Name: Vergelijkende In vivo Studie van gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer de rol van gp96 in het activeren van CD8 T-celreacties bij Xenopus laevis. Deze methode omvat adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten en huidtransplantatie om kruispresentatie van tumorantigenen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De deskundige veeteelt verstrekt door Tina Martin en David Albright is erg gewaardeerd. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 van de NIH.

1. Dieren X. laevis x X. Gilli hybriden LG-6 en LG-15 isogenetic klonen een zijn van onze broedkolonie aan de Universiteit van Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 en LG-15 delen dezelfde heterozygote MHC haplotype (a / c), maar verschillen op kleine histocompatibility (H) loci. Nakomelingen van deze klonen worden geproduceerd door gynogenesis, waarbij diploïde eieren door het vrouwtje worden geactiveerd door UV-bestraalde zaadcellen (geen DNA-bijdrage aan het nageslacht). Het gebruik van handschoenen is facultatief. Sommige mensen liever niet dragen want het is moeilijker te hanteren van de kikkers (glad) en in feite lijkt te maken van de kikkers ongemakkelijk. 2. Zuivering van gp96 van 15 / 0 Tumor (spreekt Zowel de tumor en Klein-H-AGS) Gp96 zuivering is eerder beschreven twee, drie. In het kort wordt gp96 gezuiverd door 50-70% ammoniumsulfaat fractionering, gevolgd door ConA-Sepharose en DEAE chromatografie. Ongeveer 20 tot 50 ug van eiwit kan verkregen worden per 1 mL van de tumor weefsel. Zuiverheid van het preparaat wordt bepaald door SDS-PAGE en sliver vlekken. 3. Elicitatie en Oogst van Peritoneale Leukocyten (PLS) uit Klein-H-Ag-ongelijksoortige LG-6 Kikkers <ol><li> Grow een 25 ml 's nachts E. Coli cultuur in een 50 ml conische buis bij 37 ° C met schudden. </li><li> De volgende dag hitte doodt de bacteriën door het koken van het voor 1 uur. </li><li> Centrifugeer de hitte gedood E. Coli gedurende 15 min bij 2000 rpm (1500 g) bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 / 10 e van de oorspronkelijke cultuur volume (2,5 ml) in APBS. Op dit punt is de bacteriecultuur is klaar voor gebruik en moet gebruikt worden binnen de 24 uur. </li><li> Injecteren intraperitoneaal (ip) 200 (voor een 2 inch kikker) of 300 pi (voor een 3 inch kikker) van de warmte-gedode bacteriën de voorbereiding per kikker met behulp van een 25 gauge 5 / 8 naald. </li><li> Drie dagen na de injectie PL's worden geoogst door intraperitoneale spoeling. </li><li> Voor PL oogsten, volwassen kikkers worden verdoofd door onderdompeling in een 0,1% waterige oplossing van tricaïne methaan sulfonaat (TMS, MS-222) gebufferd met natriumbicarbonaat voor maximaal 5 minuten totdat alle beweging stopt (duur afhankelijk van de grootte en de leeftijd). Dieren wakker binnen 10-20 minuten na de behandeling. </li><li> Desinfecteer de buik van de kikker met een kleine hoeveelheid van 70% ethanol. </li><li> Injecteer 5 ml (voor een 2 inch kikker) of 10 ml (voor een 3 inch kikker) van steriele APBS voorverwarmde bij kamertemperatuur in de buikholte met behulp van een 18 gauge 1 ½ naald. Verwijder de naald en zachtjes masseren van de kikker een minuut om te verzekeren dat de geïnjecteerde buffer evenwicht houdt met de vloeistof in het lichaam holte. </li><li> Gebruik een nieuwe 18 gauge 1 ½ naald zonder een spuit om de peritoneale vloeistof die uit de achterkant van de naald infuus in een schone 50 ml conische buis te verzamelen. Zorg ervoor dat u zoveel mogelijk van de oorspronkelijke geïnjecteerde volume op te halen als mogelijk. