Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:59 min • April 30th, 2023
- To prepare for the injection, use a worm pick to lay a track of halocarbon oil on an agarose pad. Place worms in the oil and immobilize them by gently pushing them onto the agar pad. Ensure the oil fully covers the animals. It allows oxygen to get to the worms while preventing desiccation. Next, place the agarose pad on an injection microscope and position the needle perpendicular to the worm, targeting the distal end of a gonad arm.
Gently push the needle through the cuticle and inject the gonad arm with the nucleic acid or compound of interest. Each gonad arm contains a germline syncytium that will develop into individual oocytes. Material injected into the distal gonad will be incorporated into those oocytes and affect the next generation.
After injecting worms, replace the oil with M9 buffer. Once the worms start moving, transfer them to an NGM agar plate with bacterial food. In the following protocol, the gonad microinjection method is used to deliver a Cas9 complex to target and edit the dpy-10 gene.
- Begin with preparation of C. elegans and agarose pads as described in the text protocol. Place an agarose injection pad and cover slip onto a dissection scope. Use a worm pick to lay a small track of halocarbon oil along one edge of the pad. Then, use the worm pick coated in oil to lift several worms off the NG agar plate and into the track of oil. With a fine hair attached to a pipette, such as an eyelash or cat whisker, position the worms in parallel gently pushing the worms into the agarose pad. Until comfortable with the microinjection procedure, only mount and inject one worm at a time.
Once in position and attached to the pad, overlay the worms with another few drops of halocarbon oil from the tip of the worm pick. Place the cover slip with the mounted worms onto the injection microscope. Under a low magnification, position the worms perpendicular to the injection needle, which has been filled with the RNP solution, as described in the text protocol.
Switch to a high magnification and reposition the needle adjacent to the gonad arm, corresponding to the region near the nuclei in mid- to late- pachytene. Using the micromanipulator, move the needle against the worm, depressing the cuticle slightly. Then, with one hand, tap the side of the microscope stage to jolt the needle through the cuticle. Depress the injection pedal or button, slowly fill to gonad arm with the injection mix, and remove the needle. Repeat the step with the other gonad arm.
Once the worms are injected, remove the coverslip in the agarose pad and place it under a dissecting microscope. Using a pulled capillary pipette, displace the oil from the worms by pipetting an M9 buffer over them. Perform this treatment to release the worms from the agar. After 10 minutes, when the worms are thrashing around in the buffer, move them to an NG agar plate with OP50 bacteria using the pulled capillary pipette. Place the plate at 20 degrees Celsius for two to three hours until the worms have recovered and are moving around. Once recovered, individually transfer the worms to NG agar plates with OP50 Then, transfer the plates to a 25 degrees Celsius incubator.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het micro-injecteren van nucleïnezuren in de gonadarmen van C. elegans. De procedure maakt genetische modificaties mogelijk die kunnen worden overgedragen aan volgende generaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme dat veelvuldig wordt gebruikt in genetische studies.
- Microinjectietechnieken maken nauwkeurige genetische modificaties mogelijk.
- De gonadarmen zijn essentieel voor de ontwikkeling van de kiemlijn.
- Het injecteren van materialen in de gonaden kan de eigenschappen van het nageslacht beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode aan te tonen voor het injecteren van genetisch materiaal in C. elegans.
- Om genbewerking met behulp van het Cas9-complex te faciliteren.
- Om een protocol te bieden dat door onderzoekers gereproduceerd kan worden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van agarosepads en halogeenkoolstofolie-strips.
- Immobilisatie van wormen voor injectie.
- Micro-injectie van nucleïnezuren in de gonadearmen.
- Herstel van wormen na injectie en overdracht naar groeischalen.
Belangrijkste resultaten
- De injectiemethode brengt het genetisch materiaal succesvol over.
- Geïnjecteerde materialen worden geïncorporeerd in ontwikkelende oocyten.
- Wormen herstellen zich en vertonen na injectie een normale beweging.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse genetische modificaties.
Conclusies
- Micro-injectie is een effectieve techniek voor genetische manipulatie in C. elegans.
- Deze methode kan het onderzoek in de genetica en ontwikkelingsbiologie bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Gonaden-microinjectie bij C. elegans maakt directe levering van verbindingen in de kiemlijn mogelijk, wat doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze methode biedt een schaalbaar, reproduceerbaar systeem voor het beoordelen van genfunctie en fenotypische resultaten, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-verbindingen en portefeuilletriage. Door overerfbare genetische modificaties te genereren, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen en vermindert het biologische ambiguïteit in translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele ondervraging van therapeutische hypothesen mogelijk via nauwkeurige kiemlijnlevering van genbewerkingscomplexen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het genereren van stabiele, overerfbare mutaties voor targetvalidatiestudies.
- Predictieve waarde: Faciliteert de beoordeling van gen-essentialiteit en betrokkenheid van signaalpaden, wat het vertrouwen in de selectie van targets vergroot.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gevalideerde genetische systemen op voor downstream fenotypische screening en evaluatie van verbindingen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de voorbereiding van wormen en de injectieprocedures, waardoor de reproduceerbaarheid over verschillende screeningscampagnes wordt verbeterd.
- Schaalbaarheid: Maakt parallelle verwerking van meerdere gonadarmen per worm mogelijk, wat de doorvoersnelheid voor assay-ontwikkeling verhoogt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Genereert ziekterelevante modellen door genen te bewerken die gekoppeld zijn aan menselijke pathologie, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van genbewerking tot fenotypische beoordeling in de context van het gehele organisme.
- Risicobeperking: Biedt vroege read-outs van effecten van targetmodulatie, wat go/no-go beslissingen bij preklinische voortgang informeert.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door hypothese-gestuurde genbewerking mogelijk te maken, wat bijdraagt aan de stadia van target-validatie en lead-identificatie. Resultaten zoals bewerkte genotypen en fenotypische readouts ondersteunen vergelijkende analyses over verschillende experimentele condities. Als herbruikbaar platform ondersteunt het de implementatie op bedrijfsniveau voor de generatie van genetische modellen en screening-gereedheid.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen en het verduidelijken van signaalpaden via gerichte gen-disruptie of -correctie.
- Screening: Levert assay-klare genetische achtergronden met gestandaardiseerde, overerfbare modificaties voor compound-screening.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve beoordeling van editing-efficiëntie, fenotypische penetrantie en generationele overerving mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische modificatie met fenotypische uitkomsten in een ziekterelevant systeem, ter ondersteuning van biomarker-afstemming.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een schaalbaar platform voor kiemlijnmodificatie dat toepasbaar is over meerdere targets en projecten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-validatie en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar genfuncties.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kiemlijnmodificatie met minimale variabiliteit tussen operators.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroege, genetisch gedefinieerde modellen van target-modulatie te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van fenotypische ernst en genetische penetrantie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van wormen, micro-injectietechnieken en kiemlijnbiologie.
- Afhankelijk van precisie-instrumentarium, waaronder injectienaalden, micromanipulatoren en met verbindingen geladen capillairen.
- Necessiteert gestandaardiseerde protocollen voor het bepalen van het wormstadium, immobilisatie en herstel na injectie.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende typen verbindingen (bijv. RNP, DNA, RNA) en injectievolumes.
- Beperkt door de gevoeligheid van de wormstam en potentiële off-target effecten die validatiecontroles vereisen.
Veelgestelde vragen over biopharma
RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo's.
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Micro-injectie van de zebravis embryo's Gene functie analyseren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026