DNA-Stabiele Isotopen sondering (DNA-SIP)

Het algemene doel van deze procedure is het terugwinnen van DNA van actieve micro-organismen die een specifiek groeisubstraat hebben geconsumeerd, zonder dat laboratoriumkweek hiervoor een vereiste is. Dit wordt bereikt door eerst een milieu-monster te incuberen met een stabiel isotoop-gelabeld substraat van belang, onder omstandigheden die vergelijkbaar zijn met die in de natuurlijke omgeving. De tweede stap van de procedure is het extraheren van het totale DNA uit dit isotoop-gelabelde monster.

De derde stap van de procedure is om dit DNA te onderwerpen aan dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie in cesiumchloride. De laatste stap van de procedure is het fractioneren van de dichtheidsgradiënt om zwaar en licht DNA te verkrijgen voor daaropvolgende moleculaire karakterisering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de identiteit onthullen van actieve maar niet-gekweekte micro-organismen die betrokken zijn bij het metabolisme van een specifiek substraat via diverse mogelijke moleculaire technieken, waaronder fingerprinting, microarray, hybridisatie, kloon- en bibliotheekanalyse en metagenomics.

Hallo, ik ben Josh Neufeld van het Department of Biology aan de University of Waterloo. Ik ben Eric Dunford, een promovendus in het Neufeld Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor DNAS-isotoopsonderzoek, of DNA-sip, een techniek die veelvuldig wordt gebruikt om de identiteit van onbekende en potentieel niet-kweekbare micro-organismen te koppelen aan hun vermogen om een specifiek groeisubstraat te benutten.

Wij gebruiken deze procedure in het Newfeld-lab om het metabolisme van koolstofbronnen in diverse terrestrische en aquatische omgevingen te bestuderen. Vandaag laten we u de toepassing zien van een specifiek koolstofsubstraat, 13 C glucose, op een bodemmonster. We merken echter op dat sinds deze methode voor het eerst werd ontwikkeld door de groep van Colin Merle aan de University of Warwick, onderzoekers het protocol hebben gediversifieerd voor toepassing in verschillende omgevingen en met het gebruik van diverse andere gelabelde isotopen, zoals stikstof en zuurstof.

Vandaag richten we ons op koolstof, maar het protocol zelf kan worden toegepast op verschillende experimentele ontwerpen. Laten we beginnen. Bereid vóór de start van deze procedure alle reagentia voor DNA-stabiele isotopenmarkering of DNA-CYP voor zoals beschreven in het geschreven gedeelte van dit protocol.

DNAC begint met de incubatie van het monster. De incubatieomstandigheden variëren sterk, afhankelijk van diverse kenmerken van het monster en het substraat. Zodra de geschikte incubatieomstandigheden empirisch zijn bepaald, voegt u het passende substraatamendement toe aan het milieumonster.

U kunt er ook voor kiezen om aanvullende nutriënten toe te voegen om microbiële groei mogelijk te maken, indien deze op basis van testincubaties vereist zijn. Zodra de incubatie van het monster is opgezet, wordt het monster afgesloten en verzegeld, waarna de milieu monsters die het gelabelde substraat bevatten, worden geïncubeerd. Het getoonde voorbeeld omvat de toevoeging van een met koolstof 13 gelabelde glucosoplossing aan een bodemmonster.

Stel vervolgens een controle-incubatie in om als vergelijking te dienen ter bevestiging van de schijnbare labeling van nucleïnezuren die in volgende stappen wordt waargenomen. Bereid dit monster onder identieke omstandigheden voor, behalve dat er niet-gelabelde koolstof als substraatcap wordt gebruikt; verzegel en incubeer het milieu-monster met het niet-gelabelde substraat onder dezelfde omstandigheden. Extraheer na de incubatie DNA uit de microcosmen met behulp van een extractieprotocol dat geschikt is voor de gewenste downstream-applicaties. Kwantificeer vervolgens het geëxtraheerde DNA voor de volgende ultracentrifugatiestappen met behulp van een agarosegel en een spectrofotometer.