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de bloedvaten in het centrale deel van de buikstreek. </li><li> Zodra PL's worden geoogst zet de kikker in een bak met ondiep water tot hij wakker is op dat moment kan worden teruggeplaatst in zijn kooi. </li></ol> 4. Pulsing en adoptieve overdracht van Lg-6 Pls In Naive Lg-6 Ontvangers <ol><li> Een keer wassen van de PL met koud APBS en centrifugeer ze op 1000 rpm (750 g) gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de PL's in APBS. </li><li> Puls van de PL's met gp96 bij een concentratie van 1 ug gp96 per 5 x 10 5 PL. </li><li> Zodra de juiste hoeveelheid gp96 wordt toegevoegd aan de bijsluiters, meng ze door pipetteren en incubeer op ijs gedurende 1 uur. </li><li> Ofwel Centrifugeer de cellen bij 1000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C of bij 14.000 rpm gedurende 1 minuut op een ongebonden gp96 te verwijderen. </li><li> Was de PL's 3X met koud APBS om te zorgen dat er geen resterende gp96 links. </li><li> Resuspendeer de gepulste PL bij een concentratie van 5 x 10 5 PL's per 300 pi. </li><li> Adoptief overdracht PL's door ip injectie met 25 gauge 5 / 8 naald. Injecteer 300 pi van gepulste PL's (5 x 10 5 cellen) per dier. </li><li> Kikkers moeten worden voorbereid ten minste 3 dagen voordat u verder gaat met de huid transplantaat of tumor uitdaging experimenten. </li></ol> 5. Skin Graft Assay Skin afstoting van het transplantaat is een gevestigde assay in Xenopus 4, 5, 6. In Xenopus, een ontvanger verwerpt donorhuid weergave van een of twee MHC haplotype mismatches binnen 18-22 dagen bij 21-22 ° C. In tegenstelling, zijn huidtransplantaties tussen LG-6 en LG-15-klonen die alleen verschillen door kleine H-Ags langzamer afgewezen (meer dan 30 dagen). Echter, is deze afwijzing versneld bij ontvangers that zijn voorbereid tegen de donor kleine H-Ags hetzij door een eerdere huidtransplantatie of door immunisatie met gp96 gezuiverd van de donor. Geen afwijzing op alle treedt op wanneer de donor en de ontvanger zijn genetisch identiek zijn (bijvoorbeeld gekloonde of volledig ingeteeld dieren). Daarom is deze eenvoudige techniek is erg krachtig voor het karakteriseren van in vivo immuunrespons opgewekt door gp96. <ol><li> Verdoven donor kikker, zoals beschreven in 3.7. Opmerking: Alleen een minimale voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, omdat Xenopus produceren krachtige anti-microbiële peptiden (bv. magainin) in de huid dat de noodzaak voor de totale aseptische procedures overbodig maakt. In feite zou de behandeling van de kikker met een ontsmettingsmiddel schadelijk voor de huid. Daarnaast, hebben Xenopus geen pathogenen die kan worden overgedragen op de mens. Daarom is het gebruik van handschoenen is optioneel. Echter, alle gebruikte dissectie-instrumenten moeten worden geautoclaveerd en alle oplossingen moeten steriel zijn. </li><li> Knippen en verwijderen van een klein (20 mm x 5 mm) stuk van de ventrale huid (buik huid die lijkt zilverachtige door de aanwezigheid van irridophore gepigmenteerde cellen) van een LG-15 donor kikker met een schaar. </li><li> Plaats van de huid in een petrischaal met APBS en houd het op ijs. Manipuleren van de huidweefsel heel voorzichtig en vermijd het houdt hem in tussen de tang. </li><li> Met behulp van een scheermes of een schaar individuele enten gesneden in 5 mm x 5 mm stukken. Houd de fragmenten in APBS op ijs. </li><li> Op dit punt is de donor kikker wordt geplaatst in een bak met ondiep water tot hij wakker en dan is het geplaatst in water met antibiotica (Penstrep bij een concentratie van 5 mg / L). De kikker wordt bewaard in water met antibiotica gedurende twee dagen op welk punt is het weer in de normale water. De kleine wond op de plek waar de huid werd verwijderd hoeft niet te worden genaaid en geneest binnen een week. </li><li> Verdoven van de ontvanger LG-6 kikker. </li><li> Maak een kleine incisie aan de dorsale (rug) de huid van de ontvanger en plaats de 5 mm x 5 mm graft onder de huid met de zilveren kant naar boven. Wees voorzichtig om geen grote luchtbellen te introduceren onder de huid, omdat die kunnen leiden tot verplaatsing of zelfs verlies van het transplantaat. </li><li> Zorg ervoor dat u let op de schaar en pincet markeringen op de