Name: Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer hersenweefsel van muizen voorbereiden voor immuno-elektronenmicroscopie met behulp van transcardiale perfusie en immunoperoxidase-kleuring. Deze methode maakt gedetailleerde visualisatie van eiwitverdeling in het centrale zenuwstelsel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Shao-Ming Lu en Harris A. Gelbard voor het gebruik van een peristaltische pomp en vibratome, evenals Karen L. Bentley en Gayle Schneider op de Electron Microscope Onderzoek Core Facility van de Universiteit van Rochester Medical Center voor technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund, en de Alfred P. Sloan Foundation om AKM. M.-È.T. wordt gefinancierd door een Fonds de la recherche en sante du Quebec (FRSQ) post-doctorale opleiding award.

1. Dier perfusie <ol><li> Op de dag voor perfusie, voor te bereiden: - 2 L van fosfaatbuffer (PB, 100 mM, pH 7,4) en een L van natrium fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl in 50 mM PB, pH 7,4) in dubbel gedistilleerd water. Bewaar de PBS en 1L van PB bij 4 ° C. Deze zullen worden gebruikt voor perfusie en pre-inbedding immunocytochemie. - 1L van 4,0% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4) fixatief oplossing, die de doorbloeding van 6 muizen in staat zal stellen. Voor dat doel, warmen een L van PB in een zuurkast. Weeg 40 g van granulaire paraformaldehyde (PFA) en giet in de PB-oplossing bij het bereiken van 60 ° C. Wanneer de oplossing helder is, met de PFA volledig is opgelost, afkoelen tot kamertemperatuur (RT) en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Op de dag van perfusie, voor te bereiden 500 ml van 3,5% acroleïne oplossing in PB onder een zuurkast. Dan, filter de 3,5% acroleïne en 4,0% PFA oplossingen met behulp van papieren filter. </li><li> Voor muis anesthesie, injecteren natriumpentobarbital (80 mg / kg) in het peritoneum van een 27 gauge ½ "naald. </li><li> Tijdens de perfusie, 50 ml PBS, wordt 75 ml van acroleïne, en 150 ml PFA achtereenvolgens overgaan in de muis circulatie. Voor het instellen van de peristaltische pomp, vul de buis met PBS en vast een 23 gauge ¾ "vlindernaald aan een kant. Dompel het andere uiteinde van de slang in de perfusie-oplossing (PBS, acroleïne of PFA). Stel de snelheid van de peristaltische pomp tot 20-25 ml / min voor jeugdige en volwassen muizen. Gedurende de perfusie, zorgvuldig alle luchtbellen vormen in de slang te voorkomen. </li><li> Wacht tot de verdoofd muis niet meer reageert op pijnprikkels, zoals een staart knijpen, voordat u verder gaat. Leg het dier in een dissectie lade en bevestig de poten met behulp van tape. Met een pincet en schaar, het openstellen van de huid en borstkas naar het hart bloot te leggen. Te minimaliseren hersenen ischemie, de perfusie moet snel worden gestart. Opengesneden de rechter atrium met een klein schaartje en start de peristaltische pomp. Terwijl het hart met een pincet, steek de vlinder naald in de apex van de linker hartkamer. </li><li> Bij het wijzigen van oplossing, stop de peristaltische pomp, overdracht van de slang van een oplossing naar de andere, en onmiddellijk start de pomp. </li><li> Wanneer 150 ml PFA is verstreken, stopt de peristaltische pomp. Met behulp van kleine schaar, sneed het hoofd, het openstellen van de huid, en breken de schedel tussen de ogen. Met behulp van kleine pincet voorzichtig chip uit kleine stukjes van de schedel tot aan de hersenen kan gemakkelijk worden verwijderd. De hersenen voor 2 uur na de vast te stellen op 4 ° C in PFA. Was drie keer 10 minuten in PBS. </li><li> Onmiddellijk snijd de hersenen in dwarsrichting (50 pm dik secties) in ijs gekoeld met behulp van een PBS vibratome. Met een fijn penseel, transfer secties geselecteerd voor immunocytochemie in een glazen flacon met PBS. Bewaar de overige secties bij -20 ° C in cryoprotectant (30% ethyleenglycol en 30% glycerol in PBS) tot enkele jaren. </li></ol> 2. Pre-inbedding immunocytochemie <ol><li> Voor immunocytochemie, zijn artikelen zijn verwerkt vrij zwevend in glazen flesjes. Tijdens de gehele procedure, moet men zorgvuldig te vermijden dat delen uitdrogen. </li><li> Verwijder eerst de PBS met behulp van een overdracht pipet en onmiddellijk vervangen door een verse oplossing van 0,1% natriumboorhydride in PBS gedurende 30 minuten bij RT. </li><li> Spoel secties met PBS 3 maal 10 minuten, het verwijderen van alle bubbels, en incubeer gedurende 2 uur bij RT in een blokkerende oplossing van PBS met 0,5% gelatine en 5% normaal serum van het dier waarbij het secundaire antilichaam werd gegenereerd (normaal geit serum in de huidige voorbeeld van Iba1-immunokleuring). </li><li> Incubeer gedurende 48 uur met primaire antilichaam in het blokkeren van oplossing. Voor Iba1-immunokleuring, gebruik van konijnen anti-Iba1 antilichaam (1:1000). </li><li> Spoel secties met PBS 3 keer 10 minuten en incubeer in het secundair antilichaam geconjugeerd aan biotine (1:1000) in het blokkeren oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Voor Iba1-immunokleuring, gebruik van geit anti-konijn IgGs. </li><li> Spoel secties met PBS 3 keer 10 minuten en incubeer in streptavidine-mierikswortelperoxidase (1:1000) in het blokkeren oplossing gedurende 1 uur bij RT. </li><li> Spoel secties met PBS 10 minuten en met Tris / HCl gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM, pH 7,4) 2 maal 10 minuten. Te onthullen op het etiket, incubeer secties met 0,05% DAB en 0,01% waterstofperoxide in TBS (oplossing vers bereid). Als de kleuring is donker-bruin (zie voorbeeld in Figuur 1), stop de reactie door spoelen in TBS. In ieder geval, het einde van de reactie na