Cell Cycle Analysis: An Approach to Study Cell Cycle Regulation of miRNA-transfected Lung Cancer Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 3:34 min • April 30th, 2023
- A microRNA or miRNA is a small, non-coding RNA. Following mRNA transfection or introduction into a cell, it forms a miRNA protein complex. The complex targets and binds to specific mRNA and negatively regulates its expression, halting cell cycle progression.
To begin the analysis, add a suitable dehydrating fixative to a harvested culture of miRNA-transfected lung cancer cells. The fixative preserves the cells and also permeablilizes the cell membrane. Treat the cells to a mixture of propidium iodide, a fluorescent nucleic acid dye, and ribonuclease enzyme.
The dye enters the cells and stains both DNA and RNA. The enzymes specifically degrades the RNA allowing optimal DNA quantification. Use a flow cytometer to determine the proportion of cells halted in different cell cycle phases based on individual cells fluorescence intensity.
The cells in resting and growth phases have lower DNA content and hence, lower fluorescence intensity. The cells in the Gap 2 phase with double the amount of DNA produce twice the fluorescence intensity. The cells in the DNA synthesis phase induce a fluorescence value between the other two populations. The following protocol will analyze the cell cycle regulation of miRNA-treated lung cancer cells by measuring their DNA content using PI staining and flow cytometry.
- Transfect the cells as described in the earlier section of this video. Harvest cells from each sample in separate 15 milliliter sterile tubes by trypsinization. Next, wash the cells twice with 1X PBS by centrifugation at 751 g for 5 minutes and then remove the supernatant. Resuspend and break the pellet by adding 200 microliter ice-cold 1X PBS through pipetting.
Add 2 milliliters of 70% ice-cold ethanol dropwise to the tube while vortexing the tube gently to fix the cells. Incubate tubes for 30 minutes at room temperature and place them in 4 degrees Celsius for 1 hour. Remove the tubes from 4 degrees Celsius and centrifuge.
Add 2 mL ice-cold PBS and vortex and then remove the supernatant by centrifugation. Add 500 microliters of 1X PBS containing propidium iodide and ribonuclease A with concentrations 50 and 200 micrograms per milliliter, respectively, in each sample and incubate for 30 minutes at room temperature. Transfer samples into appropriate tubes protecting from light and run on flow cytometer.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van microRNA (miRNA) bij de regulatie van de celcyclus van longkankercellen. Door gebruik te maken van flowcytometrie en propidiumjodide-kleuring, beoogt het onderzoek de DNA-inhoud te kwantificeren en de fasen van de celcyclus in met miRNA behandelde cellen te analyseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Oncologie
- MicroRNA-onderzoek
Achtergrond
- Micro-RNA's zijn kleine, niet-coderende RNA's die de genexpressie reguleren.
- Ze spelen een cruciale rol in diverse cellulaire processen, waaronder de celcyclus.
- Inzicht in de impact van miRNA op longkankercellen kan nieuwe inzichten verschaffen in de kankerbiologie.
- Flowcytometrie is een krachtig instrument voor het analyseren van de dynamiek van de celcyclus.
Doel van de studie
- Om het effect van miRNA op de celcyclus van longkankercellen te analyseren.
- Om het DNA-gehalte te meten met behulp van propidiumjodide-kleuring.
- Om het aandeel cellen in verschillende fasen van de celcyclus te bepalen.
Gebruikte methoden
- Transfectie van longkankercellen met miRNA.
- Oogsten en fixeren van cellen met behulp van een dehydrerend fixatief.
- Kleuring van cellen met propidiumjodide en ribonucleaseduizend enzyme.
- Flowcytometrie-analyse om de fluorescentie-intensiteit en het DNA-gehalte te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Cellen in verschillende fasen van de celcyclus vertoonden variërende fluorescentie-intensiteiten.
- Cellen in de rust- en groeifase vertoonden een lager DNA-gehalte.
