Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Deze video toont de microdissectie van het netvlies en het netvlies met vastgehecht retinaal pigmentepitheel, of RPE, van zebravissenembryo's één tot drie dagen na bevruchting. Alle procedures kunnen worden uitgevoerd met fijne pincetten en algemene laboratoriumbenodigdheden. Met behulp van standaard stereomicroscopen voor netvliesdissectie wordt de enkelvoudige laag RPE verwijderd en afgepeld door een borstelende beweging en de hechting van het RPE aan het oppervlak van de kweekplaat.

Voor de dissectie van het netvlies met behoud van het RPE worden de adhesieve eigenschappen van de kweekplaat vóór de dissectie verwijderd door middel van embryonale verbrijzeling en wassing. Om het RPE intact te houden, worden het choroïd en de sclera vervolgens zorgvuldig door het wegtillen van dit weefsel efficiënt gescheiden van het aan het RPE gehechte netvlies, gevolgd door de verwijdering van de lens met een chemisch geëtste wolfraamnaald. Deze dissectiemethode maakt het mogelijk om intact netvliesweefsel te verkrijgen en is succesvol ingezet voor het bestuderen van weefselspecifieke RNA-expressie en profielen van het zebravisnetvlies en het retinaal pigmentepitheel.

Hoi, ik ben Li Jang van het laboratorium van professor UFE Leon van de afdeling Biological Sciences aan Purdue University. Vandaag laten we u zien hoe u embryonaal oogweefsel van zebravis ontleedt. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het gennetwerk te bestuderen dat de ontwikkeling van het oog reguleert.

Laten we beginnen. Acht. Bereid vóór de microdissectie de volgende oplossingen: E3-medium, gefilterde gesteriliseerde Ringer-oplossing en 5 N natriumhydroxide.

Ets vervolgens de wolfraamnaalden chemisch. Plaats een klein bekerglas in een Petrischaal met klei om het hanteren van het bekerglas te vergemakkelijken en morsen van natriumhydroxide te voorkomen. Bevestig een standaard paperclip aan de zijkant van het bekerglas.

Giet vijf normaal natriumhydroxide in het bekerglas totdat de paperclip in contact komt met het natriumhydroxide. Verbind de negatieve elektrode van een DC-stroomvoorziening met de paperclip en de positieve elektrode met één uiteinde van een kort stuk tungstendraad. Wikkel het andere uiteinde van de tungstendraad om een kleiballetje met een diameter van vier millimeter en dompel dit uiteinde in de natriumhydroxide-oplossing.

Verhoog de spanning naar ongeveer drie volt en dip de draad gedurende één seconde op en neer in de natriumhydroxide-oplossing, met intervallen van ongeveer 10 minuten. De wolfraamdraad die aan natriumhydroxide is blootgesteld, zal geleidelijk dunner worden; wanneer de kleibal aan de andere kant van de draad die aan de positieve elektrode is bevestigd afvalt, zal de draad een scherpe naaldvorm hebben. Spoel de scherpe naald met Ringer-oplossing of E3 om zoutafzettingen te verwijderen en bevestig de naald met tape of een naaldhouder aan een houten applicator voor een eenvoudige hantering om embryo's voor dissectie voor te bereiden.

Houd de volwassen super fish volgens standaardprotocollen op de avond vóór de voortplanting. Scheid de oudervissen in statische kweekbakken paarsgewijs met behulp van een scheidingsscherm. Verwijder het scherm nadat het kamerlicht de volgende ochtend is ingeschakeld en laat de ouders kruisen in intervallen van 10 minuten om de dertig minuten, waarbij de vissen na elke kruising weer worden gescheiden.

Bewaar de embryo's die van elke kruising zijn verzameld afzonderlijk in E3-medium bij 28 °C. Bepaal het stadium van de embryo's 10 tot 12 uur na bevruchting en bepaal het stadium opnieuw vlak voor de dissectie op de specifieke tijdstippen. Gebruik Falcon 60 x 15 millimeter polystyreen kweekplaten voor de dissectie.

Een nieuwe, ongebruikte plaat heeft een intrinsieke adhesie-eigenschap voor RPE-weefsel tot ongeveer 20 minuten en kan helpen bij het verwijderen van het RPE voor retina-dissecties. Als een retina met aangehecht RPE gewenst is, kan deze adhesie-eigenschap worden overwonnen door twee embryo's volledig te pletten in een kweekplaat met ringer-oplossing en deze 30 minuten vóór de dissectie te laten staan, gevolgd door uitgebreid wassen met verse ringer-oplossing vóór de dissectie. Alle fijne dissecties worden uitgevoerd bij een vergroting van ongeveer vijf tot acht x op een Olympus SC X 16-microscoop met een one x objectief.