enten omdat die niet wordt beschouwd als afstoting van het transplantaat na de puntentelling begint. </li><li> 24 uur later een deel van de bovenliggende gastheer huid moet worden verwijderd uit het transplantaat. </li><li> Verdoven van de ontvanger LG-6 kikker. Behandel het dier, zoals beschreven in 5.1. </li><li> Met behulp van geautoclaveerd schaar knippen uit een raam om de graft, zodat het implantaat kan worden vrij gevisualiseerd. Wees voorzichtig niet aan de donor huid aan te raken of om het bloeden te induceren. Laat de kikker terug, zoals beschreven in 5.5. </li><li> Start het scoren van de transplantaat meteen door het nemen van een schets. Skin afstoting van het transplantaat wordt bepaald door het percentage van de vernietiging van de irridophores op de geënte huid. </li><li> De transplantaten moeten worden gecontroleerd om de 2-3 dagen, maar de dieren hoeven niet te worden verdoofd voor. Te visualiseren de enten, de kikkers moeten worden geplaatst in een petrischaal onder een dissectie microscoop. </li></ol> 6. Whole-mount Immunohistology van getransplanteerde huid Kikker hele-mount immunohistology is eerder beschreven 6. Kortom, de kikker wordt verdoofd en onder de microscoop op een steriele papieren handdoek pre-nat met kikker water (het werkgebied is ook aseptisch bereide). De getransplanteerde huid wordt vervolgens geoogst, samen met een kleine hoeveelheid van de omliggende gastheer huid en het is gekleurd met antilichamen eveneens naar cel kleuring voor flowcytometrie-analyse 6. Geautoclaveerd instrumenten en steriele buffers moeten worden gebruikt. Na het kleuren van de huid wordt geplaatst op een objectglaasje en voorzichtig geperst met een dekglas. Op dit punt is de huid kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop voor verschillende celpopulaties die zijn geïnfiltreerd in de graft. Na de procedure de kikker wordt gehouden in water met antibiotica, zoals beschreven in paragraaf 5.5. en keerde terug in het normale water. De kleine wond links waar de huid werd verwijderd geneest binnen een week. 7. Karakterisering van bloedleukocyten <ol><li> Voor het verwijderen van bloed uit de kikker, moet men "glazen naalden" voor te bereiden door te trekken steriele pasteurpipetten boven vlam. De fijne uiteinde van de pipet wordt aangescherpt onder de stereomicroscoop. De pipet wordt vervolgens aangesloten op een aspiratie plastic buis. Alle instrumenten, zoals de tang en schaar moeten worden geautoclaveerd voor gebruik. </li><li> Ook voorbereiden ijskoude 10 ml APBS en heparine-oplossing door toevoeging van 50 eenheden heparine per 1 ml APBS. Houden oplossing op het ijs. Alle gebruikte oplossingen moeten steriel zijn. </li><li> Verdoven kikker, zoals beschreven in 3.7, en volgt hetzelfde dier procedures voor de behandeling zoals beschreven in 5.1. . </li><li> Snij de huid boven de achterste voet te ontmaskerende dorsale tarsus ader. </li><li> Vul de Pasteur pipet met 1-2 ml APBS + heparine-oplossing. </li><li> Plaats de "glazen naald" in de ader en beginnen met het verzamelen van het bloed door langzaam opzuigen met de mond. Het is belangrijk om APBS + heparine-oplossing hebben in de "glazen naald", aangezien dit zal voorkomen dat het bloed gaat klonteren en verstopping van de punt van de naald. </li><li> 1 tot 2 ml bloed kan worden verkregen bij een gemiddelde grootte kikker. </li><li> De kleine incisie op het been van de kikker hoeft niet te worden genaaid en de wond geneest binnen een week. </li><li> Centrifugeer het bloed op 1000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en was de cellen 1x met 10 ml koud APBS. </li><li> Breng 2 ml bloed (1-5 x 10 6 cellen) op 1 ml Ficoll Histopaque 1.077 (Sigma) voorverwarmde bij kamertemperatuur in om het bloed leukocyten te scheiden van de rode bloedcellen. </li><li> Centrifugeer 20 min bij 1000 rpm bij kamertemperatuur zonder rem, en dan het verzamelen van de leukocyten