Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van muizenbreinweefsel voor immuno-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door het brein eerst te fixeren via perfusie van het dier. De tweede stap van de procedure bestaat uit het snijden van het brein en het verwerken van de coupes voor immunohistochemie.

De derde stap van de procedure is het fixeren, dehydrateren en inbedden van de coupes. De laatste stap van de procedure is het snijden van ultradunne coupes. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die met een hoge ruimtelijke resolutie de distributie van verschillende eiwitten binnen diverse regio's en celtypen van het centrale zenuwstelsel laten zien.

Hoi, ik ben Maria Trombley van het Laboratory of Esca van de Department of Neurobiology and Anatomy aan de University of Rochester. Vandaag laten we u een procedure zien voor de preparatie van muizenhersenweefsel voor immuno-elektronenmicroscopie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om interacties tussen microglia en synapsen te bestuderen tijdens de ontwikkeling, ervaringsafhankelijke plasticiteit en veroudering.

Laten we beginnen. Nadat de muizenhersenen zijn gefixeerd via intracardiale perfusie, worden deze nogmaals gefixeerd in ongeveer 10 milliliter formaldehyde bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Was de hersenen in 1X PBS bij vier graden Celsius drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt met behulp van een vibrator en ijskoud 1X PBS; snijd de hersenen vervolgens onmiddellijk in transversale secties van 50 micron.

Gebruik een fijne penseel om geselecteerde coupes over te brengen naar een glazen flesje gevuld met 4 °C 1×PBS. Bewaar de resterende coupes in cryoprotectant bij -20 °C voor maximaal enkele jaren zonder kwaliteitsverlies. Verwerk maximaal 10 vrij zwevende coupes voor kleuring in elk glazen flesje.

Gebruik een transferpipet om de XPBS te vervangen door verse 0,1% natriumborohydride in PBS; vervang de oplossingen snel om te voorkomen dat de coupes uitdrogen. Incubeer gedurende 30 minuten en spoel de coupes 3 keer af met XPBS gedurende telkens 10 minuten. Zorg ervoor dat alle luchtbellen worden verwijderd en voeg XPBS toe die 0,5% gelatine en 5% normaal serum bevat, passend bij het secundaire antilichaam dat zal worden gebruikt.

Incubeer gedurende twee uur. Voeg het primaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing. Incubeer gedurende 48 uur.

Spoel drie keer gedurende 10 minuten met één XPBS. Incubeer vervolgens twee uur met biotinyl-geconjugeerd secundair antilichaam, verdund in blokkeringsoplossing. Spoel zoals voorheen drie keer gedurende 10 minuten met één XPBS.

Incubeer gedurende één uur met streptavidine-mierikwortelperoxidase verdund in blokkeringsoplossing. Spoel de coupes één keer met één XPBS en twee keer met één XTBS gedurende telkens 10 minuten. Om de labeling zichtbaar te maken, worden de coupes geïncubeerd met een vers bereide oplossing bestaande uit 0,05% dab en 0,01% waterstofperoxide in één XTBS.

Wanneer de kleuring zichtbaar donkerbruin is of de reactie vijf minuten heeft geduurd, spoel de coupes dan met one XTBS om de reactie te stoppen. Spoel vervolgens eenmaal met one XTBS en tweemaal met one x PB gedurende elk 10 minuten. Gebruik in een zuurkast een fijn penseel om de coupes over te brengen naar een multi-well kweekplaat gevuld met one XPB.

Verwijder de PB uit één put met een fijn penseel om de coupes onmiddellijk plat uit te spreiden. Voeg een oplossing van 1% osmiumtetroxide in eenvoudig PB toe voordat u doorgaat naar de volgende put; laat dit bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten incuberen. Breng de OSM-coupes over naar glazen vials.

Spoel drie keer 10 minuten met XPB. Dehydrateer de coupes in oplossingen van ethanol met een toenemende concentratie. Gebruik vervolgens propyleenoxide zoals beschreven in het tekstgedeelte van dit protocol.