Gebruik verticale of bijna verticale rotors voor ultracentrifugatie om een maximale scheiding van licht en zwaar DNA te garanderen. De Beckman Coulter VTI 65.2 rotor heeft 16 wells voor het plaatsen van 5,1 milliliter quick seal polymeerbuisjes om monsters voor ultracentrifugatie voor te bereiden. Bereken eerst het volume geëxtraheerd DNA dat nodig is om 0,5 tot 5 microgram DNA aan de ultracentrifugebuisjes toe te voegen.

Gebruik de eerder vastgestelde DNA-concentraties. Bepaal vervolgens de exacte dichtheid van de cesiumchloride-stamoplossing met een digitale refractometer. Bereken, zoals gesuggereerd in het schriftelijke protocol, het benodigde volume gradiëntbuffer-DNA-oplossing om een passende mengverhouding te genereren.

Combine met behulp van deze berekeningen het geëxtraheerde DNA met gradiëntbuffer en 4,8 milliliters cesiumchloride in een steriele wegwerpbuis van 15 milliliter. Het resulterende volume zal groter zijn dan de opgegeven capaciteit van de centrifugebuizen om de buizen volledig te vullen. Meng ten slotte de oplossing door de buis 10 keer om te keren volgens variaties van dit protocol.

Gebruik een fluorescerende stof zoals ethidiumbromide in de gradiëntoplossing om het DNA in de buis zichtbaar te maken. Het veranderen van de DNA-dichtheid bij gebruik van DNA uit een zuivere kweek, inclusief een cesiumbromidegradiënt zoals hier getoond, is bijzonder nuttig om direct visuele bevestiging van de gradiëntvorming te krijgen na elke centrifugatiestap. De stappen voor het gebruik van deze aanpak worden beschreven in het geschreven protocol.

Om de ultracentrifugatie voor te bereiden, gebruikt u eerst een pipetbulb en een pasteurpipet om de ultracentrifugeebuizen voorzichtig te vullen met de gradiëntoplossingen. Label de buizen op de schouder met een fijne permanente marker. Zorg ervoor dat de buizen precies tot aan de basis van de buishals zijn gevuld, aangezien onvoldoende gevulde buizen de neiging hebben te barsten tijdens de ultracentrifugatie.

Zodra alle benodigde buisjes zijn gevuld met de monsteroplossingen, noteert u de exacte massa van elk buisje. Sorteer de buisjes in paren die zo nauw mogelijk bij elkaar liggen en voeg kleine hoeveelheden oplossing toe of verwijder deze totdat ze in balans zijn binnen 10 mg. Houd het vloeistofniveau zo dicht mogelijk bij de bodem van het buisje. Sluit de buisjes vervolgens af met een buisjesdop volgens de instructies van de fabrikant.

Controleer of de buisjes goed zijn afgesloten door ze om te keren en er een matige druk op uit te oefenen. Weeg de buisjes opnieuw om te controleren of ze na het afsluiten nog steeds in balans zijn vóór de ultracentrifugatie. Inspecteer elk rotorvak zorgvuldig om er zeker van te zijn dat deze schoon zijn en vrij van stof en vuil dat de buisjes tijdens de ultracentrifugatie zou kunnen doorboren.

Plaats de buisjes in de rotor, waarbij de gebalanceerde paren tegenover elkaar worden gezet. Noteer de positie van elk monster in de rotor, aangezien het ultracentrifugatieproces de markeringen onleesbaar kan maken. Sluit de rotorputjes zorgvuldig af volgens de aanwijzingen van de fabrikant.

Nadat de rotorputjes zijn afgesloten, wordt de rotor in de ultracentrifuge geplaatst. Sluit de deur van de ultracentrifuge en trek een vacuüm voor de VTI 65.2 rotor. Stel de rotatiesnelheid in op 44.100 RPM, de temperatuur op 20 °C en de ultracentrifugatietijd op 36 tot 40 uur.

