Name: Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer microdissectie van zebravisnetvlies met en zonder retinale pigmentepitheel (RPE) bij embryo's van één tot drie dagen na bevruchting. Deze methode behoudt intacte weefsels voor RNA-expressieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een startup fonds van de afdeling Biologische Wetenschappen aan de Purdue University.

Deel 1: Voorbereidingen voor het microdissectie <ol><li> Oplossingen <ol class="lalpha"><li> E3 medium 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 en 0,33 mM MgSO 4). </li><li> Ringer-oplossing 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), filter gesteriliseerd. </li><li> 5N NaOH. </li></ol></li><li> Chemisch etsen van wolfraam naalden <ol class="lalpha"><li> Secure een klein bekerglas met 5N NaOH op een petrischaaltje met klei. </li><li> Bevestig een paperclip aan de kant van de beker, zodat het in contact komt met de NaOH-oplossing. </li><li> Sluit de negatieve elektrode van een DC-voeding naar de paperclip en de positieve elektrode op een uiteinde van een kort stukje (~ 2 cm) van wolfraam draad. </li><li> Wikkel het andere uiteinde van wolfraam draad met een klein balletje klei en duik dit uiteinde in de NaOH-oplossing. </li><li> Verhoog de spanning tot ongeveer 3V en dompel de draad op en neer in de NaOH-oplossing tot een goede ets tarief is bereikt. Een naald in goede kwaliteit kan meestal worden geëtst in 10 minuten. </li><li> De wolfraam draad blootgesteld aan de oplossing zal geleidelijk dunner. Als de klei bal daalt, zal de andere kant van de draad die nog aan de positieve elektrode hebben een scherpe naald vorm. </li><li> Spoel de scherpe naald met Ringer's of E3 om zout afzettingen te verwijderen. </li><li> Bevestig de naald op een houten applicator met tape of een naald houder voor gemakkelijk gebruik. </li></ol></li><li> Kweekplaten <ol class="lalpha"><li> De Falcon 60 x 15 mm polystyreen cultuur platen zijn klaar om te gebruiken voor het netvlies microdissectie. </li><li> Voor het ontleden van RPE-aangesloten netvlies, volledig verpletteren twee embryo's in een cultuur plaat met Ringer's oplossing om zich te ontdoen van de kleverigheid van het oppervlak van 30 minuten voor dissectie. Kort voor dissectie, uitgebreid wassen van de plaat met verse Ringer's oplossing. </li></ol></li><li> Embryo's verzamelen en staging <ol class="lalpha"><li> Volwassen zebravissen worden onderhouden, zoals beschreven 4, 5. </li><li> Scheid de ouder vis in statische kweken tanks paarsgewijze door een scheidingswand de avond voor de fokkerij. </li><li> Verwijder de verdeler na de kamer licht wordt ingeschakeld in de volgende ochtend. Laat de ouders om cross op 10-minuut intervallen van elk half uur. Scheiden de vissen na elke kruising. </li><li> Apart te houden van de embryo's van elke kruising in E3-medium bij 28 ° C. </li><li> Stage embryo's bij 10 tot 12 uur na de bevruchting (HPF) en de nieuwe tijdelijke onmiddellijk vóór versnijding op de specifieke tijdstippen, volgens vastgestelde criteria 1, 6. </li></ol></li></ol> Deel 2: Dissection - de hersenen verwijderen en blootstelling van de ogen een <ul><li> De procedures beschreven in dit gedeelte zijn gemeenschappelijk voor het ontleden van het netvlies (deel 3A) en RPE-aangesloten netvlies (deel 3B). </li><li> Alle fijne dissecties worden gedaan door een tip van de Dumont pincet en bijgestaan ​​door een ander paar Dumont forceps voor het positioneren van het weefsel. Een chemisch geëtst wolfraam naald kan worden gebruikt voor het fijnere manipulaties indien nodig. </li><li> Alle fijne ontledingen worden uitgevoerd op ~ 5-8x vergroting onder een microscoop SZX16 Olympus uitgerust met een 1X objectief of gelijkwaardig. </li><li> Behouden de embryo's in E3 medium in een bench top incubator bij 28 ° C naast de microscoop voor gemakkelijke toegang tot embryo tijdens de dissectie. </li><li> De microscoop stadium is opgewarmd tot 28 ° C door een thermo plaat aan de invloed van temperatuur schommelingen op genexpressie te minimaliseren. </li></ul><ol><li> Overdracht een embryo bij een bepaalde ontwikkelingsfase naar de Ringer-oplossing in een Falcon 60 X 15 mm cultuur plaat bereid zoals beschreven in deel 1 # 3. </li><li> Snijd het hoofd met een deel van de voorste romp al snel uit het lichaam. </li><li> Pin het achterste einde van dit weefsel op de cultuur plaat met de assisterende tang. </li><li> Open het hoofd op de dorsale zijde vanaf de voorste voorhoofd. </li><li> Verwijder de hersenen, zodat de mediale zijde