UV-bestraling: een methode om extrachromosomale arrays te integreren
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:40 min • April 30th, 2023
- Creating extrachromosomal DNA arrays by microinjection-- the simplest method to generate transgenic worm strains-- results in genetic elements that are not stably transmitted during cell division and, therefore, exhibit variable inheritance rates and expression levels. The goal of integrating the array into a chromosome is to lessen this genetic instability and variability.
To do so, start with an age-synchronized population of L4 transgenic worms, which carry an extrachromosomal array previously introduced by microinjection and allow them to grow into gravid adults. Transfer these adults to new plates and allow them to lay eggs until there are at least 30 eggs on each plate. Remove the adults and allow the eggs to grow up until they reach the L4 stage. Then, irradiate the worms with UV light. This causes random double-strand breaks in the genomic DNA where the worms DNA repair machinery may arbitrarily incorporate the array.
After an overnight recovery period, count the number of surviving worms. A small percentage of dead worms indicates efficient irradiation. Observe subsequent generations to isolate homozygous integrated transgenic lines. In the example protocol, we will integrate a high transmission rate extrachromosomal array carrying a fluorescent co-injection marker expressed in the pharynx.
- Evaluate the transmission rate of the transgenic line to be integrated. For each transgenic line, pick 10 fluorescent gravid adults onto 10 separate culture plates under a fluorescent stereoscope. Culture the animals in a worm incubator set at a temperature permissive to reproduction of the genetic background.
Monitor the progeny each day to evaluate which developmental stage the co-injection marker is expressed and can be best observed. Using fluorescent stereoscopy, evaluate the transmission rate of the progeny by determining the percentage of fluorescent progeny. For the transgene integration, select the transgenic line with the highest transmission rate.
Obtain a population of transgenic animals synchronized at the L4 larval stage for integration. Pick 30 fluorescent gravid adults onto five culture plates. After the worms have laid eggs for three to four hours at 15 degrees Celsius, check for the presence of at least 30 eggs by plate, and then, eliminate the adults from the plates.
Culture the animals in a worm incubator until the progeny reach the L4 larval stage. Place each plate containing 15 to 20 fluorescent transgenic L4 animals in a UV crosslinker with the lids removed. Irradiate the worms.
For recovery, incubate the irradiated worms overnight at 15 degrees Celsius. Check for the number of animals that are alive. In our hands, a survival rate of around 80% to 90% is adaptive for an efficient irradiation. Grow the irradiated animals at 15 to 25 degrees Celsius until the progeny have reached the developmental stage allowing for the observation of the co-injection marker expression.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het integreren van extrachromosomale DNA-arrays in de chromosomen van transgene wormen om de genetische stabiliteit te verbeteren. Het protocol omvat micro-injectie, UV-bestraling en het monitoren van de nakomelingen op succesvolle integratie en expressie van het transgen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Genetica
- Moleculaire biologie
- Transgenetica
Achtergrond
- Extrachromosomale DNA-arrays kunnen leiden tot variabele overervingspercentages.
- Stabiele integratie in chromosomen kan de genetische stabiliteit verbeteren.
- UV-bestraling kan de incorporatie van DNA in het genoom faciliteren.
- Het monitoren van het nageslacht is essentieel voor het evalueren van de transgene expressie.
Doel van de studie
- Om extrachromosomale DNA-arrays te integreren in de chromosomen van transgene wormen.
- Om genetische instabiliteit en variabiliteit in transgene expressie te verminderen.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het genereren van stabiele transgene lijnen.
Gebruikte methoden
- Microinjectie van extrachromosomale DNA-arrays in transgene L4-wormen.
- Leeftijdssynchronisatie van wormen om een uniforme ontwikkeling te garanderen.
- UV-bestraling om dubbelstrengsbreuken te induceren voor DNA-integratie.
- Monitoring van het nageslacht op expressie van fluorescerende markers om het succes van de integratie te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle integratie van DNA-arrays werd bereikt in een klein percentage van de wormen.
- Hoge transmissiesnelheden werden waargenomen in geselecteerde transgene lijnen.
- Fluorescente markers maakten een eenvoudige identificatie van succesvolle integraties mogelijk.
- Overlevingspercentages na bestraling waren optimaal tussen 80% en 90% voor effectieve integratie.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het genereren van stabiele transgene wormstammen.
- Integratie van extrachromosomale arrays kan de genetische stabiliteit aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om andere genetische modificaties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Extrachromosomale arrays in transgene modellen leiden vaak tot variabele transgene expressie en instabiele overerving, wat fenotypische screening en workflows voor targetvalidatie bemoeilijkt. UV-geïnduceerde chromosomale integratie verbetert de genetische stabiliteit, wat betrouwbaardere transmissiesnelheden en consistente fenotypische resultaten mogelijk maakt, die essentieel zijn voor de ontwikkeling van preklinische modellen. Deze methode ondersteunt mechanistische risicoreductie door de biologische variabiliteit in transgene-gestuurde assays te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk via stabiele transgene expressie, waardoor fout-negatieven door mozaïekvorming of gesilenceerde arrays worden verminderd.
- Operationele waarde: Produceert lijnen met hoge transmissiesnelheden, waardoor de noodzaak voor herhaalde genotypering bij lineage tracking wordt geminimaliseerd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert uniforme transgene achtergronden voor reproduceerbare screening van verbindingen en dosis-responsanalyzes.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays door variaties in het kopie-aantal van de array als verstorende variabele te elimineren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt systeemmodellering relevant voor ziekten door consistente, transgene-gedreven fenotypes over generaties heen te waarborgen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale studies met voorspelbare overerving mogelijk, wat cruciaal is voor effectiviteits- en toxiciteitsprofielen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van vroege targetvalidatie tot de verfijning van preklinische modellen, waarbij een stabiele expressie van het transgen vereist is voor betrouwbare biomarker-metingen en fenotypische verankering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door isogene lijnen te leveren met consistente transgene expressie voor het onderzoeken van signaalpaden.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via uniforme genetische achtergronden die de Z'-factor en signaal-ruisverhoudingen in high-content screens verbeteren.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van de transmissiesnelheid die de selectie van lijnen informeren en variabiliteit in downstream fenotypische kwantificering verminderen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinisch werk door stabiele lijnen te vestigen die geschikt zijn voor target engagement en fenotypische anchoring-studies.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van stabiele transgene lijnen voor meerdere targets en therapeutische gebieden.
Operationele & Ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen door verminderde mechanistische ambiguïteit als gevolg van variabele transgene expressie.
- Operationele waarde: Standaardisatie en schaalbaarheid van de generatie van transgene lijnen voor gebruik in meerdere projecten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door biologische ruis in target-validatie-assays te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering via betrouwbare fenotypische gegevens uit stabiele transgene modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van wormen, microinjectie en veiligheidsprotocollen voor UV-bestraling.
- Afhankelijk van toegang tot een UV-crosslinker en fluorescente stereoscopie voor de detectie van markers.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor consistente leeftijdsynchronisatie en monitoring van het nageslacht.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten de keuze van de promotor en de zichtbaarheid van de marker in verschillende weefseltypes.
- Praktische beperkingen omvatten een lage integratie-efficiëntie, waardoor screening van grote aantallen nakomelingen noodzakelijk is om lijnen met een hoge transmissie te identificeren.
Veelgestelde vragen over biopharma
Genetische Manipulatie in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer
Gerelateerde video's
0 Bekeken
CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026