band. </li><li> Was de cellen met 2X APBS door centrifugeren bij 1400 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C om de resterende Ficoll te verwijderen. </li><li> Op dit punt zijn de cellen klaar om te worden gekleurd met antilichamen voor flowcytometrie-analyse, of te gebruiken voor in-vitro-cultuur assays worden. </li></ol> 8. Tumor Transplantatie Assay <ol><li> Ongeveer een week voordat het experiment dooi een nieuwe partij van 15 / 0 tumorcellen en zorgen ervoor dat de cellen beginnen te groeien goed. Kweekmedium wordt beknopt beschreven in het volgende hoofdstuk en in meer detail in 3. </li><li> Vouw de 15 / 0 tumorcellen. </li><li> Op de dag van het experiment, de telling van de cellen en bepaal celdood door trypan blauw uitsluiting. Celdood moet minder dan 5%. Was de cellen 1X in koude APBS, en centrifugeer bij 1000 tpm bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in tumor kweekmedium met een dichtheid van 5 x 10 5 15 / 0 cellen per 300 microliter. </li><li> Transplantatie 5 x 10 5 cellen in 300 ul volume per kikker door subcutane injectie met een 25 gauge 5 / 8 naald aan de ene kant van de dorsale (rug) zijde van het dier. </li><li> Groei van de tumor begint binnen 2-3 weken na de tumor uitdaging. De initiële tumor uiterlijk dient te worden opgemerkt en de tumor volume moet worden opgenomen om de 2-3 dagen. Tumorvolume (hoogte x lengte x breedte) is gemeten met behulp van remklauwen. </li><li> Zodra de tumor groeit tot 3500 mm 3 of de kikker gaat op zoek lethargisch, moet ze worden gedood om ongemak te voorkomen. </li></ol> 9. Reagentia die nodig zijn: <ul><li> Amfibie fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH tot 7,5 met behulp van 10N NaOH en filter gesteriliseerd door middel van 0,2 um filter. </li><li> Tricaïne methaan sulfonaat (TMS, MS-222) (Crescent Research Chemicals CAS # 886-86-2). </li><li> Natriumbicarbonaat (Fisher Scientific S-233-500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml) </li><li> Heparine Natrium Zout (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Voedingsbodem voor Xenopus 15 / 0 tumoren [zie 3 voor meer details]: 1 L van Iscove DMEM basaal medium (Invitrogen Gibco-11965) met 10 ml insuline, 10 ml niet-essentiële aminozuren, 10 ml penicilline-streptomycine; 10 pg / mL van kanamycine, 3 ml primatone (Sheffield Products Division), 1 ml van β2-mercaptoethanol, en 3,02 g NaHCO 3 in water (pH 7,0). Dit medium wordt verdund tot amfibie osmolariteit door de toevoeging van 30% dubbel gedestilleerd water, en aangevuld met 5% foetaal runderserum, 20% superantant van een Xenopus nier cellijn A6, en 0,25% van de normale Xenopus serum. </li></ul> 10. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stereomicroscopic analyse van de huid afstoting van het transplantaat 12 dagen na de transplantatie. LG-6 gekloonde kikker kreeg een huidtransplantatie van beide (A) een MHC-identieke LG-6 (laat geen afwijzing) of (B) een MHC-ongelijksoortige outbred donor (80% afwijzing). Pijlen toont zilveren iridophore gepigmenteerde cellen markering gezonde (niet-afgewezen) geënt weefsel. (*) Mark van de tang niet te wijten aan afwijzing. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gp96 vergemakkelijkt kruis-presentatie van tumor antigenen in Xenopus. LG-15 PL's (5 x 10 5) werden gepulseerd gedurende 1 uur op ijs, ofwel met APBS (negatieve controle), 1 ug recombinant gp96 gezuiverd van een E. Coli cultuur, of 1 of 0,5 ug van gp96 gezuiverd van 15 / 0 tumorweefsel. Na 3 wasbeurten, werden de cellen adoptief overgebracht in LG-15 volwassen ontvangers (1 x 10 6 / persoon). Drie dagen later, wonen 15 / 0 tumorcellen (5 x 10 5) werdengetransplanteerde door sc injectie. Elke curve geeft de kinetiek van tumorgroei in een kikker. Dagen na de uitdaging bij tumoren verscheen voor het eerst werden gecontroleerd, en de grootte van de tumor werd periodiek bepaald met een schuifmaat (lengte x breedte x dikte).