Zorg dat het vacuüm is ingeschakeld, selecteer de maximale versnelling en schakel de rem uit om te voorkomen dat de gradiënt wordt verstoord door vertraging. Verwijder direct na de ultracentrifugatie voorzichtig de rotor. Pas op dat u de rotor niet kantelt of stoot om te voorkomen dat de gradiënten in de buizen worden verstoord.

Verwijder ten slotte voorzichtig de buizen voor gradiëntfractionering. DNA kan uit de ultracentrifugebuizen worden geëxtraheerd met behulp van de fractioneringstechniek. Begin met het vullen van een steriele spuit van 60 milliliter met steriel gedestilleerd en gedeïoniseerd water dat voldoende propofol-blauwe kleurstof bevat.

Om een donkerblauwe kleur te verkrijgen, plaatst u de spuit op de laadarm van de spuitenpomp. Bevestig vervolgens de pompslang die is voorzien van een naald van 23 gauge en één inch, en zet de pomp aan totdat er wat water uit het uiteinde van de naald komt. Vermijd luchtbellen in de watervoorraad, aangezien deze het fractioneringsproces negatief zullen beïnvloeden.

Bereid voor elk monster 12 steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor met labels waarop het monsternummer en de fractie staan vermeld. Bevestig vervolgens een van de ultracentrifugebuisjes met een snelle en gecontroleerde beweging aan een klemstatief. Doorboor de bodem van de buis langs de naad met een nieuwe naald van 23 gauge en één inch, en draai de naald om een uniform gat te creëren.

Het kan zijn dat latex handschoenen een betere grip op de naaldschacht bieden dan nitril handschoenen. Doorsteek met de naald die aan de pompslang is bevestigd de bovenkant van de buis op de bovenste buisschouder langs de naad op een snelle en gecontroleerde manier. Let op dat het ook mogelijk is om eerst de bovenkant van de buis en vervolgens de onderkant van de buis door te steken.

Let daarnaast op dat een kleine hoeveelheid minerale olie op de schouder van de buis kan helpen om lekken te voorkomen bij een onjuiste afdichting rond de bovenste naald bij een eerder gekalibreerde pompsnelheid. Pomp het gekleurde water in de bovenkant van de buis om in 12 minuten 12 fracties van 425 microliter te verkrijgen. Gebruik een timer om de gradiëntoplossing op te vangen in de gelabelde microcentrifugebuisjes.

Controleer tot slot de dichtheid van alle fracties voor ten minste één monster of controlegrediënt. Gebruik hiervoor een digitale refractometer. Verwachte waarden liggen in het bereik van 1,690 tot 1,760 gram per milliliter, met een mediane dichtheid van ongeveer 1,725 gram per milliliter om DNA uit alle fracties neer te slaan.

Voeg eerst 20 micrograms lineair polyacrylamide toe als drager voor precipitatie en meng door omkering. Voeg vervolgens twee volumes PEG-oplossing toe en meng opnieuw door omkering. Laat de buisjes gedurende twee uur bij kamertemperatuur staan om het DNA na incubatie te laten precipiteren.

Plaats de monsters in een microcentrifuge met de buisjes in dezelfde richting georiënteerd om een consistente lokalisatie van het centrifugepellet te garanderen. Centrifugeer de buisjes bij 13.000 G gedurende 30 minuten. Haal na centrifugatie de monsters uit de microcentrifuge, aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant en gooi dit weg. Het pellet zou in dit stadium zichtbaar moeten zijn met behulp van een felle lichtbron.

Was de pellet met 500 µL 70% ethanol nadat de pellet is gewassen. Centrifugeer de monsters bij 13.000 G gedurende 10 minuten; aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant en gooi dit weg. De pellet zal nu beter zichtbaar zijn, maar zal gemakkelijker loskomen van de wand van de buis.

Laat het pellet 15 minuten drogen bij kamertemperatuur. Zodra de pellets zijn opgedroogd, worden ze elk gesuspendeerd in 50 µL TE-buffer. Ten slotte worden vijf µL van elke fractie op een agarosegel geladen om de gradiëntfracties te karakteriseren met de methoden die in het schriftelijke protocol worden besproken.