een maximum van 5 minuten. Spoel delen met TBS 10 minuten en met PB 2 maal 10 minuten. </li></ol> 3. Verwerking voor elektronenmicroscopie <ol><li> Overdracht secties in PB in een multiwell cultuur plaat met een fijne borstel. Bereid 1% osmium tetroxide oplossing in PB onder een rokende motorkap. Verwijder PB uit de bronnen van de cultuur plaat en verspreiden de secties plat met een fijne borstel. Onmiddellijk onder te dompelen secties in 1% osmium gedurende 30 minuten bij RT. </li><li> Breng de onderdelen in glazen flesjes, spoelen met PB 3 maal 10 minuten, en uitdrogen door middel van 2 minuten onderdompelen in oplopende concentraties van ethanol: 2 keer 35%, 1 keer elk van de 50%, 70%, 80%, 90%, en 95 %, 3 maal 100%, gevolgd door 3 keer propyleenoxide. </li><li> Ter voorbereiding van de Durcupan hars, combineren 20 g van de component A, 20 g van de component B, 0,6 g onderdeel C, en 0,4 g van de component D in een wegwerp beker, meng goed tot de kleur wordt uniform, en giet het in een aluminium wegen schotel. Indien nodig, kan hars blokken worden voorbereid door het gieten van hars in mallen inbedding en uitharding in een 55 ° C oven voor 48-72 uur. </li><li> Met behulp van een fijn penseel gespoeld met propyleenoxide, de secties van de propyleenoxide en dompel 's nachts te verwijderen in de Durcupan impregnatiehars voor bij RT. </li><li> De volgende dag, zet de aluminium wegen schotel in een 55 ° C oven gedurende 10 minuten om de hars te verzachten. Met behulp van een borstel gespoeld met propyleenoxide, jas een Aclar inbedding film met een dun laagje van de hars, ging de secties, te dekken met een andere inbedding film, en gelijkmatig lichte gewichten (ongeveer 2 g, bijvoorbeeld de plastic doppen van de glazen flacons) verspreiden op de top te helpen hars verspreiden. Voor hars polymerisatie, incuberen in de oven gedurende 48-72 uur (bij 55 ° C). </li><li> Na de polymerisatie, verwijder de lichte gewichten en inbedding film op de top van de secties. Onder een binoculaire microscoop, selecteer vierkante gebieden van belang (ongeveer 2x2 mm) en zorgvuldig accijnzen ze uit de film met behulp van een scheermesje. </li><li> Lijm op het gebied van de belangstelling op het puntje van de hars met behulp van blokken Superglue en genezing in de 55 ° C oven gedurende 1 uur. </li><li> Ter voorbereiding op het snijden, trim de hars blok naar de vorm van een gelijkbenige trapezium met een scheermesje. </li><li> Met behulp van een ultramicrotoom en een glas mes, verwijder de lijm en hars aan het oppervlak van het weefsel. Vul de boot van het glas mes met dubbel gedestilleerd water en snij een paar semi-dunne secties (0,5-1 micrometer dik). </li><li> Overdracht van de sectie om een ​​SuperFrost dia met een perfecte loop. Droog de onderdelen door het plaatsen van de dia op een verwarmingsplaat bij 80 ° C gedurende 1 minuut. Dek af met een paar druppels van 0,1% toluïdineblauw vlek (2 g natriumboraat en 0,2 g toluïdineblauw in 200 ml dubbel gedestilleerd water) gedurende 1 minuut. Spoel de overtollige vlek met tweemaal gedestilleerd water. Onderzoek van de secties met een lichtmicroscoop zal toelaten om het gekleurde weefsel te onderscheiden van de hars (figuur 2). </li><li> Hervatten snijden tot aan de grens tussen weefsel en hars bereikt het midden van de secties. Merk op dat de volgende procedure opleiding vereist. Vervang het glas mes met een diamanten mes en vul de boot met tweemaal gedestilleerd water. Gesneden zilver naar zilver-goud ultradunne secties (60-80 nm dik) en zorgvuldig te verzamelen over kopergaas roosters met fijne omgekeerde pincet. Droog de roosters op een papieren filter. </li><li> Om het contrast te verbeteren, kan ultradunne secties worden gekleurd met lood citraat (0,03 g lood citraat en 0,1 mL 10N natriumhydroxide in 10 ml dubbel gedestilleerd water 1). Met behulp van fijne omgekeerde pincet, overdracht een rooster tot een daling van lood citraat gedurende 2 minuten. Verwijder het rooster en delicaat spoelen in drie opeenvolgende baden van dubbel gedestilleerd water. Ten slotte, droog de roosters op een filtreerpapier en bewaar ze in een raster doos tot elektronen microscopisch onderzoek (figuren 3-6). </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Iba1-gekleurde sectie aan het licht microscopisch niveau. De cellulaire distributie van Iba1 is beperkt tot microglia, die de specificiteit van de immunokleuring shows. Schaalbalk = 100 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Toluidine blauw-gekleurde semi-dunne gedeelte aan het licht microscopisch niveau. Let op de grens tussen weefsel en hars, waar de immunokleuring zullen de meeste intense verschijnen op de elektronenmicroscoop. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Ultradunne sectie toont Iba1-immunopositive microgliale perikaryon en processen op het elektron microscopisch niveau. Iba1-positieve structurele elementen zijn te herkennen aan hun immunoperoxidase-DAB electron-dense neerslag. Schaalbalk = 2 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Ultradunne sectie tonen Iba1-immunopositive microgliale processen van verschillende maten en vormen op het elektron microscopisch niveau. Schaalbalk = 2 micrometer. e 5 "/&gt; Figuur 5. Ultradunne sectie toont bij hogere vergroting een Iba1-positieve microgliale proces van figuur 4, zodat de identificatie van de intracellulaire organellen. Schaal bar = 1 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Ultradunne sectie onthullende bij hogere vergroting van de ultrastructurele relaties tussen een Iba1-positieve microgliale proces en nabijgelegen elementen van neuropil waaronder synapsen. Schaalbalk = 1 uM.