van de ogen is blootgesteld en is naar boven gericht voor verdere manipulaties. </li></ol> Deel 3A: het netvlies dissectie een <ol><li> Bereid de embryo, zoals beschreven in deel 2. </li><li> Voorzichtig borstel de blootgestelde RPE aan de mediale zijde van het oog bal die naar boven wordt geconfronteerd met de punt van de tang tot een kleine opening aan het netvlies wordt gezien. </li><li> Ga verder met de poetsen en peeling actie tot aan de mediale zijde van het netvlies is bijna alle blootgesteld. Voorkom dat er krassen en ponsen de blootgestelde netvlies. </li><li> Aan de laterale RPE te verwijderen op het netvlies die nu naar beneden is gericht, dat de aanpak en de borstel onder een hoek van ongeveer 45 ° ten opzichte van de cultuur plaatoppervlak. </li><li> Verwijder de RPE dat is relatief stevig aan de ora serrata bevestigd door pinnen de vrijstaande gedeelte van de RPE op de cCULTUUR plaat voor dissectie, en til het netvlies zachtjes. </li><li> Rol het netvlies aan de onderkant van de cultuur schotel naar de sanering van de resterende RPE. <ol class="lalpha"><li> We hebben gemerkt dat deze specifieke Falcon polystyreen cultuur plaat een preferentiële hechting van RPE voor ongeveer 20 minuten heeft eens een embryo wordt verpletterd. Deze eigenschap wordt gebruikt voor het verwijderen van de RPE overblijfselen. Echter, de retinale cellen kleven aan het oppervlak, in mindere mate, die nauw kan worden ingezien onder hoge vergroting. Men moet een evenwicht vinden tussen de volledigheid van de RPE verwijderen en het netvlies integriteit. </li><li> De lens houdt zich vaak tot de cultuur plaat en los van het netvlies bij het walsen verkregen. Af en toe, is het noodzakelijk om de lens los te koppelen van een geëtst wolfraam naald met een wervelende actie op het lensoppervlak. </li></ol></li><li> Deze procedures kunnen succesvol te verwijderen RPE van het netvlies, zonder afbreuk te doen aan de integriteit van het weefsel. Dit wordt aangegeven door een goede algemene morfologie (Figuur 1B en B ') en histologie (Figuur 1B "), pijl in het bijzonder, het behoud van de extracellulaire matrix in tussen de afdrukband laag en de RPE is uitzonderlijk goed (Figuur 1B."; vergelijken met de histologie van het hele embryo (Figuur 1A ")). </li></ol> Deel 3B: RPE-aangesloten netvlies dissectie 3 <ol><li> Bereid de embryo, zoals beschreven in deel 2. </li><li> Pin het hoofd naar de cultuur plaat door de assistent tang. Til de ogen van de achterste laterale zijde en rol aan de voorste zijde. <ol class="lalpha"><li> De vermoedelijke vaatvlies en sclerale weefsel aan de buitenkant van de RPE-laag zijn relatief stevig bevestigd aan de huid en kan meestal worden afgepeld door rollen de ogen voorzichtig naar de anterieure zijde. </li></ol></li><li> Haal de lens met een wolfraam naald na de laterale zijde van het oog wordt blootgesteld en wanneer het oog is nog aan de huid. </li><li> Deze procedures met succes kan het behoud van de hele RPE laag met het netvlies. Vermoedelijke choroids en sclerale weefsel kan grotendeels worden verwijderd (figuur 1C, C 'en C "). </li></ol> Deel 4: Tissue monstername voor RNA werk <ol><li> De ontlede monsters kunnen worden verzameld in TRIzol in een RNase-vrij microfugebuis voor downstream-RNA karakterisering zoals eerder beschreven: 1. </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) en laterale (A ') dorsaal aanzicht van een zebravis larvale head op 52 hpf voor dissectie. (A ") De overeenkomstige histologische deel van de larvale hoofd in (A) &amp; (A '). (B) Laterale en (B'), dorsaal aanzicht van een ontleed netvlies bij 54 hpf. Het oppervlak van het netvlies intact was van beide laterale en dorsale uitzicht. (B ') De overeenkomstige histologische deel van het netvlies ontleed in (B) &amp; (B'). De structuur van het netvlies en retina lamineren was intact. In het bijzonder, de extracellulaire matrix tussen de fotoreceptor laag en RPE (A "was, pijlen) goed bewaard gebleven in de ontleed netvlies (B", pijlen). (C) laterale en (C ') mediaal aanzicht van een ontleed RPE-aangesloten netvlies op 52 hpf. RPE laag was intact en continu, die ook werd aangegeven door de histologische deel van de ontlede weefsel (C "). Het witte vlak in C 'is de oogzenuw (pijl). Voor histologie, weefselmonsters werden verzameld en gefixeerd in 4% paraformaldehyde. Plastic inbedding en snijden van deze monsters werden uitgevoerd zoals beschreven 3. Schaal bar = 50 pm.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Purdue Animal Care en gebruik Comite.