Typische DNA SIP-resultaten zullen een scheiding tonen van gelabeld en ongelabeld DNA in de gradiëntvorm door ultracentrifugatie. Idealiter is er een volledige resolutie van genetisch materiaal met een hoog molecuulgewicht, zoals koolstof 13 en stikstof 15, van ongelabeld materiaal; in het bijzonder unieke PCR-gebaseerde vingerafdrukken die geassocieerd zijn met fracties vier tot en met acht van met stabiele isotopen geïncubeerde monsters, maar niet met het natuurlijke substraat. Geïncubeerde controles leveren sterk bewijs dat specifieke organismen koppelt aan het metabolisme van een bepaald gelabeld substraat wanneer dit wordt uitgevoerd op DNA van twee zuivere culturen: koolstof 13-gelabelde Methyloccocus capsulatus stam bath en ongelabelde Sian medi A TCC 10 21; gelabeld en ongelabeld genomisch DNA scheiden zich in de respectievelijke gradiëntfracties met verschillende dichtheden.

In dit voorbeeld kan DNA gelabeld met zware isotopen worden waargenomen in fracties vier tot en met vijf, terwijl ongelabeld DNA in hoge concentraties wordt aangetroffen in fracties negen tot en met 10. PCR-geamplificeerd DNA uit dezelfde fracties werd geanalyseerd met denaturerende gradiëntgelelektroforese (DGGE), wat resulteerde in discrete bandpatronen die overeenkomen met de twee organismen in de gradiënt. De dichtheid van de fracties varieert van ongeveer 1,580 tot 1,759 gram per milliliter, en ze worden van links naar rechts weergegeven in volgorde van afnemende dichtheid.

Omgekeerd kunnen de scheiding van isotopen en de incubaties van milieu monsters moeilijker te interpreteren zijn. Toendrabodems uit Resolute Bay, Canada, werden gedurende een periode van 14 dagen bij 15 °C geïncubeerd met glucose gelabeld met carbon 12 of carbon 13. De aeros gels van het DNA uit de gezuiverde gradiëntfracties vertoonden een smear van genomisch DNA over fractie zeven tot en met 10 voor zowel de carbon 12 als de carbon 13 incubaties.

Wanneer DGGE van 16 s ribosomaal RNA-genen echter werd gebruikt om de carbon 13-verrijking van biomassa van specifieke microbiële taxa te bepalen, vertoonde het DNA uit bodem geïncubeerd met carbon 12-glucose vergelijkbare patronen over alle gradiëntfracties, terwijl het monster geïncubeerd met carbon 13-glucose DGGE-vingerafdrukken genereerde die uniek geassocieerd zijn met fracties vijf tot en met acht; de geconserveerde banden, aangegeven door de pijlen, vertegenwoordigden een dominant fylo-type dat consistent was over alle gradiëntfracties. Het fylo-type verschuift naar zwaardere fracties voor DNA verkregen uit bodem geïncubeerd met carbon 13-glucose. De identiteit van dit specifieke 16 s ribosomaal RNA-gen kan worden bepaald om daaropvolgende metagenomische of op cultivatie gebaseerde benaderingen te sturen.

We hebben zojuist laten zien hoe u een DNA stable isotope probing-experiment uitvoert, van het incuberen van monsters tot het verkrijgen van gelabeld DNA voor moleculaire analyse. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw experimentele ontwerp zorgvuldig te overwegen; wees voorzichtig om niet te veel substraat toe te voegen, om te voorkomen dat uw experiment wordt bevooroordeeld in het voordeel van snelgroeiende organismen. Daarnaast wilt u een te lange incubatie vermijden, zodat het substraat niet via een voedselweb wordt verdund naar andere leden van een gemeenschap.

U wilt dus precies de juiste hoeveelheid substraat en voldoende incubatietijden gebruiken om kleine hoeveelheden gelabeld DNA in zware fracties te kunnen detecteren met gevoelige PCR-gebaseerde applicaties. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.