Name: Een stap Metabolomica: Koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer een stap metabolomica voor kwantificering van koolhydraten, organische- en aminozuren met GC/MS. Deze methode verbetert neonatale screening door 38% meer erfelijke stofwisselingsziekten op te sporen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De bekwame technische bijstand van Anthony Thomas is dankbaar erkend.

Procedure voor de verwerking Urine monsters <ol><li> Ontdooi de urine monster in een 37 ° C waterbad. Giet in een nieuwe container als het origineel in het gedrang. </li><li> Neem een ​​maximale hoeveelheid van 13 ml van het monster en op te slaan bij -20 ° C in een gemerkte conische centrifugebuis. </li><li> Meet en noteer de optische dichtheid van het monster door het plaatsen van een paar druppels urine in de refractometer. </li><li> Filtreer het monster door een 0,2 um filter. </li><li> Meet het volume van het monster onder volgens de optische dichtheid <table border="0"><tbody><tr><td> 1.000-1.009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> 1.010-1.019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1.020-1.050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> De opgegeven volume is vervolgens overgebracht naar een Reactivial met de volgende interne normen: 500 nanomoles (nmol) 3 Creatine; 10 nmol d 3 methylmalonic zuur; 100 nmol elk van de volgende 13 C 3 lactaat, 13 C 3 pyruvaat, 13 C 2 15 N glycine, d 3 serine, d 5 fenylalanine, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotaat, d 4 sebacinezuur, 13 C 6 glucose, d 6 en d inositol 5 tryptofaan. </li><li> 20 microliter (ul) van een 7,5 eenheden / ul oplossing van urease (Calzyme Laboratories catalogus niet. 116A0100) wordt toegevoegd aan het monster, die vervolgens wordt gespoeld en verzegeld onder CO 2 door middel van een inert septum. </li><li> Het monster wordt gehouden op 37 ° C gedurende 30 minuten met meer kooldioxide gas toegevoegd op 15 minuten om de druk te behouden. </li><li> 20 ui meer van de urease-oplossing wordt toegevoegd, de flacon wordt gespoeld met kooldioxide, en de monster dat op 37 ° C nog 15 minuten. </li><li> 500 pi van 30:70 aceton: methanol wordt toegevoegd, het rubber septum wordt vervangen door een Teflon coating septum, en het monster wordt gekoeld tot -20 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Vaste stoffen worden verwijderd door centrifugeren bij 1500 rpm x 10 minuten daarna overgegoten in een schone 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) </li><li> Voeg triethylammonium trifluoracetaat (TEA / TFA) (Sigma) als volgt: <ul><li> 20 ui voor 1,00 ml monsters </li><li> 40 pi van 0,5 ml of minder, monsters </li></ul></li><li> Top af met acetonitril en plaats onder een stikstofstroom bij 70 ° C tot constant volume is bereikt (TEA / TFA blijft) (~ 15 minuten). </li><li> Herhaal stap 13, tot 4 keer tot een neerslag vormen (~ 10 minuten). </li><li> Laat afkoelen ongeveer 2 minuten. Top af met methyleenchloride, die voorzichtig met overkoken, en droog (~ 4:00 minuten). </li><li> Herhaal stap 15. </li><li> Voeg MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Thermal Scientific) tegen de volgende tarieven: <ul><li> 150 ul voor 1,00 ml monsters </li><li> 200 ul voor 0,50 ml of minder, monsters </li></ul></li><li> Cap onder een stikstofatmosfeer en incubeer bij 70 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Transfer naar microvaatjes, onder een atmosfeer van stikstof, voor analyse op gaschromatograaf / massaspectrometer. </li><li> Plaats microvaatjes voor geautomatiseerde injectie door de Agilent 5975 GC / MS: Instrument temperaturen zijn: injector 200 ° C, de interface 250 ° C, oven 80 ° C gedurende 1 minuut; helling bij 4 ° C / minuut 80 tot 130 ° C, oprit op 6 ° C / minuut 130-200 ° C, helling van 12 ° C / minuut 200-285 ° C, gedurende 10 minuten. Column: 25 m, 320 micron ID, 0,5 micron laagdikte DB-5. Mass Spec: bron 230 ° C, quad 150 ° C, Scan 50 tot 650 amu op 2,46 scans / sec. Oplosmiddel vertraging 3,5 minuut. </li></ol> Representatieve resultaten Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">Klik hier</a> om de representatieve resultaten te zien.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

De Metabole Screening Lab is een CLIA-licentie klinisch laboratorium in handen van Saint Louis University, een non-profit organisatie. Dr Shoemaker niet direct profiteren van het laboratorium inkomsten, maar kan indirect profiteren van het laboratorium productiviteit. Geen van de methoden, technieken, resultaten, de normale range, macro&#39;s, software, bibliotheken of conclusies worden beschouwd als eigendom en zijn vrij beschikbaar voor geïnteresseerden.