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

Hier hebben we beschreven een protocol voor de voorbereiding van de hersenen van muizen weefsel voor immunoelectron microscopie, dat een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie, wanneer de procedures zorgvuldig worden uitgevoerd biedt. In combinatie met TEM, deze methode maakt het mogelijk om onderscheid te maken cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria. Met name de immunoperoxidase-DAB kleuring v...

<table><tbody><tr><td>Natriumpentobarbital (Nembutal)</td><td>OVATION Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier 315 24 cm</td><td>VWR international</td><td>28331-081</td><td></td></tr><tr><td>*Acrolein purum (&amp;#8805;95%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01680</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborohydride (&amp;#8805;98%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452173</td><td></td></tr><tr><td>*Gegranuleerd paraformaldehyde (PFA) (95%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-Iba1 primair antilichaam</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>019-19741</td><td>Bewaard bij -20&amp;#x00B0;C, 1:1 in glycerol</td></tr><tr><td>Biotine-SP-geconjugeerd AffiniPure F(ab&amp;rsquo;)2 fragment geit anti-konijn IgG, Fc-fragment specifiek</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-066-046</td><td>Bewaard bij -20&amp;#x00B0;C, 1:1 in glycerol</td></tr><tr><td>Peroxidase-geconjugeerde streptavidine</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-030-084</td><td>Bewaard bij -20&amp;#x00B0;C, 1:1 in glycerol</td></tr><tr><td>*Osmiumtetroxide 4% oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td>Lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Propyleenoxide (&amp;#8805;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82325</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen wegwerpbekers (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-291-10</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium weegschaaltjes (70 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9261784</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoxyhars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Inbedmal</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>DPX monteermiddel voor histologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine-gecoate objectglazen</td><td>VWR international</td><td>100241-864</td><td></td></tr><tr><td>ACLAR inbedfilms (7,8 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425</td><td></td></tr><tr><td>Capsulemal</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70150</td><td></td></tr><tr><td>Hoogwaardige secondelijm</td><td>Corporate Express</td><td>LOC30379</td><td></td></tr><tr><td>Perfect loop voor ultradunne secties</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost objectglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Diamanten mes ultra 45&amp;#x00B0; (2,5-3,5 mm)</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatine van koudwatervis-huid (~45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">*Men dient altijd onder een zuurkast te werken en nitrilhandschoenen te dragen bij het hanteren van acroleïne, paraformaldehyde en osmium, en het afval hiervan dient correct te worden afgevoerd.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de muis hersenweefsel voor immunoelectron microscopie

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) is uiterst nuttig voor het visualiseren van microglia, oligodendrocytic, astrocytaire, en neuronale subcellulaire compartimenten (dendriet, dendritische wervelkolom, axon, axon terminal, perikaryon), evenals hun intracellulaire organellen en cytoskelet, in het centrale zenuwstelsel bij hoge ruimtelijke resolutie. In combinatie met TEM, pre-embedding immunocytochemie kan de discriminatie van cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria (bv. microgliale perikarya en processen, bij het gebruik van een antilichaam tegen de microglia-specifieke marker Iba1 (geïoniseerd calcium binding adapter molecuul 1; zoals gepresenteerd hier)), het identificeren van de neurotransmitter inhoud van cellulaire elementen (bijvoorbeeld serotonine) en hun ultrastructurele lokalisatie van oplosbare of membraan-gebonden eiwitten (bijv. 5 HT1A en EphA4 receptoren). We beschrijven hier een protocol voor transcardiac perfusie van muizen met acroleïne fixatief, verwijdering en snijden van de hersenen, evenals immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) kleuring, hars inbedding, en de ultradunne snijden van de hersenen secties. Na voltooiing van deze procedures, de immunostained materiaal klaar is voor onderzoek met TEM. Bij het rigoureus uitgevoerd, deze techniek biedt een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie.

Wij beschrijven een protocol voor transcardiale perfusie van muizen, het verwijderen en doorsnijden van de hersenen, evenals immunoperoxidasekleuring, inbedding in hars en ultradunne doorsneden van de hersencoupjes. Na voltooiing van deze procedures is het immuungekleurde materiaal klaar voor onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie.

