Vergelijkende In vivo Studie van gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Het algemene doel van deze procedure is om het evolutionaire behoud van het vermogen van het heat shock-eiwit GP96 om antigeenspecifieke CD8 T-celresponsen te bevorderen in de kikker Xenopus laevis te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst peritoneale leukocyten te oogsten via peritoneale lavage. De tweede stap van de procedure is het pulseren van de peritoneale leukocyten met tumor-afgeleid GP96 dat minor- en tumorantigenen begeleidt, na incubatie en wasstappen.

De peritoneale leukocyten worden via intraperitoneale injectie adoptief overgedragen aan naïeve kikkers om deze kikkers te primen tegen tumor- of minder histocompatibiliteitsantigenen. De derde stap van de procedure is om de geprimede kikkers een huidtransplantatie te geven of bloot te stellen aan een tumorchallenge en het begin van de huidtransplantatie-afstoting of het verschijnen van de tumor te monitoren. De laatste stap van de procedure is het afnemen van perifeer bloed om de T-cellen te karakteriseren die betrokken zijn bij de huidafstotings- en antitumorrespons.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een significante versnelling van de afstoting van huidtransplantaten laten zien, evenals vertragingen in het verschijnen van tumoren bij GP 96-geprimde kikkers via respectievelijk de huidtransplantatie- en de tumorchallenge-assays. Hallo, ik ben Christina Koska in het laboratorium van Dr. Jacque Robert van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan het University of Rochester Medical Center. Ik ben Tanya Cruz, ook uit het laboratorium van Dr. River.

Vandaag tonen we u een procedure voor het primen van kloonkikkers door adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten, gevolgd door huidtransplantaties en tumortransplantatie-assays. Daarnaast laten we u zien hoe u perifeer bloed van deze dieren verkrijgt. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eigenschap van het hitte-shockprotein GP 96 om antigeenspecifieke CD4+ T-cellen in Xenopus te stimuleren te bestuderen, alsmede om de betrokken celtypen te onderzoeken.

Oké, laten we beginnen. De kikkers die in onze experimenten worden gebruikt, zijn isogene klonen van onze kweekkolonie aan de University of Rochester. Om peritoneale leukocyten (pls) te induceren voor oogst, gebruik een naald van 25 gauge en 5/8 inch om de geanestheseerde kikker intraperitoneaal te injecteren met een hitte-geïnactiveerd E. coli-preparaat. Drie dagen na de injectie worden de pls geoogst via intraperitoneale lavage.

Om met deze procedure te beginnen, desinfecteert u de buik van de geanestheseerde kikker met een kleine hoeveelheid 70% ethanol. Gebruik vervolgens een 18 gauge 1,5 naald om vijf milliliters steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing voor amfibieën, of een op kamertemperatuur voorverwarmde PBS, in de peritoneale holte te injecteren. Verwijder de naald en masseer de kikker voorzichtig gedurende een minuut om ervoor te zorgen dat de geïnjecteerde buffer zich mengt met de vloeistof in de lichaamsholte.

Plaats vervolgens een nieuwe 18 gauge 1,5 naald zonder spuit in de buikholte van de kikker. Verzamel, terwijl u de bloedvaten vermijdt, de peritoneale vloeistof die van de achterkant van de naald in een schone conische buis van 50 milliliter druppelt. Zorg ervoor dat er zoveel mogelijk van het aanvankelijk geïnjecteerde volume wordt teruggewonnen nadat de pls zijn geoogst.

Plaats de kikker in een bak met ondiep water totdat deze wakker is, waarna hij terug in zijn kooi kan worden geplaatst. Zodra de pls zijn geoogst, centrifugeert u 10 minuten bij 1000 RPM bij vier graden Celsius, verwijdert u de sup, natant en resus. Suspendeer de pls in koud A PBS.

Breng de RESUSPENDERDE pls over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Om de PLS te pulseren met GP 96. Voeg de juiste hoeveelheid GP 96 toe aan de pls en meng door te pipetteren; incubeer gedurende één uur op ijs na één uur.

Centrifugeer de cellen bij 14,000 RPM gedurende één minuut. Verwijder het supernatant om eventueel ongebonden GP 96 te verwijderen. Voeg koude A PBS toe en resuspendeer.

Centrifugeer de PLS opnieuw. Was de S drie keer in totaal met koude A-P-B-S-A om er zeker van te zijn dat er na de laatste wasbeurt geen residu van G 96 achterblijft. Resuspendeer de gepulseerde pls bij een concentratie van 5 × 10⁵ pls per 300 µL PBS om de pls adaptief over te dragen naar naïeve LG six-recipiënten.

Injecteer 300 µL gepulseerde pls intraperitoneaal per dier. Kikkers moeten ten minste drie dagen vóór de huidtransplantatie of de tumoraanval-experimenten, die hierna worden getoond, worden voorbehandeld. De huid voor transplantatie wordt verkregen van een geanestheseerde LG 15 donor-kikker.

Gebruik een schaar om een klein stukje ventrale huid weg te knippen en te verwijderen; dit is de buik新生huid die er zilverachtig uitziet. Vanwege de aanwezigheid van ARI zijn vier gepigmenteerde cellen aanwezig tijdens het hanteren van het transplantaat. Het is cruciaal om het weefsel zo min mogelijk te manipuleren, aangezien dit tot beschadiging van het transplantaat zal leiden.