<ol><li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li>
<li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li>
<li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis%3A+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li>
<li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li>
<li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li>
<li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li>
<li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li>
<li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity%3A+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li>
</ol>

De amfibie Xenopus is een uniek veelzijdige niet-zoogdieren model om immuniteit te bestuderen. Het uitgebreide gebruik in de biomedische en immunologisch onderzoek heeft opgeleverd in vele belangrijke research tools, zoals de MHC gedefinieerd klonen LG-6 en LG-15, evenals verschillende cellijnen en monoklonale antilichamen. Met behulp van deze tools hebben we verschillende opgericht in vitro en in vivo testen om de mogelijkheid van heat shock eiwitten zoals gp96 aan krachtige Ag-specifieke ant...

<table><tbody><tr><td>&lt;sterk&gt;Benodigde reagentia:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amfibieën fosfaatgebufferde zoutoplossing (APBS): </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 1,15 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,2 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricainemethaansulfonaat (TMS, MS-222) </td><td>Crescent Research Chemicals</td><td>CAS#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat </td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233-500</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Heparine-natriumzout </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Kweekmedium voor Xenopus 15/0-tumoren [zie 3 voor meer details]:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove DMEM basaalmedium</td><td>GIBCO, door Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primatone</td><td>Sheffield Products Division</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;2-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% dubbel gedestilleerd water </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% foetaal runderserum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% supernatant van een Xenopus-niercellijn A6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% normaal Xenopus-serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;sterk&gt;Materialen en apparatuur:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>conische centrifugebuizen van 50 en 15 ml (steriel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>steriele Precision Glide naalden, 25 gauge 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 gauge 1&amp;frac12; Precision Glide steriele naalden</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml steriele tuberculinespuit met slip tip</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml steriele spuit met slip-tip</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes (steriel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm steriele polystyreen petrischalen</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schemesmesjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm x 1 mm premium microscoopglasplaatjes </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glazen petrischalen van 10 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; Pasteur-pipetten Durex borosilicaatglas met katoenplug, wegwerpproducten</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon-slangen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twee # 5 Swiss Jeweler&amp;rsquo;Pincetten</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissectieschaar met veer McPherson-Vannas, recht snijvlak 6 mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helios-schuifmaten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoge intensiteit verlichtingsbron</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsensbrander uit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;schudincubator C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vergelijkende in vivo studie van gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis</em

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We hebben ontwikkeld in de amfibie Xenopus laevis een unieke niet-zoogdieren model om het vermogen van bepaalde heat shock eiwitten (HSP&#39;s) zoals gp96 om cross-presentatie van begeleid antigenen te vergemakkelijken en ontlokken aangeboren en adaptieve T-cel responsen. Xenopus huid afstoting van het transplantaat studie biedt een uitstekend platform om het vermogen van gp96 naar klassieke MHC klasse Ia (klasse Ia) beperkt T-cel reacties uitlokken te bestuderen. Daarnaast is de Xenopus model biedt ook een aantrekkelijk alternatief voor muizen voor het verkennen van de mogelijkheid van gp96 om reacties te genereren tegen tumoren die zijn down-gereguleerd hun klasse Ia moleculen zo te ontsnappen immuun surveillance. Onlangs hebben we een adoptieve overdracht van cel-test in Xenopus klonen met behulp van peritoneale leukocyten als antigeen presenterende cellen (APC&#39;s), en laten zien dat gp96 kan premier CD8 T-cel responsen in vivo tegen kleine histocompatibility huid antigenen als tegen de Xenopus thymus tumor 15 / 0 dat niet uitdrukken klasse Ia moleculen. We beschrijven hier de methodologie die betrokken zijn bij deze proeven, waaronder de elicitatie, pulseren en adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten, evenals de huidtransplantatie en tumor transplantatie assays uit te voeren. Daarnaast zijn we ook het beschrijven van de oogst en de scheiding van perifeer bloed leukocyten gebruikt voor flowcytometrie en proliferatie assays die het mogelijk maken voor de verdere karakterisering van de effector bevolkingen die betrokken zijn bij de huid afwijzing en anti-tumor respons.