De urease methode (1) werd 62 keer geciteerd in de medische literatuur met verschillende wijzigingen. Matsumoto groep (2,3) vereenvoudigde de procedure voor het high-throughput neonatale screening en de resultaten van 16.000 patiënten. Kuhara en anderen (4-7) hebben melding gemaakt van het gebruik van de methode in diverse gevallen van aangeboren afwijking diagnose en follow-up. Rhead (8) bevestigde ook de methode hulpprogramma voor de klinische diagnose en follow-up van de aangeboren fouten. De methode is toegepast op urine van beren, knock-out muizen, olifanten en homogenaten van hele vruchten vliegen en hun larven (9). Cultuur media van Cryptococcus voor en na plaats-gerichte mutagenese werden ook geanalyseerd, zonder dat de urease stap (10). De methode is toegepast op menselijke voeding beoordeling in medische studenten, het syndroom van Down patiënten en demente bejaarden veteranen na het laden van de patiënten met orale doses van de aminozuren tryptofaan, methionine en isoleucine (11). Alle acht B-vitaminen werden beoordeeld door het kwantificeren van de afbraakproducten van de drie aminozuren die, onder hen verlangen dat elke 8 vitaminen op een bepaald punt in hun degradatie. De toxische effecten van geneesmiddelen en hun mitigatie door vitamine suppletie is gemeld (12). Vruchtwater monsters van normaal en het syndroom van Down zwangerschappen werden geanalyseerd en gerapporteerd (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computer</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computer</td></tr><tr><td>Urease</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Ook Sigma C3</td></tr><tr><td>Stabiele isotopenstandaarden</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oplosmiddelen</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-kolommen</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Vials</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

een stap metabolomica: koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Elk kind geboren in de VS is inmiddels gescreend tot 42 zeldzame genetische aandoeningen genaamd &quot;aangeboren stofwisselingsziekten&quot;. De screening methode is gebaseerd op tandem massaspectrometrie en kwantificeert acylcarnitines als een scherm voor organische acidemias en ook maatregelen aminozuren. Alle staten voeren ook enzymatische testen op koolhydraten aandoeningen zoals galactosemie. Omdat de resultaten kunnen niet-specifieke, follow-up testen van de positieve resultaten is nodig met behulp van een meer definitieve methode. Het voorliggende rapport beschrijft de &quot;urease&quot; methode van monstervoorbereiding voor aangeboren afwijking screening. Kristallijne urease enzym wordt gebruikt om ureum te verwijderen uit lichaamsvloeistoffen die het mogelijk maakt de meeste andere water oplosbare metabolieten te uitgedroogd en gederivatiseerd worden voor gaschromatografie in een enkele procedure. Onttrekken van water door verdamping in een stikstofstroom wordt vergemakkelijkt door het toevoegen van acetonitril en methyleenchloride. Dan, trimethylsilylation vindt plaats in de aanwezigheid van een unieke katalysator, triethylammonium trifluoracetaat. Geautomatiseerde injectie en chromatografie wordt gevolgd door macro-gedreven custom kwantificering van 192 metabolieten en semi-kwantificatie van elke belangrijke component met behulp van gespecialiseerde bibliotheken van massa spectra van TMS gederivatiseerd biologische verbindingen. De analyse kan worden uitgevoerd op de veelgebruikte Chemstation platform met behulp van de macro&#39;s en bibliotheken verkrijgbaar bij de auteur. In ons laboratorium hebben meer dan 16.000 patiënten monsters werden geanalyseerd met behulp van de methode met een diagnostische opbrengst van ongeveer 17% - dat wil zeggen 17% van de monsters resultaten blijkt bevindingen dat verder moet worden gehandeld door de aanvragende arts. Inbegrepen in deze zijn meer dan 180 bevestigd aangeboren fouten, waarvan ongeveer 38% niet hadden kunnen worden gediagnosticeerd met behulp van eerdere methoden.

De urease de methode van monstervoorbereiding voor GC / MS analyse van intermediaire metabolieten wordt gepresenteerd door de uitvinder ervan. De methode maakt een stap-follow-up van de pasgeboren screening op aangeboren afwijkingen door tandem massaspectrometrie door het kwantificeren van koolhydraten, organische en aminozuren allemaal in een enkel proces.

Een stap Metabolomica: Koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure

Elke baby die in de VS wordt geboren, wordt nu gescreend op maximaal 42 zeldzame genetische aandoeningen, die bekendstaan als "aangeboren stofwisselingsziekten". De screeningsmethode is gebaseerd op ...