Met Dumont-pincetten of een chemisch geëtseerde wolfraamnaald wordt de microscooptafel opgewarmd tot 28 °C. Om de invloed van temperatuurschommelingen bij de start van de dissectie van het netvlies te minimaliseren, wordt een embryo in een specifieke ontwikkelingsfase overgebracht naar vijf milliliter Ringer-oplossing in een Falcon culturenplaat van 60 bij 15 mm, voorbereid zoals beschreven voor netvliesdissectie zonder RRPE. Snijd de kop en een deel van de anterieure romp af met de scherpe punt van de pincet en verwijder snel het lichaam van de zebravis. Zet vervolgens het posterieure uiteinde van het kop-rompsegment vast op een culturenplaat. Open met behulp van de pincet de kop aan de dorsale zijde, beginnend bij het voorhoofd.

Verwijder de hersenen zodat de mediale zijde van de ogen is blootgelegd en naar boven is gericht voor verdere manipulaties. Om het netvlies te dissekeren, gebruikt u de punt van de pincet om het blootgelegde RPE aan de mediale zijde van het oog, die naar boven is gericht, voorzichtig weg te borstelen tot er een kleine opening naar het netvlies zichtbaar is. Zet de borstel- en pelbeweging voort tot de mediale zijde van het netvlies bijna volledig is blootgelegd.

Voorkom dat de blootgestelde retina wordt bekrast of doorboord bij het verwijderen van het laterale RPE op de retina van het oog dat naar de kweekschaal is gericht. Houd een hoek van ongeveer 45 graden aan ten opzichte van het oppervlak van de kweekplaat en strijk over het oog met de pincet. Verwijder het RPE dat relatief stevig aan de ora serrata vastzit door het losgekomen deel van het RPE tegen de kweekplaat vast te pinnen voor dissectie.

Til vervolgens het netvlies voorzichtig op om het resterende RPE te verwijderen en verwijder de lens door gebruik te maken van de adhesieve eigenschappen van de kweekschaal voor hechting. Wees voorzichtig om de retinale cellen niet te beschadigen, aangezien deze ook licht aan het oppervlak van de schaal zullen hechten. Als de lens niet loslaat door te rollen, gebruik dan een geëtseerde wolfraamnaald met een draaiende beweging op het lensoppervlak.

Voor het starten van de dissectie van de retina met behoud van het RPE, gebruik een Falcon-kweekplaat van 60 bij 15 millimeter die is voorbereid zoals beschreven voor een RPE-gebonden retinaldissectie. Verplaats een embryo in een specifiek ontwikkelingsstadium naar vijf milliliter ringeroplossing. Snijd de kop en een deel van de anterior trunk af.

Verwijder snel het lichaam van de zebravis, zoals eerder beschreven. Zet het posterieure uiteinde van het hoofd-rompsectie vast op een kweekplaat. Open met de assistentiepincet het hoofd aan de dorsale zijde, beginnend bij het voorhoofd aan de anterieure zijde.

Verwijder de hersenen zodat de mediale zijde van de ogen is blootgesteld en naar boven is gericht. Til bij verdere manipulaties met een pincet het oog voorzichtig aan de posterolaterale zijde op en rol het naar de anteriore zijde. Het choroïd- en scleraweefsel aan de buitenkant van de RPE-laag is relatief stevig aan de huid gehecht en kan grotendeels worden afgepeld door het oog voorzichtig naar de anteriore zijde te rollen.

Verwijder de lens met de wolfraamnaald nadat de laterale zijde van het oog is blootgelegd en terwijl het oog nog aan de huid vastzit voor de dissectie van het retina. Zonder RPE en zonder het aan het RPE gehechte retina kunnen de gedissecteerde monsters in triol in een RNA-microtube worden verzameld voor verdere RNA-karakterisering.

Hier wordt een succesvolle dissectie van het netvlies zonder RPE getoond, waarbij de integriteit van het netvlies behouden is gebleven, zoals blijkt uit het intacte oppervlak van het netvlies. De overeenkomstige histologische sectie laat eveneens zien dat de architectuur van het netvlies zeer goed behouden is. In het bijzonder is het behoud van de extracellulaire matrix tussen de fotoreceptorlaag en het RPE uitzonderlijk goed.

Een succesvolle dissectie van de retina met behoud van het RPE wordt gekenmerkt door een intacte en continue RPE-laag. De overeenkomstige histologische sectie laat zien dat zowel de retinalcellen als de RPE-cellen in goede conditie zijn. Het totale RNA dat uit de gedissecteerde retinae is geëxtraheerd, is van hoge kwaliteit.

Dit wordt aangetoond door het electroferogram en het gelbeeld verkregen uit de bioanalyzer-analyse. De basislijn is vlak en de 18 s en 28 s ribosomale pieken zijn intact. Het RNA-integriteitsgetal is doorgaans groter dan 9,8.

We hebben zojuist de microdissectieprocedures gedemonstreerd voor het verkrijgen van het embryonale netvlies van zebravis met en zonder RPE. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de meest kritische stappen bij de dissectie van het netvlies de borstelende beweging met de punt van de pincetten en het oprollen van het weefsel zijn. Voor het verwijderen van RPE-resten hebben we vastgesteld dat het plaatsen van de ellebogen op een verstelbare armsteun van uw stoel tijdens de dissectie de handbewegingen aanzienlijk kan stabiliseren.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.