Microdissectie van de zebravis oogweefsels effectief kan krijgen intact netvlies en de RPE-aangesloten netvlies. Dit helpt aanzienlijk expressie studies met betrekking tot een specifieke oogweefsel (dat wil zeggen het netvlies of RPE). In feite hebben we met succes gebruik gemaakt van deze procedures om RNA-expressie profielen te verkrijgen van de hele retina 1 en RPE 3. Het nut van deze profielen wordt sterk ondersteund door onze recente identificatie van paden en gen-families die worden verstoord...

<table><tbody><tr><td>Draadloze stampermotor</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Gelijkstroomvoeding</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Elke DC-voeding zou werken. De specifieke spanning van een andere machine zal verder geoptimaliseerd moeten worden.</td></tr><tr><td>Wegwerpstamper &amp;microcentrifugebuis, 1,5 mL (DNase-, RNase- en pyrogeenvrij)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>Deze worden gebruikt voor het verzamelen van weefsel in TRIzol voor expressieanalyse.</td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet, Punten: 0,05 x 0,01 mm, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>Een fijne tipdimensie is wenselijk, maar is niet strikt vereist, aangezien de tip van tijd tot tijd mogelijk moet worden aangescherpt.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF pincet, punten: 0,025 x 0,005 mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>De afmeting van de fijne punt is wenselijk, maar niet strikt vastgelegd, aangezien de punt af en toe geslepen moet worden.</td></tr><tr><td>Falcon polystyreen kweekplaten, 60 X 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Deze platen worden gebruikt als dissectieplaten.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 stereomicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Elke stereomicroscoop is geschikt. In eerdere studies hebben wij een Leica stereomicroscoop gebruikt.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; zonder problemen. We gebruiken bovendien uitsluitend het 1X-objectief voor de dissectie, ook al is er een 2X-objectief geïnstalleerd. </td></tr><tr><td>Slijpsteen</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>Gebruik dit indien nodig om de punt van de pincet te slijpen</td></tr><tr><td>Thermoplaat</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Dit wordt gebruikt om de temperatuur van het weefsel tijdens de dissectie constant te houden en de invloed van temperatuurschommelingen op de genexpressie te minimaliseren. We hebben de gehele microscoop bovendien geplaatst in een geconditioneerde ruimte op 28°C.&amp;#x00B0;C tijdens dissectie in eerdere studies&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; met succes.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>wolfraamdraad, 0,015 inch diameter</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Houten applicator</td><td>Puritein</td><td>807</td><td>Dit wordt gebruikt voor het vasthouden van de chemisch geëtste wolfraamnaald.</td></tr></tbody></table>

microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebravis is een populair diermodel voor onderzoek op het oog ontwikkeling als gevolg van de snelle<em&gt; Ex utero</em&gt; Ontwikkeling en een goede vruchtbaarheid. Met 3 dagen na de bevruchting (DPF), zal de larven geven de eerste visuele reactie. Veel genen geïdentificeerd die een behoorlijke eye ontwikkeling controle, maar we zijn verre van een volledig begrip van de onderliggende genetische architectuur. Hele genoom gen expressie profilering is een nuttig hulpmiddel om genetische regelgeving netwerk toe te lichten voor de ogen ontwikkeling. Echter, de geringe omvang van de embryonale oog in zebravissen maakt het een uitdaging om het verkrijgen intact en pure eye weefsels voor expressie analyse. Bijvoorbeeld, de anterior-posterior lengte van het oog tussen dag 2 en 3 is slechts ongeveer 200-300 micrometer, terwijl de diameter van de lens is minder 100 micrometer. Ook de retinale pigment epitheel (RPE) ten grondslag liggen aan het netvlies is gewoon een single-layer epitheel. Terwijl de genexpressie profielen kunnen worden verkregen uit het hele embryo, zij niet nauwkeurig de expressie van deze weefsels. Dus zuiver weefsel moet worden verkregen voor een succesvolle gen expressie profilering van het oog ontwikkeling. Om dit probleem hebben we een aanpak ontwikkeld om intact netvlies en het netvlies met de RPE bevestigd 1-3 DPF, die een belangrijke stadia van het oog van morfogenese te dekken microdissect. Alle procedures kan gedaan worden met fijn pincet en algemene laboratorium levert onder standaard stereomicroscopen. Voor netvlies dissectie, is het single-layer RPE verwijderd en afgepeld door borstelen actie en de preferentiële hechting van de RPE overblijfselen aan het oppervlak van de cultuur plaat voor dissectie. Voor de RPE-aangesloten netvlies dissectie, is de hechting van RPE bij de dissectie plaat verwijderd voordat de dissectie, zodat de RPE volledig kan worden geconserveerd met het netvlies. Een zorgvuldige tillen actie van dit weefsel kan efficiënt scheiden van de vermoedelijke vaatvlies en de sclera. De lens kan worden verwijderd in beide gevallen door een chemisch geëtst wolfraam naald. Kortom, onze aanpak krijgen intact oog weefsels en is met succes gebruikt om weefsel-specifieke expressie profielen van zebravis netvlies studie<sup&gt; 1, 2</sup&gt; En retinale pigment epitheel<sup&gt; 3</sup&gt;.

Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo&#39;s.

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

De zebravis is een populair diermodel voor onderzoek naar oogontwikkeling vanwege de snelle ontwikkeling ex utero en de goede fecunditeit. Tegen 3 dagen na...