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is bijzonder nuttig voor het visualiseren van subcellulaire compartimenten van microglia, oligodendrocyten, astrocyten en neuronen ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van muizenbreinweefsel voor immuno-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door het brein eerst te fixeren via perfusie van het dier. De tweede stap van de procedure bestaat uit het snijden van het brein en het verwerken van de coupes voor immunohistochemie.De derde stap van de procedure is het fixeren, dehydrateren en inbedden van de coupes. De laatste stap van de procedure is het snijden van ultradunne coupes. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die met een hoge ruimtelijke resolutie de distributie van verschillende eiwitten binnen diverse regio's en celtypen van het centrale zenuwstelsel laten zien.Hoi, ik ben Maria Trombley van het Laboratory of Esca van de Department of Neurobiology and Anatomy aan de University of Rochester. Vandaag laten we u een procedure zien voor de preparatie van muizenhersenweefsel voor immuno-elektronenmicroscopie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om interacties tussen microglia en synapsen te bestuderen tijdens de ontwikkeling, ervaringsafhankelijke plasticiteit en veroudering.Laten we beginnen. Nadat de muizenhersenen zijn gefixeerd via intracardiale perfusie, worden deze nogmaals gefixeerd in ongeveer 10 milliliter formaldehyde bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Was de hersenen in 1X PBS bij vier graden Celsius drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt met behulp van een vibrator en ijskoud 1X PBS; snijd de hersenen vervolgens onmiddellijk in transversale secties van 50 micron.Gebruik een fijne penseel om geselecteerde coupes over te brengen naar een glazen flesje gevuld met 4 °C 1×PBS. Bewaar de resterende coupes in cryoprotectant bij -20 °C voor maximaal enkele jaren zonder kwaliteitsverlies. Verwerk maximaal 10 vrij zwevende coupes voor kleuring in elk glazen flesje.Gebruik een transferpipet om de XPBS te vervangen door verse 0,1% natriumborohydride in PBS; vervang de oplossingen snel om te voorkomen dat de coupes uitdrogen. Incubeer gedurende 30 minuten en spoel de coupes 3 keer af met XPBS gedurende telkens 10 minuten. Zorg ervoor dat alle luchtbellen worden verwijderd en voeg XPBS toe die 0,5% gelatine en 5% normaal serum bevat, passend bij het secundaire antilichaam dat zal worden gebruikt.Incubeer gedurende twee uur. Voeg het primaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing. Incubeer gedurende 48 uur.Spoel drie keer gedurende 10 minuten met één XPBS. Incubeer vervolgens twee uur met biotinyl-geconjugeerd secundair antilichaam, verdund in blokkeringsoplossing. Spoel zoals voorheen drie keer gedurende 10 minuten met één XPBS.Incubeer gedurende één uur met streptavidine-mierikwortelperoxidase verdund in blokkeringsoplossing. Spoel de coupes één keer met één XPBS en twee keer met één XTBS gedurende telkens 10 minuten. Om de labeling zichtbaar te maken, worden de coupes geïncubeerd met een vers bereide oplossing bestaande uit 0,05% dab en 0,01% waterstofperoxide in één XTBS.Wanneer de kleuring zichtbaar donkerbruin is of de reactie vijf minuten heeft geduurd, spoel de coupes dan met one XTBS om de reactie te stoppen. Spoel vervolgens eenmaal met one XTBS en tweemaal met one x PB gedurende elk 10 minuten. Gebruik in een zuurkast een fijn penseel om de coupes over te brengen naar een multi-well kweekplaat gevuld met one XPB.Verwijder de PB uit één put met een fijn penseel om de coupes onmiddellijk plat uit te spreiden. Voeg een oplossing van 1% osmiumtetroxide in eenvoudig PB toe voordat u doorgaat naar de volgende put; laat dit bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten incuberen. Breng de OSM-coupes over naar glazen vials.Spoel drie keer 10 minuten met XPB. Dehydrateer de coupes in oplossingen van ethanol met een toenemende concentratie. Gebruik vervolgens propyleenoxide zoals beschreven in het tekstgedeelte van dit protocol.Gebruik een fijn penseel, gespoeld in propyleenoxide, om de coupes over te brengen naar vers bereide dupant-hars. Voor