Bromodeoxyuridine Pulse Labelling Assay: A Technique to Measure Cell Proliferation
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 3:59 min • April 30th, 2023
- Start with a leukemia cell suspension containing the desired cell density. Centrifuge and resuspend the cells in a culture medium containing serum. Serum addition promotes continuous cell growth and cells move across the different cell cycle phases. Dilute the cells in a bromodeoxyuridine, or BrdU, labeling solution and grow them under physiological conditions for the required duration.
Cells in the synthesis or S-phase take up BrdU-- a thymidine analog-- that replaces thymidine during the DNA replication process. Centrifuge the cells to remove excess BrdU and resuspend the cells in a suitable media. Transfer the cells to a multiple well plate. Allow the cells to grow under physiological conditions for different time periods.
At various time periods, cells progress through the remainder of the S, G2, mitosis, and G1 phases and enter into the next cell cycle, allowing for the estimation of cell proliferation. Perform antibody staining to tag BrdU with fluorochrome-antibody and measure cell proliferation using flow cytometry.
Inside the flow cytometer, fluorochromes absorb the laser energy and fluoresce. The number of proliferating cells directly correlates to the fluorescence observed. In the example protocol, we will demonstrate the pulse labeling of acute lymphoblastic leukemia cells.
- This protocol uses the acute lymphoblastic leukemia cell line, NALM6, but can be applied to any non-adherent cell line. Maintain the NALM6 cells in T-75 culture flasks in complete RPMI at 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide in air. After collecting the cells and performing a cell count, resuspend the cells in complete RPMI at 2 times 10 to the 6 cells per milliliter.
Dilute the cells 1 in 2 with BrdU Complete RPMI to produce a final cell concentration of 1 times 10 to the 6 cells per milliliter. Handle BrdU with care as it is a potential mutagen and teratogen. Incubate at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide for 45 minutes.
Next, dilute the cells 1 in 10 with Complete RPMI. Centrifuge at 150 times G for five minutes and carefully discard all of the supernatant. Resuspend the cells in a small volume of Complete RPMI, perform a cell count, and adjust the cell concentration to 1 times 10 to the 6 cells per milliliter. Pipette 1 milliliter of cells into each well of a 48-well plate.
Pipette 1 milliliter of DPBS into any unoccupied wells to obtain more reproducible results. Incubate at 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide in air for the desired time points, depending on what the experimental design aims to measure. When the incubation is complete, transfer all the cells into FACS tubes.
Rinse each well sequentially with 1 milliliter volumes of PBS to a final total volume of 5 milliliters. Centrifuge at 150 times G for five minutes and carefully remove all the supernatant. The cells are now ready for staining, which should be performed immediately. If surface staining is needed, it should be performed now, prior to fixation.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beoordelen van de celproliferatie in cellen van acute lymfoblastische leukemie met behulp van BrdU-labeling en flowcytometrie. De methode stelt onderzoekers in staat om de progressie van de celcyclus en de proliferatiesnelheden in niet-adherente cellijnen te schatten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Oncologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- BrdU is een thymidine-analoog die wordt gebruikt om cellen in de S-fase van de celcyclus te markeren.
- Flowcytometrie maakt de kwantificering van gemarkeerde cellen mogelijk op basis van fluorescentie.
- Inzicht in celproliferatie is essentieel voor kankeronderzoek en de ontwikkeling van behandelingen.
- Acute lymfoblastische leukemie is een veelvoorkomend type leukemie bij kinderen.
Doel van de studie
- Om een methode aan te tonen voor het labelen en kwantificeren van prolifererende leukemiecellen.
- Om een reproduceerbaar protocol te bieden voor onderzoekers die werken met niet-adherente cellijnen.
- Om de studie van celcyclusdynamiek in kankeronderzoek te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de celsuspensie en centrifugatie.
- BrdU-labeling van cellen gevolgd door incubatie.
- Flowcytometrie voor het meten van celproliferatie.