Deze video toont de microdissectie van het netvlies en het netvlies met vastgehecht retinaal pigmentepitheel, of RPE, van zebravissenembryo's één tot drie dagen na bevruchting. Alle procedures kunnen worden uitgevoerd met fijne pincetten en algemene laboratoriumbenodigdheden. Met behulp van standaard stereomicroscopen voor netvliesdissectie wordt de enkelvoudige laag RPE verwijderd en afgepeld door een borstelende beweging en de hechting van het RPE aan het oppervlak van de kweekplaat.Voor de dissectie van het netvlies met behoud van het RPE worden de adhesieve eigenschappen van de kweekplaat vóór de dissectie verwijderd door middel van embryonale verbrijzeling en wassing. Om het RPE intact te houden, worden het choroïd en de sclera vervolgens zorgvuldig door het wegtillen van dit weefsel efficiënt gescheiden van het aan het RPE gehechte netvlies, gevolgd door de verwijdering van de lens met een chemisch geëtste wolfraamnaald. Deze dissectiemethode maakt het mogelijk om intact netvliesweefsel te verkrijgen en is succesvol ingezet voor het bestuderen van weefselspecifieke RNA-expressie en profielen van het zebravisnetvlies en het retinaal pigmentepitheel.Hoi, ik ben Li Jang van het laboratorium van professor UFE Leon van de afdeling Biological Sciences aan Purdue University. Vandaag laten we u zien hoe u embryonaal oogweefsel van zebravis ontleedt. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het gennetwerk te bestuderen dat de ontwikkeling van het oog reguleert.Laten we beginnen. Acht. Bereid vóór de microdissectie de volgende oplossingen: E3-medium, gefilterde gesteriliseerde Ringer-oplossing en 5 N natriumhydroxide.Ets vervolgens de wolfraamnaalden chemisch. Plaats een klein bekerglas in een Petrischaal met klei om het hanteren van het bekerglas te vergemakkelijken en morsen van natriumhydroxide te voorkomen. Bevestig een standaard paperclip aan de zijkant van het bekerglas.Giet vijf normaal natriumhydroxide in het bekerglas totdat de paperclip in contact komt met het natriumhydroxide. Verbind de negatieve elektrode van een DC-stroomvoorziening met de paperclip en de positieve elektrode met één uiteinde van een kort stuk tungstendraad. Wikkel het andere uiteinde van de tungstendraad om een kleiballetje met een diameter van vier millimeter en dompel dit uiteinde in de natriumhydroxide-oplossing.Verhoog de spanning naar ongeveer drie volt en dip de draad gedurende één seconde op en neer in de natriumhydroxide-oplossing, met intervallen van ongeveer 10 minuten. De wolfraamdraad die aan natriumhydroxide is blootgesteld, zal geleidelijk dunner worden; wanneer de kleibal aan de andere kant van de draad die aan de positieve elektrode is bevestigd afvalt, zal de draad een scherpe naaldvorm hebben. Spoel de scherpe naald met Ringer-oplossing of E3 om zoutafzettingen te verwijderen en bevestig de naald met tape of een naaldhouder aan een houten applicator voor een eenvoudige hantering om embryo's voor dissectie voor te bereiden.Houd de volwassen super fish volgens standaardprotocollen op de avond vóór de voortplanting. Scheid de oudervissen in statische kweekbakken paarsgewijs met behulp van een scheidingsscherm. Verwijder het scherm nadat het kamerlicht de volgende ochtend is ingeschakeld en laat de ouders kruisen in intervallen van 10 minuten om de dertig minuten, waarbij de vissen na elke kruising weer worden gescheiden.Bewaar de embryo's die van elke kruising zijn verzameld afzonderlijk in E3-medium bij 28 °C. Bepaal het stadium van de embryo's 10 tot 12 uur na bevruchting en bepaal het stadium opnieuw vlak voor de dissectie op de specifieke tijdstippen. Gebruik Falcon 60 x 15 millimeter polystyreen kweekplaten voor de dissectie.Een nieuwe, ongebruikte plaat heeft een intrinsieke adhesie-eigenschap voor RPE-weefsel tot ongeveer 20 minuten en kan helpen bij het verwijderen van het RPE voor retina-dissecties. Als een retina met aangehecht RPE gewenst is, kan deze adhesie-eigenschap worden overwonnen door twee embryo's volledig te pletten in een kweekplaat met ringer-oplossing en deze 30 minuten vóór de dissectie te laten staan, gevolgd door uitgebreid wassen met verse ringer-oplossing vóór de dissectie. Alle fijne dissecties worden uitgevoerd bij een vergroting van ongeveer vijf tot acht x op een Olympus SC X 16-microscoop met een one x objectief.Met Dumont-pincetten of een chemisch geëtseerde wolfraamnaald wordt de microscooptafel opgewarmd tot 28 °C. Om de invloed van temperatuurschommelingen bij de start van de dissectie van het netvlies te minimaliseren, wordt een embryo in een specifieke ontwikkelingsfase overgebracht naar vijf milliliter Ringer-oplossing in een Falcon culturenplaat van 60 bij 15 