impregnatie gedurende de nacht plaatst u de schaal met de coupes gedurende 10 minuten in een oven van 55 °C. Om de hars te verzachten, gebruikt u een met propyleenoxide gespoeld penseel om een chlor-inbedfilm te voorzien van een dunne laag hars.Breng de sectie over op de film en dek deze gelijkmatig af met een andere inbedfilm. Verdeel gewichtjes van ongeveer twee gram over de bovenkant om de verspreiding van de hars te bevorderen. Laat de hars 48 tot 72 uur polymeriseren bij 55 °C in een incubator. Verwijder na polymerisatie de gewichtjes van de bovenste laag van de inbedfilm onder een binoculair microscoop.Select interessegebieden van twee bij twee millimeter en gebruik een scheermesje om deze uit de film te snijden. Plak de interessegebieden met secondelijm op de uiteinden van harsblokjes. Laat deze één uur uitharden in een incubator van 55 °C.Gebruik een scheermesje om het harsblok bij te trimmen tot de vorm van een gelijkbenige trapezoïde, de optimale vorm voor ultradunne vacuümsnijden. Gebruik een microtoom en een glazen mes om de lijm aan het weefseloppervlak te verwijderen om een vlak oppervlak te verkrijgen voor vacuümsnijden.Vul het reservoir van het glazen mes met dubbel gedestilleerd water en snijd enkele secties van tussen 0,5 en één micron. Gebruik een perfect loop om de secties over te brengen naar een super frost objectglas. Droog deze gedurende één minuut op een warmteplaat van 80 °C en kleur ze vervolgens één minuut lang met 0,1% toluidineblauw.Gebruik een spuitfles om het overtollige kleuringsmiddel weg te spoelen met dubbel gedestilleerd water. Onder een lichtmicroscoop worden de coupes onderzocht om het gekleurde weefsel van de hars te onderscheiden. Snijd semi-dunne coupes totdat de grens tussen het weefsel en de hars ongeveer het midden van de coupe bereikt. Vervang het glazen mes door een diamantmes en vul het bootje met dubbel gedestilleerd water.Snijd het zilver tot ultra-dunne secties. Maak secties met een dikte van 60 tot 80 nanometer. Gebruik fijne omgekeerde pincetten om de secties zorgvuldig op koperen rasterroosters te verzamelen.Droog de grids op filterpapier om het contrast te verbeteren. Gebruik fijne omgekeerde pincetten om een grid gedurende twee minuten in een druppel loodcitraat te plaatsen. Spoel het grid voorzichtig af door het achtereenvolgens in drie baden van dubbel gedestilleerd water te dompelen.Droog het raster op filterpapier en bewaar het in een rasterdoos voor latere analyse met de elektronenmicroscoop. Onderzoek de rasters met de elektronenmicroscoop om zowel de immunokleuring als de morfologie van cellulaire elementen te visualiseren, waaronder intracellulaire organellen en hun onderlinge relaties.Hier wordt een representatieve immunokleuring voor IBA one getoond op lichtmicroscopisch niveau. De cellulaire distributie van IBA one is beperkt tot microglia, wat de specificiteit ervan op elektronmicroscopisch niveau bevestigt. IBA one-immunogekleurde microgliale pericarya en uitlopers zijn zichtbaar.De immunoperoxidase DAB-kleuring verschijnt als een elektronendicht precipitaat. Andere voorbeelden van immunogekleurde IBA1-microgliale processen vertonen verschillende groottes en vormen. Een hogere vergroting onthult diverse intracellulaire organellen binnen één van de microgliale processen en ook de ultrastructurele relaties tussen een ander microgliaal proces en nabijgelegen elementen van het neuropil, inclusief synapsen.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u muizenbreinweefsel kunt prepareren voor immuno-elektronenmicroscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen strikt te volgen en het hersenweefsel voorzichtig te behandelen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the immunohistochemical staining of cholinergic fibers in the nucleus basalis of the Meynert region of mouse brain sections. Sections are blocked and treated with primary against choline acetyltransferase, followed by biotinylated secondary antibodies. Avidin-biotin-peroxidase complexes are added, which bind to secondary antibodies, followed by the chromogenic substrate. Sections are then dehydrated and mounted before visualizing under the microscope.