Houd de huid zeer voorzichtig vast met de pincet en plaats deze in een Petrischaal met koude PBS. Houd de Petrischaal op ijs. Plaats de huid op een schoon objectglas en gebruik een scheermes om individuele grafts in stukjes van vijf millimeter bij vijf millimeter te snijden.

Bewaar de fragmenten in PBS op ijs om de huid te enten op de zes LG-ontvangerkikker. Maak eerst een kleine incisie in de dorsale huid van de geanestheseerde ontvanger. Plaats vervolgens het transplantaat van 5 mm bij 5 mm onder de huid met de zilverkleurige zijde naar boven.

Let erop dat de markeringen van de schaar en pincet op de grafts worden genoteerd, aangezien deze niet als graftafstoting worden geteld. Zodra de scoring 24 uur later begint, moet een deel van de overliggende huid van de gastheer van de graft worden verwijderd. Gebruik een schaar om een venster rondom de graft uit te snijden, zodat de graft vrij zichtbaar is.

Zorg ervoor dat u de donorhuid niet aanraakt of bloedingen veroorzaakt. Begin onmiddellijk met het documenteren van het transplantaat door een schets te maken. Huidtransplantaat.

Afstoting wordt bepaald door het percentage vernietiging van het aridol op de getransplanteerde huid. Het transplantaat moet elke twee tot drie dagen onder de stereomicroscoop worden gecontroleerd. Bereid de tumorcellen voor op transplantatie door ze te resuspenderen in tumorculturemedium met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per 300 µL.

Transplanteer de cellen via een subcutane injectie aan één zijde van de dorsale zijde van het dier. Per kikker worden 5 × 10⁵ cellen in een volume van 300 µL geïnjecteerd. De tumorgroei zal binnen twee tot drie weken na de tumorchallenge beginnen.

Noteer het initiële uiterlijk van de tumor. Gebruik een schuifmaat om de afmetingen van de tumor te meten en registreer het volume elke twee tot drie dagen voorafgaand aan de afname van bloedleukocyten van de kikker. Bereid glazen naalden voor door pasta peppes over een vlam uit te trekken.

Nadat het fijne uiteinde van de pipet onder de stereomicroscoop is verscherpt, verbindt u de pipet met een plastic aspiratiebuisje. Om de bloedafname te starten, snijdt u de huid boven de achterpoot van de geanestheseerde kikker open om de dorsale tarsale vene bloot te leggen. Vul de glazen naald met één tot twee milliliters ijskoude PBS plus heparine-oplossing.

Voer vervolgens de glazen naald in de ader in en begin met het verzamelen van bloed door langzaam met de mond te aspireren. Van een gemiddeld grote kikker kan één tot twee milliliter bloed worden verkregen. De kleine incisie in het pootje van de kikker hoeft niet gehecht te worden.

De wond zal binnen een week genezen. Hier worden de resultaten getoond van een stereomicroscopische analyse van huidtransplantat-afstoting 12 dagen na transplantatie. Een LG six gekloonde kikker die een huidtransplantaat ontving van een MHC-identieke LG six donor vertoonde geen afstoting.

Het asterisk geeft aan dat de markeertang geen afstoting vertoont. In contrast hiermee vertoont een LG six gekloonde kikker die een huidtransplantatie ontving van een MHC-disparate outbred donor 80% afstoting. In beide afbeeldingen geven pijlen zilverachtige iridofoor-gepigmenteerde cellen aan die gezond, niet-afgestoten getransplanteerd weefsel markeren.

In dit volgende experiment werden LG 15-leukocyten gepulseerd met ofwel PBS als negatieve controle, recombinant GP 96 gezuiverd uit een E. coli-cultuur, of GP 96 gezuiverd uit 15-zero-tumorweefselcellen; deze werden vervolgens adoptief overgedragen naar volwassen LG 15-recipients en drie dagen later werden levende 15-zero-tumorcellen via subcutane injectie getransplanteerd. Tumoren die verschenen na de challenge werden gemonitord en de tumoromvang werd periodiek gemeten. In deze grafieken stelt elke curve de kinetiek van de tumorgroei in één kikker voor. De resultaten tonen aan dat dieren die waren geprimed met 0,5 of 1 µg GP 96 een significant vertraagde tumorverschijning vertoonden in vergelijking met de controlegroepen. Daarom faciliteert GP 96 de cross-presentatie van tumorantigenen in Xenopus.

We hebben zojuist aangetoond hoe de capaciteit van GP 96 om zowel minderheids- als tumorantigenen te presenteren in de kikker Xenopus laevis kan worden onderzocht middels huidtransplantaties en tumortransplantatie-assays. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er geen peritoneale lavage moet worden verzameld als er een bloedvat is beschadigd, aangezien de meerderheid van de cellen dan erytrocyten en geen macrofagen zijn. Het is daarnaast belangrijk om het weefsel niet met de pincet samen te knijpen bij het manipuleren van het huidtransplantaat om beschadiging te voorkomen.

Dat is alles. Bedankt voor het wassen en veel succes met uw experimenten.