- Antilichaamkleuring om BrdU te markeren met een fluorochroom-antilichaam.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle markering van cellen in de S-fase met behulp van BrdU.
- Kwantificering van prolifererende cellen via flowcytometrie.
- Demonstratie van de celcyclusprogressie in cellen van acute lymfoblastische leukemie.
- Protocol toepasbaar op diverse niet-adherente cellijnen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van celproliferatie.
- BrdU-labeling in combinatie met flowcytometrie is effectief voor het analyseren van celcyclusdynamiek.
- Deze aanpak kan het begrip van de biologie van leukemiecellen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het meten van celproliferatie is essentieel voor het evalueren van de therapeutische effectiviteit en het mechanistische de-risking bij de ontdekking van oncologische geneesmiddelen. De BrdU pulse-labeling assay maakt kwantitatieve tracking van de S-fase-entry mogelijk zonder celsynchronisatie, wat een reproduceerbare beoordeling ondersteunt van de effecten van verbindingen op de progressie van de celcyclus. Deze aanpak biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door proliferatie-readouts te koppelen aan mechanistische hypothesen in leukemie en andere proliferatieve ziekte-modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de DNA-synthese in specifieke celpopulaties te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe meting van proliferatieveranderingen bij modulatie van signaalpaden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de portfolio-triage door mechanistische risicoreductie van anti-proliferatieve verbindingen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve fluorescentie-outputs die compatibel zijn met flowcytometrie voor high-content screening.
- Reproduceerbaarheid: Elimineert synchronisatie-artefacten, waardoor de robuustheid van de assay over replica's en cellijnen wordt verbeterd.
- Schaalbaarheid: Aanpasbaar aan multi-well plate-formaten voor dosis-respons-profilering in campagnes voor lead-identificatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Direct toepasbaar op leukemie-modellen, wat een translationele afstemming van biomarkers met klinische proliferatie-indices mogelijk maakt.
- Preklinische continuïteit: Slaat een brug tussen de validatie van mechanismen in de ontdekkingsfase en preklinische effectiviteitsbeoordelingen via consistente proliferatiemetrieken.
- Risico-gecorrigeerde besluitvorming: Informeert go/no-go-criteria door de effecten van target engagement op de celcyclusprogressie te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en levert proliferatiegegevens die zowel het mechanistische begrip als de structuur-activiteitsrelaties informeren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de S-fase-fractie te meten als functionele readout van pathway-activiteit.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten voor het evalueren van verbindingenbibliotheken in suspensieculturen.
- Analytiek: Genereert fluorescentie-gecorreleerde proliferatiemetrieken die conditievergelijkingen en EC50-bepaling mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinisch werk via geconserveerde celcyclusdynamiek in primaire leukemie-monsters.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar proliferatieplatform dat toepasbaar is binnen therapeutische gebieden van de oncologie en immunologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in proliferatie-assays te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door tijdopgeloste markering zonder synchronisatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van cytostatische mechanismen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via kwantitatieve proliferatiedrempels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en antilichaam-gebaseerde detectietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers met geschikte fluorescentiedetectiekanalen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de omgang met BrdU vanwege de mutagene en teratogene eigenschappen.
- Omvat optimalisatie van de pulsduur en chase-tijden voor de kinetiek van specifieke cellijnen.
- Beperkt tot prolifererende populaties; quiescente of senescente cellen vereisen aanvullende assays.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Onderzoek van RNA-synthese met behulp van de 5-Bromouridine etikettering en Immunoprecipitation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunofluorescentie detectie van twee thymidine-analogen (CldU en IDU) in het jeugdwerk Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
BrdU Immunofluorescence Staining: A Technique to Identify Cells in Different Phases of Cell Cycle
Gerelateerde video's
0 Bekeken
DNA Synthesis Assay: A Technique to Assess DNA Synthesis in Proliferating Cells Using Radioactive Tritiated Thymidine Incorporation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026