Immunohistochemical Staining of Nerve Fibers in the Nucleus Basalis of Meyner of the Mouse Brain

Source: Kummari, E., et. al., Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area., J. Vis. Exp. (2015)In this video, we demonstrate the immunohistochemistry protocol for dopamine neurons in brain tissue sections for subsequent laser capture microdissection.

Immunohistochemistry of Mouse Brain Tissue Sections for Targeting Dopamine Neurons

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Source: Louth, E. L.,  et al. Imaging neurons within thick brain sections using the Golgi-Cox method. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates imaging neurons in a Golgi-Cox stained thick brain section by setting upper and lower focus boundaries and capturing overlapping images. Multiple locations are imaged to ensure detailed neuronal projections, which are combined to create a 3D representation.

Microscopic Imaging of Neurons in a Mouse Brain Section Using Golgi-Cox Metallic Staining

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Hier geven we een eenvoudige, goedkope en tijdbesparende protocol chemisch fixeren primaten hersenweefsel met acroleïne fixatief, waardoor langdurig bewaren die compatibel zijn met pre-inbedding immunohistochemie voor transmissie elektronenmicroscopie is.

De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Leer hersenweefsel van muizen voorbereiden voor immuno-elektronenmicroscopie met behulp van transcardiale perfusie en immunoperoxidase-kleuring. Deze methode maakt gedetailleerde visualisatie van eiwitverdeling in het centrale zenuwstelsel mogelijk.

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Meer video's verkennen