neurodegeneratie en veroudering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genfunctie mogelijk via daf-2 knockdown om de impact op larvale ontwikkeling en verouderingsgerelateerde fenotypes te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt high-throughput screening door grotere wormpopulaties in vloeibare cultuur te behandelen in vergelijking met traditionele plaatvoeding.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fenotypische resultaten door middel van het tellen van wormen en het monitoren van de groei onder gecontroleerde vloeistofcondities.
- Operationele waarde: Standardiseert de dosering van wormen en de afgifte van bacteriële RNAi met behulp van volumetrische protocollen die proportioneel zijn aan het aantal wormen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van insulin/IGF-1-signaleringspaden die gekoppeld zijn aan levensduur en metabole stoornissen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van target hit-validatie naar mechanistische follow-up met behulp van schaalbare wormculturen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows, waarbij targetvalidatie wordt ondersteund via RNAi-gemedieerde gen-silencing, wat de overgang naar leadidentificatie mogelijk maakt via fenotypische beoordeling in C. elegans.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing door daf-2 uit te schakelen om effecten op de ontwikkeling en fenotypes van eiwitaggregatie te observeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via gestandaardiseerde wormcultuur en inoculatie met RNAi-bacteriën.
- Analytics: Maakt het mogelijk om fenotypische veranderingen te meten via larvenstelling en groeimonitoring onder gedefinieerde cultuurcondities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt daf-2-modulatie met verouderingspaden, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers in onderzoek naar levensduur.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar vloeistofcultuur-RNAi-platform dat toepasbaar is op meerdere genetische targets en screeningcampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door consistente, schaalbare gene knockdown mogelijk te maken in een genetisch hanteerbaar model.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde bereiding van media, wormtelling en proportionele dosering van RNAi-bacteriën.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het aantal fout-negatieve resultaten bij target-screening te verminderen via een hogere worm-doorvoer en uniforme blootstelling.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets door betrouwbare fenotypische gegevens te genereren uit grootschalige assays in vloeibare cultuur.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met C. elegans, RNAi-technieken en het onderhoud van vloeibare culturen.
- Afhankelijk van schudincubatoren, Fernbach-kolven en microscopie voor het tellen van larven en fenotypische beoordeling.
- Vereist standaardisatie van wormteldprotocollen en de bereiding van RNAi-bacteriën tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding van daf-2 naar andere genen van belang in verschillende genetische achtergronden.
- Bevat praktische beperkingen zoals potentiële bacteriële overgroei en beperkingen in zuurstofoverdracht in vloeibare culturen met een hoge dichtheid.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het meten van oxidatieve stress Weerstand van
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem
Gerelateerde video's
0 Bekeken
RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode
Gerelateerde video's
0 Bekeken
RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Multiwell Liquid-Based Assay for Screening C. elegans Knockdowns
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Culturing and Maintenance of RNAi-Expressing Bacteria
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Grootschalige Gene Knockdown in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026