mm, voorbereid zoals beschreven voor netvliesdissectie zonder RRPE. Snijd de kop en een deel van de anterieure romp af met de scherpe punt van de pincet en verwijder snel het lichaam van de zebravis. Zet vervolgens het posterieure uiteinde van het kop-rompsegment vast op een culturenplaat. Open met behulp van de pincet de kop aan de dorsale zijde, beginnend bij het voorhoofd.Verwijder de hersenen zodat de mediale zijde van de ogen is blootgelegd en naar boven is gericht voor verdere manipulaties. Om het netvlies te dissekeren, gebruikt u de punt van de pincet om het blootgelegde RPE aan de mediale zijde van het oog, die naar boven is gericht, voorzichtig weg te borstelen tot er een kleine opening naar het netvlies zichtbaar is. Zet de borstel- en pelbeweging voort tot de mediale zijde van het netvlies bijna volledig is blootgelegd.Voorkom dat de blootgestelde retina wordt bekrast of doorboord bij het verwijderen van het laterale RPE op de retina van het oog dat naar de kweekschaal is gericht. Houd een hoek van ongeveer 45 graden aan ten opzichte van het oppervlak van de kweekplaat en strijk over het oog met de pincet. Verwijder het RPE dat relatief stevig aan de ora serrata vastzit door het losgekomen deel van het RPE tegen de kweekplaat vast te pinnen voor dissectie.Til vervolgens het netvlies voorzichtig op om het resterende RPE te verwijderen en verwijder de lens door gebruik te maken van de adhesieve eigenschappen van de kweekschaal voor hechting. Wees voorzichtig om de retinale cellen niet te beschadigen, aangezien deze ook licht aan het oppervlak van de schaal zullen hechten. Als de lens niet loslaat door te rollen, gebruik dan een geëtseerde wolfraamnaald met een draaiende beweging op het lensoppervlak.Voor het starten van de dissectie van de retina met behoud van het RPE, gebruik een Falcon-kweekplaat van 60 bij 15 millimeter die is voorbereid zoals beschreven voor een RPE-gebonden retinaldissectie. Verplaats een embryo in een specifiek ontwikkelingsstadium naar vijf milliliter ringeroplossing. Snijd de kop en een deel van de anterior trunk af.Verwijder snel het lichaam van de zebravis, zoals eerder beschreven. Zet het posterieure uiteinde van het hoofd-rompsectie vast op een kweekplaat. Open met de assistentiepincet het hoofd aan de dorsale zijde, beginnend bij het voorhoofd aan de anterieure zijde.Verwijder de hersenen zodat de mediale zijde van de ogen is blootgesteld en naar boven is gericht. Til bij verdere manipulaties met een pincet het oog voorzichtig aan de posterolaterale zijde op en rol het naar de anteriore zijde. Het choroïd- en scleraweefsel aan de buitenkant van de RPE-laag is relatief stevig aan de huid gehecht en kan grotendeels worden afgepeld door het oog voorzichtig naar de anteriore zijde te rollen.Verwijder de lens met de wolfraamnaald nadat de laterale zijde van het oog is blootgelegd en terwijl het oog nog aan de huid vastzit voor de dissectie van het retina. Zonder RPE en zonder het aan het RPE gehechte retina kunnen de gedissecteerde monsters in triol in een RNA-microtube worden verzameld voor verdere RNA-karakterisering.Hier wordt een succesvolle dissectie van het netvlies zonder RPE getoond, waarbij de integriteit van het netvlies behouden is gebleven, zoals blijkt uit het intacte oppervlak van het netvlies. De overeenkomstige histologische sectie laat eveneens zien dat de architectuur van het netvlies zeer goed behouden is. In het bijzonder is het behoud van de extracellulaire matrix tussen de fotoreceptorlaag en het RPE uitzonderlijk goed.Een succesvolle dissectie van de retina met behoud van het RPE wordt gekenmerkt door een intacte en continue RPE-laag. De overeenkomstige histologische sectie laat zien dat zowel de retinalcellen als de RPE-cellen in goede conditie zijn. Het totale RNA dat uit de gedissecteerde retinae is geëxtraheerd, is van hoge kwaliteit.Dit wordt aangetoond door het electroferogram en het gelbeeld verkregen uit de bioanalyzer-analyse. De basislijn is vlak en de 18 s en 28 s ribosomale pieken zijn intact. Het RNA-integriteitsgetal is doorgaans groter dan 9,8.We hebben zojuist de microdissectieprocedures gedemonstreerd voor het verkrijgen van het embryonale netvlies van zebravis met en zonder RPE. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de meest kritische stappen bij de dissectie van het netvlies de borstelende beweging met de punt van de pincetten en het oprollen van het weefsel zijn. Voor het verwijderen van RPE-resten hebben we vastgesteld dat het plaatsen van de ellebogen op een verstelbare armsteun van uw stoel tijdens de dissectie de handbewegingen aanzienlijk kan stabiliseren.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