De kikker<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Biedt een aantrekkelijk alternatief voor niet-zoogdieren model voor het verkennen van de mogelijkheid van heat shock protein, zoals gp96 om antigeen-specifieke CD8 T-cel responsen te bevorderen. We huidige methoden om te studeren<em&gt; In vivo</em&gt; Faciliteren van cross-presentatie van de huid en tumor antigenen door gp96.

Vergelijkende In vivo Studie van gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis</em

We hebben in de amfibie Xenopus laevis een uniek niet-zoogdiermodel ontwikkeld om de eigenschappen van bepaalde hitte-shockeiwitten (hsp's), zoals gp96, te bestuderen om ...

Het algemene doel van deze procedure is om het evolutionair geconserveerde vermogen van het heatshockproteïne GP96 te bestuderen om antigeenspecifieke CD8 T-celresponsen te bevorderen in de kikker Xenopus laevis. Dit wordt bereikt door eerst peritoneale leukocyten te oogsten via peritoneale lavage. De tweede stap van de procedure is het pulseren van de peritoneale leukocyten met tumorafgeleid GP96, dat minor- en tumorantigenen begeleidt, na incubatie en wasstappen.Peritoneale leukocyten worden via intraperitoneale injectie adoptief overgedragen naar naïeve kikkers om deze kikkers te primen tegen tumor- of mineure histocompatibiliteitsantigenen. De derde stap van de procedure is om de geprimede kikkers te onderwerpen aan een huidtransplantatie of een tumoruitdaging en het begin van huidtransplantaterejectie of tumorverschijning te monitoren. De laatste stap van de procedure is het afnemen van perifeer bloed om de T-cellen te karakteriseren die betrokken zijn bij de huidrejectie en de antitumorrespons.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een significante versnelling van de afstoting van huidtransplantaten laten zien, evenals vertragingen in het verschijnen van tumoren bij GP 96-geprimde kikkers via respectievelijk de huidtransplantatie- en de tumorchallenge-assays. Hallo, ik ben Christina Koska uit het laboratorium van Dr. Jacque Robert van de afdeling Microbiologie en Immunologie van het University of Rochester Medical Center. Ik ben Tanya Cruz, ook uit het laboratorium van Dr. River.Vandaag laten we u een procedure zien voor het primen van kloonkikkers door adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten, gevolgd door huidtransplantaties en tumortransplantatie-assays. Daarnaast laten we u zien hoe u perifeer bloed van deze dieren afneemt. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eigenschap van het hittestabiele eiwit GP 96 te bestuderen om antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in Xenopus laevis te stimuleren, evenals om de betrokken celtypen te bestuderen.Oké, laten we beginnen. De kikkers die in onze experimenten worden gebruikt, zijn isogenetische klonen uit onze kweekkolonie aan de University of Rochester. Om peritoneale leukocyten of pls uit te lokken voor oogst, gebruik een naald van 25 gauge en 5/8 inch om de geanestheseerde kikker intraperitoneaal te injecteren met een hitte-geïnactiveerd E. coli-preparaat. Drie dagen na de injectie worden de pls geoogst via intraperitoneale lavage.Om deze procedure te starten, wordt de buik van de geanestheseerde kikker gedesinfecteerd met een kleine hoeveelheid 70%ethanol. Gebruik vervolgens een 18 gauge 1,5 naald om vijf milliliter steriele amfibieën-fosfaatgebufferde zoutoplossing, of een op kamertemperatuur voorverwarmde PBS, in de peritoneale holte te injecteren. Verwijder de naald en masseer de kikker voorzichtig gedurende een minuut om ervoor te zorgen dat de geïnjecteerde buffer zich mengt met de vloeistof in de lichaamsholte.Steek vervolgens een nieuwe 18 gauge 1,5 naald zonder spuit in de buikholte van de kikker. Verzamel, terwijl u de bloedvaten vermijdt, de peritoneale vloeistof die via de achterkant van de naald in een schone conische buis van 50 milliliter druppelt. Zorg ervoor dat u na het oogsten van de pls zoveel mogelijk van het aanvankelijk geïnjecteerde volume terugwint.Plaats de kikker in een bak met ondiep water totdat deze wakker is, waarna hij terug in zijn kooi kan worden geplaatst. Zodra de pls zijn geoogst, centrifugeert u 10 minuten bij 1000 RPM bij vier graden Celsius, verwijdert u het sup, natant en resus. Suspendeer de pls in koude A PBS.Breng de RESUSPENDERDE cellen over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Pulseer de cellen met GP 96. Voeg de juiste hoeveelheid GP 96 toe aan de cellen en meng door te pipetteren; incubeer gedurende één uur op ijs. Na één uur.Centrifugeer de cellen bij 14.000 RPM gedurende één minuut. Verwijder het supernatant om eventueel ongebonden GP 96 te verwijderen. Voeg koude A PBS toe en resuspendeer.Centrifugeer de PLS opnieuw. Was de S in totaal drie keer met koud A-P-B-S-A om er zeker van te zijn dat er na de laatste wasbeurt geen residu van G 96 overblijft. Resuspendeer de gepulseerde pls op een concentratie van 5 × 10⁵ pls per 300 µL PBS om de pls adoptief over te dragen naar naïeve LG six-recipiënten.Injecteer 300 µL pulsed pls intraperitoneaal per dier. De kikkers moeten minstens drie dagen voor de experimenten met huidtransplantatie of tumoruitdaging, die hierna worden getoond, worden voorbehandeld. De huid voor