Gebruik een fijn penseel, gespoeld in propyleenoxide, om de coupes over te brengen naar vers bereide dupant-hars. Voor impregnatie gedurende de nacht plaatst u de schaal met de coupes gedurende 10 minuten in een oven van 55 °C. Om de hars te verzachten, gebruikt u een met propyleenoxide gespoeld penseel om een chlor-inbedfilm te voorzien van een dunne laag hars.

Breng de sectie over op de film en dek deze gelijkmatig af met een andere inbedfilm. Verdeel gewichtjes van ongeveer twee gram over de bovenkant om de verspreiding van de hars te bevorderen. Laat de hars 48 tot 72 uur polymeriseren bij 55 °C in een incubator. Verwijder na polymerisatie de gewichtjes van de bovenste laag van de inbedfilm onder een binoculair microscoop.

Select interessegebieden van twee bij twee millimeter en gebruik een scheermesje om deze uit de film te snijden. Plak de interessegebieden met secondelijm op de uiteinden van harsblokjes. Laat deze één uur uitharden in een incubator van 55 °C.

Gebruik een scheermesje om het harsblok bij te trimmen tot de vorm van een gelijkbenige trapezoïde, de optimale vorm voor ultradunne vacuümsnijden. Gebruik een microtoom en een glazen mes om de lijm aan het weefseloppervlak te verwijderen om een vlak oppervlak te verkrijgen voor vacuümsnijden.

Vul het reservoir van het glazen mes met dubbel gedestilleerd water en snijd enkele secties van tussen 0,5 en één micron. Gebruik een perfect loop om de secties over te brengen naar een super frost objectglas. Droog deze gedurende één minuut op een warmteplaat van 80 °C en kleur ze vervolgens één minuut lang met 0,1% toluidineblauw.

Gebruik een spuitfles om het overtollige kleuringsmiddel weg te spoelen met dubbel gedestilleerd water. Onder een lichtmicroscoop worden de coupes onderzocht om het gekleurde weefsel van de hars te onderscheiden. Snijd semi-dunne coupes totdat de grens tussen het weefsel en de hars ongeveer het midden van de coupe bereikt. Vervang het glazen mes door een diamantmes en vul het bootje met dubbel gedestilleerd water.

Snijd het zilver tot ultra-dunne secties. Maak secties met een dikte van 60 tot 80 nanometer. Gebruik fijne omgekeerde pincetten om de secties zorgvuldig op koperen rasterroosters te verzamelen.

Droog de grids op filterpapier om het contrast te verbeteren. Gebruik fijne omgekeerde pincetten om een grid gedurende twee minuten in een druppel loodcitraat te plaatsen. Spoel het grid voorzichtig af door het achtereenvolgens in drie baden van dubbel gedestilleerd water te dompelen.

Droog het raster op filterpapier en bewaar het in een rasterdoos voor latere analyse met de elektronenmicroscoop. Onderzoek de rasters met de elektronenmicroscoop om zowel de immunokleuring als de morfologie van cellulaire elementen te visualiseren, waaronder intracellulaire organellen en hun onderlinge relaties.

Hier wordt een representatieve immunokleuring voor IBA one getoond op lichtmicroscopisch niveau. De cellulaire distributie van IBA one is beperkt tot microglia, wat de specificiteit ervan op elektronmicroscopisch niveau bevestigt. IBA one-immunogekleurde microgliale pericarya en uitlopers zijn zichtbaar.

De immunoperoxidase DAB-kleuring verschijnt als een elektronendicht precipitaat. Andere voorbeelden van immunogekleurde IBA1-microgliale processen vertonen verschillende groottes en vormen. Een hogere vergroting onthult diverse intracellulaire organellen binnen één van de microgliale processen en ook de ultrastructurele relaties tussen een ander microgliaal proces en nabijgelegen elementen van het neuropil, inclusief synapsen.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u muizenbreinweefsel kunt prepareren voor immuno-elektronenmicroscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen strikt te volgen en het hersenweefsel voorzichtig te behandelen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.