In deze metabolomics-procedure in één stap worden biologische monsters in een enkele procedure voorbereid voor de analyse van koolhydraten, organische zuren en aminozuren middels gaschromatografie-massaspectrometrie. De monsters worden eerst behandeld met het enzym urease om ureum te verwijderen. De tweede stap van de procedure is het dehydrateren van de monsters in de aanwezigheid van een detergent bestaande uit twee vluchtige componenten, triathlon, ammonium en trifluoracetaat.Dit wordt gevolgd door derivatisering van de componenten via trimethylering. En tenslotte maakt analyse door gaschromatografie, massaspectrometrie en geautomatiseerde kwantificering van koolhydraten, organische zuren en aminozuren, waaronder glycine en aminosugars, de bevestiging en follow-up mogelijk van de meeste genetische aandoeningen die worden gevonden bij neonatale screening, en van een extra 38% van de aandoeningen waar momenteel niet op wordt gescreend via tandem-massaspectrometrie. Hallo, ik ben Jim Shoemaker van het Metabolic Screening Lab aan de St. Louis University.Ik ben hier om éénstaps metabolomics te demonstreren, een methode voor het analyseren van biologische vloeistoffen op intermediaire metabolieten zonder zuren, basen en neutrale verbindingen te scheiden. Dit maakt het mogelijk om tandem-massaspectrometrie bij neonatale screening op te volgen met een enkele procedure waarmee kan worden geanalyseerd op organische zuren, aminozuren, koolhydraten, koolhydraatderivaten en acylglycines, allemaal in één stap. Het resultaat hiervan is dat u in de grafiek achter mij kunt zien dat de diagnoses in het rood kunnen worden gesteld met behulp van éénstaps metabolomics, maar niet zouden zijn ontdekt bij de huidige neonatale screening via tandem-massaspectrometrie.Laten we beginnen met de demonstratie. Om deze procedure te starten, wordt het urine monster in een waterbad van 37 °C geplaatst. Als de oorspronkelijke container beschadigd is, wordt een monster overgegoten in een nieuwe container.Neem een aliquot van het monster en bewaar deze bij -20 °C in een gelabelde conische centrifugebuis als reserve. Meet vervolgens de optische dichtheid van het monster en noteer deze door een paar druppels urine in de handheld refractometer aan te brengen. Filter het monster na het meten van de optische dichtheid door een 0,2 micron filter.Meet het volume van het monster af op basis van de optische dichtheid die vóór de filtratie is gemeten. Gebruik één milliliter monster voor waarden tussen 1 en 1,009 en voor waarden tussen 1,01 en 1,019. Gebruik 0,5 milliliter monster, en meng voor waarden tussen 1,02 en 1,05 0,25 milliliter monster met 0,25 milliliter water.Breng het gespecificeerde volume over naar een reactiebuisje dat al de isotoop-gelabelde interne standaarden bevat zoals gespecificeerd in de hier getoonde tabel. De standaarden omvatten creatine, methylmalonzuur, lactaat, pyruvaat, glycine, sine fenylalanine, hexa oil, glycine, oraat, SEBA-zuur, glucose, inositol en tryptofaan. Voeg vervolgens 20 µL van een urease-oplossing van 7,5 units per µL toe.Spoel het monster door en sluit het af onder koolstofdioxide via een inert septum. Houd het monster 30 minuten lang op 37 °C, terwijl er om de 15 minuten extra koolstofdioxidegas wordt toegevoegd om de druk te handhaven. Voeg aan het einde van de incubatie van 30 minuten nog eens 20 µL van de urease-oplossing toe. Spoel het vial door met koolstofdioxide en houd het monster nog 15 minuten op 37 °C.Zodra de ureasebehandeling is voltooid, gaat u direct over tot het dehydrateren en derivatiseren van het monster onmiddellijk na de ureasebehandeling. Voeg 500 µL van een aceton-methanoloplossing (30 tot 70) toe aan de monsters en vervang het rubberen septum door een met Teflon gecoat septum.Koel het monster 15 minuten lang af bij -20 °C. Verwijder vaste stoffen door centrifugatie bij 1500 RPM gedurende 10 minuten en giet vervolgens het supernatant over in een schoon reactiebuisje van 2,0 CC. Voeg nu triammoniumtrifluoracetaat (TEATFA) toe, de katalysator voor trimethylering: 20 µL voor monsters van 1 mL en 40 µL voor monsters van 0,5 mL of minder.Vul aan met acetonitril en plaats onder een stroom stikstof bij 70 °C tot een constant volume is bereikt, wat aangeeft dat alleen T-E-A-T-F-A overblijft. Dit duurt ongeveer 15 minuten. Vul opnieuw aan met acetonitril en plaats onder een stroom stikstof bij 70 °C tot een constant volume is bereikt; herhaal dit tot vier keer totdat er een precipitaat wordt gevormd.Dit duurt telkens ongeveer 10 minuten na de dehydratie; laat het vervolgens ongeveer twee minuten afkoelen. Vul aan met