transplantatie wordt verkregen van een onder narcose staande LG 15 donorkikker.Gebruik een schaar om een klein stukje ventrale huid weg te snijden en te verwijderen; dit is de abdominale huid die er zilverachtig uitziet. Vanwege de aanwezigheid van ARI zijn vier gepigmenteerde cellen zichtbaar tijdens het hanteren van het transplantaat. Het is essentieel om het weefsel zo min mogelijk te manipuleren, aangezien dit tot schade aan het transplantaat kan leiden.Houd de huid zeer voorzichtig vast met de pincet en plaats deze in een petrischaal met koude A PBS. Houd de petrischaal op ijs. Plaats de huid op een schoon objectglas en gebruik een scheermes om individuele grafts in stukjes van vijf millimeter bij vijf millimeter te snijden.Bewaar de fragmenten in PBS op ijs om de huid op de LG six ontvangerkikker te enten. Maak eerst een kleine incisie in de dorsale huid van de geanestheseerde ontvanger. Plaats vervolgens het graft van vijf millimeter bij vijf millimeter onder de huid met de zilverachtige zijde naar boven.Let erop dat de markeringen van de schaar en de pincet op de transplantaten worden genoteerd, aangezien deze niet als afstoting van het transplantaat worden geteld. Zodra de scoring 24 uur later begint, moet een deel van de bovenliggende huid van de gastheer van het transplantaat worden verwijderd. Gebruik een schaar om een venster rond het transplantaat uit te snijden, zodat het transplantaat vrij zichtbaar is.Zorg ervoor dat u de donorhuid niet aanraakt of bloedingen veroorzaakt. Begin onmiddellijk met het markeren van het transplantaat door een schets te maken. Huidtransplantaat.Afstoting wordt bepaald door het percentage destructie van het aridol op de getransplanteerde huid. De graft moet elke twee tot drie dagen onder de stereomicroscoop worden gecontroleerd. Bereid de tumorcellen voor op transplantatie door ze te resuspenderen in tumorcelmedium met een dichtheid van vijf keer 10⁵ cellen per 300 µL.Transplanteer de cellen via een subcutane injectie aan één zijde van de dorsale zijde van het dier. Per kikker wordt 5 × 10⁵ cellen in een volume van 300 µL geïnjecteerd. De tumorgroei zal binnen twee tot drie weken na de tumorchallenge beginnen.Noteer het initiële uiterlijk van de tumor. Gebruik een schuifmaat om de afmetingen van de tumor te meten en registreer het volume elke twee tot drie dagen voorafgaand aan de afname van blodleukocyten van de kikker. Bereid glazen naalden voor door pasta peppes over een vlam te trekken.Nadat het fijne uiteinde van de pipet onder de stereomicroscoop is verscherpt, sluit u de pipet aan op een plastic aspiratieslang. Om te beginnen met de bloedafname, snijdt u de huid boven de achterpoot van de geanestheseerde kikker open om de vena tarsalis dorsalis bloot te leggen. Vul de glazen naald met één tot twee milliliters ijskoude PBS plus heparine-oplossing.Steek vervolgens de glazen naald in de ader en begin met het afnemen van bloed door langzaam met de mond te aspireren. Van een gemiddeld grote kikker kan één tot twee milliliter bloed worden verkregen. De kleine incisie in het poot van de kikker hoeft niet te worden gehecht.De wond zal binnen een week genezen. Hier worden de resultaten getoond van een stereomicroscopische analyse van huidtransplantaatafstoting 12 dagen na transplantatie. Een LG six gekloonde kikker die een huidtransplantaat ontving van een MHC-identieke LG six donor vertoonde geen afstoting.Het asterisk geeft marker-pincetten aan die niet duiden op afstoting. In tegenstelling hiermee vertoont een LG six gekloonde kikker die een huidtransplantatie ontving van een MHC-disparate outbred donor 80% afstoting. In beide afbeeldingen geven pijlen zilverkleurige iridofoor-pigmentcellen aan die gezond, niet-afgestoten getransplanteerd weefsel markeren.In dit volgende experiment werden LG 15-leukocyten gepulst met ofwel PBS als negatieve controle, recombinant GP 96 gezuiverd uit een e. coli-cultuur, of GP 96 gezuiverd uit 15-nul tumorweefselcellen. Deze werden vervolgens adoptief overgedragen aan volwassen LG 15-recipients en drie dagen later werden levende 15-nul tumorcellen via subcutane injectie getransplanteerd. Tumoren die voor het eerst verschenen na de challenge werden gemonitord en de tumorgrootte werd periodiek gemeten. In deze grafieken vertegenwoordigt elke curve de kinetiek van de tumorgroei in één kikker. De resultaten tonen aan dat dieren die waren geprimd met 0,5 of 1 µg GP 96 een significant vertraagde tumorverschijning vertoonden in vergelijking met de controlegroepen. Daarom faciliteert GP 96 de cross-presentatie van tumorantigenen in Xenopus.We hebben zojuist aangetoond hoe de capaciteit van GP 96 om zowel minderheids- als tumorantigenen te presenteren in de kikker xap lavis kan worden onderzocht via huidtransplantaties en tumortransplantatie-assays. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat peritoneale lavage moet worden vermeden als er een bloedvat is beschadigd, aangezien de meerderheid van de cellen dan erytrocyten en geen macrofagen zijn. Het is daarnaast belangrijk om het weefsel niet met de pincet samen te knijpen bij het manipuleren van de huidtransplantatie om beschadiging te voorkomen.Dat is alles. Bedankt voor het wassen en veel succes met uw experimenten.

