Twee-Foton Laser Axotomie: Een methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden en axonale herstel te observeren
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 weergaven • 3:24 min • April 30th, 2023
- Place embryos of interest into phenyl thiourea, PTU, Ringer's solution to inhibit pigment formation, which begins at 24 hours post fertilization. This makes the developing anatomy more visible, which is necessary for this procedure. Transfer a tricaine anaesthetized embryo into an imaging chamber. Place a glass slide on top and view it under your microscope. Focus on the axon to be injured, which is visible under a 488 nanometer laser because it transgenetically expresses GFP.
Take a before image of the site. Next, view the axon with a 910 nanometre laser which causes the GFP to fluoresce red. Increase the intensity of this laser to injure the target area without affecting the surrounding tissue. This process is called axotomy. Take a new image with the first laser to confirm the axotomy, which appears as scattered debris. In the following protocol, we will perform an axotomy of peripheral sensory axons in zebrafish embryos using a two-photon laser.
- If a custom built two-photon scope is not available in your laboratory, the Zeiss 510 confocal two-photon microscope can also be used to sever axons. We begin by placing the mounted embryo onto the stage and bringing it into focus using a 25x water objective. Next, turn on the two photon and argon lasers in a multitrack setting so that it is possible to switch from one to the other.
Although both lasers are used to detect GFP, the two photon emission is visualized with red and the argon laser emission with green in order to differentiate the two. Use the argon laser to identify an axon to injure. Under Z settings mark the first and last optical sections, take a confocal image, and create a maximum projection of the Z stack.
Turn off the argon laser and turn on the two photon laser. Scan at an intensity of about 9% transmission to make sure that the axon is still in focus. Click the Stop button so that the Crop tool will be available. Use Crop to zoom in on the area of interest. Usually we zoom to about 70x. Choose the region of the axon to be injured and bring this region into focus. The zoom can be checked under the Mode tab.
Next, under the Channels tab, change the intensity of the two photon from about 9% transmission to 15% to 30% transmission. To activate the new settings, click on the Fast XY button and then click Stop quickly afterward to avoid excess damage. The axon should be seen as scattered debris if the procedure worked. Finally, to ensure that the axon was indeed damaged, switch back to the 488 nanometer argon laser. Take another confocal image and create a maximum projection of the Z stacks.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het uitvoeren van een axotomie van perifere sensorische axonen in zebravissenembryo's met behulp van een tweefotonenlaser. De procedure verbetert de zichtbaarheid van de ontwikkelende anatomie door de pigmentvorming te remmen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Axotomie is een methode die wordt gebruikt om axonale beschadiging en regeneratie te bestuderen.
- Zebrasvisembryo's zijn een waardevol model voor ontwikkelingsstudies.
- Tweefotonmicroscopie maakt nauwkeurige targeting van axonen mogelijk.
- GFP-expressie helpt bij het visualiseren van axonen tijdens beeldvorming.
Doel van de studie
- Om de axotomietechniek in zebravissenembryo's te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
- Om het gebruik van tweefoton-lasertechnologie in neurowetenschappelijk onderzoek te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Embryo's worden behandeld met fenylthioureum om pigmentvorming te remmen.
- Twee-foton- en argonlasers worden gebruikt voor beeldvorming en axonale beschadiging.
- Confocale beeldvorming wordt uitgevoerd om axonale schade te bevestigen.
- De intensiteitinstellingen van de lasers worden aangepast om schade aan het omliggende weefsel te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- Een succesvolle axotomie wordt aangetoond door de aanwezigheid van verspreid debris.
- Afbeeldingen bevestigen de plek van de letsel voordat en na de procedure.
- Het protocol is reproduceerbaar met zowel aangepaste als standaard microscopie-opstellingen.
- Visuele differentiatie tussen laseremissies helpt bij een nauwkeurige targeting.
Conclusies
- De axotomieprocedure is effectief voor het bestuderen van axonale beschadiging bij zebravisen.
- Twee-fotonmicroscopie is een waardevolle tool voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Dit protocol kan worden aangepast voor diverse beeldsystemen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt nauwkeurige axonale beschadiging mogelijk in een levend gewervde model, wat mechanistische studies naar neurodegeneratie en herstelpaden ondersteunt. Het biedt een reproduceerbaar platform voor het evalueren van neuroprotectieve verbindingen en regeneratiefenotypen in de vroege ontdekkingsfase. De aanpak verbetert de validatie van targets door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan functionele axonale resultaten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar axonale integriteit en regeneratiemechanismen in een ziekterelevant gewervde systeem.
- Operationele waarde: Biedt een kwantificeerbaar letselmodel om de target-engagement van neuroprotectieve of pro-regeneratieve kandidaten te beoordelen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde read-outs van axonale beschadiging die geschikt zijn voor high-content screening op basis van imaging.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reproduceerbaarheid van de assay door gecontroleerde laserparameters en GFP-gebaseerde visualisatie van axonen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanistische risicoreductie door moleculaire targets te koppelen aan axonale herstelfenotypen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale tracking van herstel in hetzelfde organisme mogelijk, waardoor de variabiliteit bij de preklinische beoordeling van de effectiviteit wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om de doelwitmodulatie van axonale veerkracht te evalueren, wat beslissingen over de identificatie van lead-verbindingen informeert vóór investeringen in preklinisch onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van genen of verbindingen die axonale degeneratie en regeneratie beïnvloeden.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde metrieken voor axonale integriteit voor het profileren van verbindingenbibliotheken.
- Analytics: Maakt vergelijking van de axonale structuur voor en na letsel mogelijk via confocale microscopie en fluorescentie-intensiteit.
- Translational Research: Sluit aan bij op zebravissen gebaseerde ziektemodellen om de conservering van axonale herstelmechanismen te beoordelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor axonale beschadiging dat toepasbaar is in meerdere neurotherapeutische programma's.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door het mechanisme te koppelen aan het axonale fenotype.
- Operationele waarde: Standaardiseert de inductie van axonale beschadiging, waardoor de reproduceerbaarheid tussen teams en locaties wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico in programma's voor neurodegeneratie door vroege fenotypische risicoreductie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen op basis van axonale herstelgegevens uit een gewervgdenmodel.
Overwegingen bij de implementatie
- Expertise in lasermicroscopie en de hantering van zebravisembryo's is vereist.
- Twee-foton laser-scanning confocale microscopie met GFP-expresserende lijnen is essentieel.
- Standaardisatie van de laserintensiteit en belichtingsparameters waarborgt een consistente beschadiging over de experimenten heen.
- Aanpassing aan verschillende axonale typen kan selectie van transgene lijnen en aanpassing van de beelduitsnijdingsdiepte vereisen.
- Pigmentinhibitie via PTU is noodzakelijk voor een optimale visualisatie in gepigmenteerde embryo's.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo's
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee-Foton Laser-Geïnduceerde Neurale Verwonding: Een Methode om Axon Degeneratie en Regeneratie in Drosophila Larven te observeren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Monitoring Recovery of Laser-Ablated Interneuromast Cells in Zebrafish Using Confocal Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Selective Single-Neuron Laser Ablation in a Zebrafish Larva Using a Confocal Microscope
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Targeted Neuronal Ablation Using Two-Photon Microscopy in a Zebrafish Larava
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026