- Cellen in de Gap 2-fase hadden een dubbele fluorescentie-intensiteit vergeleken met cellen in rust.
- Cellen in de DNA-synthesefase vertoonden tussenliggende fluorescentiewaarden.
Conclusies
- miRNA-transfectie beïnvloedt de progressie van de celcyclus van longkankercellen aanzienlijk.
- Flowcytometrie is effectief voor het analyseren van celcyclusfasen op basis van het DNA-gehalte.
- Inzicht in de rol van miRNA zou kunnen leiden tot nieuwe therapeutische strategieën bij de behandeling van kanker.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Kwantitatieve celcyclusanalyse van miRNA-getransfecteerde longkankercellen maakt nauwkeurig onderzoek mogelijk naar celcyclusregulatiemechanismen die relevant zijn voor de ontdekking van oncologische geneesmiddelen. De meting van het DNA-gehalte via flowcytometrie levert bruikbare gegevens voor doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in therapeutische programma's in een vroeg stadium. Deze benadering ondersteunt het voorspellend vertrouwen op cruciale beslismomenten in de oncologische R&D-pipeline.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe beoordeling mogelijk van miRNA-gemedieerde celcyclusarrestatie in ziekterelevante kankermodellen.
- Ondersteunt functionele validatie van regulatoire doelwitten van de celcyclus via kwantitatieve DNA-gehalteanalyse.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering door effecten op specifieke fasen van de celcyclus te onderscheiden.
- Levert voorspellende gegevens voor de triage van miRNA-kandidaten in oncologische portfolio's.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gestandaardiseerde, reproduceerbare flowcytometrie-assay vast voor de kwantificering van celcyclusfasen.
- Levert kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor high-content screening van miRNA- of compound-bibliotheken.
- Maakt een robuuste vergelijking van proliferatieremmende interventies tussen experimentele armen mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de assay en het hergebruik van het platform voor bredere oncologische toepassingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro gegevens over celcyclusarrest uit met preklinische modellen van tumorgroeiremming.
- Zorgt voor continuïteit van mechanistische studies in de ontdekkingsfase naar de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van miRNA-gebaseerde therapeutische kandidaten.
- Versterkt de voorspellende waarde voor downstream-efficiëntiestudies in oncologie-pipelines.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op flowcytometrie gebaseerde celcyclusanalyse is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunt zowel de targetvalidatie als de leadidentificatie in oncologisch onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de impact van miRNA op de progressie van de celcyclus, waardoor regulerende paden in kankercellen worden verduidelijkt.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor het evalueren van kandidaat-miRNA's of verbindingen.
- Analytiek: Maakt statistische vergelijking van celcyclusfase-distributies over verschillende experimentele condities mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro mechanistische bevindingen en preklinische tumorgroeimodellen wanneer dit door gegevens wordt ondersteund.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een gestandaardiseerde assay die aanpasbaar is aan diverse kankercellijnen en miRNA-doelen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in oncologische programma's gericht op de celcyclus.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor celcyclusanalyse.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalallocatie door het verstrekken van robuuste mechanistische gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van miRNA- en celcyclusregulerende targets in oncologische pipelines mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en technieken voor transfectie van nucleïnezuren.
- Vereist toegang tot flowcytometrie-instrumentatie en fluorescentiegebaseerde reagentia voor DNA-kwantificatie.
- Vereist standaardisatie van monsterpreparatie- en data-analyseprotocollen tussen verschillende teams.
- Aanpasbaar aan diverse kankercellijnen met protocoloptimalisatie voor specifieke modelsystemen.
- Afhankelijk van strikte controles voor RNA-degradatie en DNA-kleuring voor een nauwkeurige fasekwantificatie.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
RNA Extraction Assay: A Method to Extract RNA from miRNA Transfected Lung Cancer Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Antibody Microarray: A Technique to Study the Protein Expression of miRNA Treated Lung Cancer Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026