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de inductie en de klinische scoren van een diermodel van multiple sclerose: chronisch-recidiverende experimentele auto-immune encephalomyelitis in DA ratten. De ziekte, veroorzaakt door het immuniseren van ratten met een emulsie met hele rat het ruggenmerg en de volledige Freund's adjuvans, presenteert klinische symptomen lijken op de menselijke ziekte.

Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

This video demonstrates an efficient homogenization technique to generate an antigen-adjuvant emulsion to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in a murine model. The emulsion contains an autoantigen — myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) — in the water phase, surrounded by a continuous oil phase comprising an inactivated pathogenic bacteria. The emulsion ensures a sustained release of antigens for a prolonged immune response.

Preparing an Antigen-Adjuvant Emulsion to Induce Autoimmune Encephalomyelitis

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.

Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes

De ontwikkeling van de interferon-gamma ELISpot assay voor cavia PBMCs kunt de karakterisatie van T-cel reacties in dit zeer relevant model voor het bestuderen van besmettelijke ziekten. Wij hebben de test voor het meten van de T cel reacties gekoppeld intradermale levering van vaccin dat DNA toegepast.

Geoptimaliseerde Interferon-gamma ELISpot Assay maatregel T cel antwoorden in het Model van de cavia na vaccinatie

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Hier wordt een effectief protocol voor snelle bloedperfusie gepresenteerd om weefselmonsters van Afrikaanse klauwkikkers voor te bereiden voor transcriptomics- en proteomics-studies.

Effectieve snelle bloedperfusie bij xenopus

Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.

Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis

Leer de rol van gp96 in het activeren van CD8 T-celreacties bij Xenopus laevis. Deze methode omvat adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten en huidtransplantatie om kruispresentatie van tumorantigenen te bestuderen.

Vergelijkende In vivo Studie van gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Meer video's verkennen