methyleenchloride, waarbij u voorzichtig bent om overkoken te voorkomen, en droog het monster. Dit duurt ongeveer vier minuten.Vul aan met methyleenchloride en laat drogen. Herhaal dit nog een keer. Derivatiseer vervolgens het monster.Voeg 150 µL OFM, STFA toe voor monsters van 1 mL en 200 µL per 0,5 mL of minder. Sluit de monsters af onder een stikstofatmosfeer en incubeer deze gedurende één uur bij 70 °C. Werk na afloop van de incubatie van één uur onder een stikstofatmosfeer om de monsters over te brengen naar microvials voor analyse met een gaschromatograaf-massaspectrometer; hier wordt een Agilent 5975 GCMS gebruikt met een DB-5 capillaire kolom.Stel voor de massaspectrometrie de bron in op 230 °C, de quad op 150 °C en het scanmassa-bereik op 50 tot 650 A MU bij 2,46 scans per seconde. De solventvertraging is ingesteld op 3,5 minuten. De instrumenttemperaturen zijn 200 °C voor de injector en 250 °C.Stel voor de interface de oven in op 80 °C voor één minuut, verhit deze vervolgens met een snelheid van 4 °C per minuut van 80 naar 130 °C, waarna de temperatuur met 6 °C per minuut wordt verhoogd tussen 130 en 200 °C, om tot slot met 12 °C per minuut van 200 naar 285 °C te verhitten en gedurende 10 minuten vast te houden. Plaats de microvials met de deriv eye-monsters voor geautomatiseerde injectie door de GCMS en start de analyse. Hier wordt een representatief spectrum getoond van een urinemonster dat via GCMS is geanalyseerd na urease-behandeling, waarbij de pieken die overeenkomen met de metabolieten pyroglutaminezuur, 4-hydroxycycloctaanzuur en hawkinson zijn gemarkeerd.Deze metabolieten zijn indicatief voor Hawkins-anurie, een zeldzame genetische aandoening. Alle pieken in het spectrum kunnen worden toegewezen aan bekende metabolieten en gekwantificeerd worden. De resultaten van initiële hielpriktesten kunnen aspecifiek zijn.De verhoogde spiegels van Hawkins UR-metabolieten in het met GCMS geanalyseerde urine monster, zoals hier getoond, bevestigden echter de diagnose van deze aangeboren stofwisselingsziekte. Met gebruik van dezelfde URIs-methode werden aangeboren stofwisselingsstoornissen vastgesteld bij 184 patiënten. Bij bijna 40% van de in het rood weergegeven diagnoses zou de diagnose niet zijn gesteld met tandem-massaspectrometrie, zoals gebruikelijk bij neonatale screening.Dit was onze demonstratie van hoe u eenstaps metabolomics kunt uitvoeren met de urease-methode om biologische vloeistoffen te analyseren op koolhydraten, organische zuren, aminozuren en acylglycine, allemaal in dezelfde procedure. Het is belangrijk om te onthouden dat bij het evalueren van de effectiviteit van de procedure de urease-digestie, de dehydratie en de trimethylsilanisering kunnen worden beoordeeld op hun volledigheid. Dit kan simpelweg door te controleren op de aanwezigheid van alle interne standaarden.De interne standaarden zijn doelbewust gekozen om aan te tonen dat, bijvoorbeeld, de dehydratatie volledig is verlopen; als dat niet het geval was, zou het creatinine TRI TMS niet in de volledige hoeveelheid aanwezig zijn. Dat is ons bewijs. Als u geïnteresseerd bent in de macro's en bibliotheken die wij hebben ontwikkeld om deze procedure met chem station te interpreteren, stuur mij dan een e-mail naar het adres op uw scherm. Meer informatie over ons laboratorium is te vinden via de URL op uw scherm.Hartelijk dank. Dit is Jim Shoemaker.

one-step-metabolomics-carbohydrates-organic-amino-acids-quantified

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.

Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Het doel van dit artikel is een protocol voor extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse, in het bijzonder, capillaire elektroforese-massaspectrometrie te beschrijven.

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

We bouwden een ongerichte metabolomische workflow die XY-Meta en metaX samen integreerde. In dit protocol hebben we laten zien hoe we XY-Meta kunnen gebruiken om een lokspectrale bibliotheek te genereren uit open access spectrareferentie, en vervolgens FDR-controle uitgevoerd en de metaX gebruikt om de metabolieten te kwantificeren na het identificeren van de metabolomics-spectra.

Een geïntegreerde workflow van identificatie en kwantificering op FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

Leer een stap metabolomica voor kwantificering van koolhydraten, organische- en aminozuren met GC/MS. Deze methode verbetert neonatale screening door 38% meer erfelijke stofwisselingsziekten op te sporen.

Een stap Metabolomica: Koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure

Meer video's verkennen