microdissection-of-zebrafish-embryonic-eye-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Lens ontwikkeling houdt interacties met andere weefsels. Verschillende zebravis oog mutanten worden gekenmerkt door een abnormaal kleine lens formaat. Hier laten we zien een lens transplantatie experiment om te bepalen of dit fenotype is te wijten aan intrinsieke oorzaken of defecte interacties met weefsels die de lens omringen.

Lens transplantatie in de zebravis en de toepassing ervan in de Analyse van Eye Mutanten

Deze video beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om volwassen en larvale zebravislenzen te ontleden om corticale lensmorfologie en structurele integriteit van de lens hechtingen te analyseren.

Ooglensdissectie: een techniek om zebravislensmorfologie te observeren

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

Hier bespreken we een methode-protocol waarmee een gemakkelijke analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën als een snel uitlezing in instellingen van lange termijn vasculaire pathologieën gekoppeld aan neoangiogenesis en structurele veranderingen.

Bestuderen van Diabetes door de ogen van een vis: Microdissection, visualisatie en analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal therapieën

Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie), een onlangs geïdentificeerd, evolutionair geconserveerd structuur in de gewervelde ogen. Met behulp van zebravis larven, aantonen we technieken die nodig zijn ter specificatie van de factoren die aan de vorming en de sluiting van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie bijdragen).

Visualisatie van de Superior oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) tijdens Danio rerio embryogenese

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van...

Oculaire morfogenese visualiseren door Lightsheet Microscopie met behulp van rx3:GFP Transgene Zebravis

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Leer microdissectie van zebravisnetvlies met en zonder retinale pigmentepitheel (RPE) bij embryo's van één tot drie dagen na bevruchting. Deze methode behoudt intacte weefsels voor RNA-expressieonderzoek.

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Meer video's verkennen