Waarom is trypaanblauw-uitsluiting belangrijk voor de kwantificering van T-ALL-cellen?

Trypaanblauw-uitsluiting maakt discriminatie tussen levende en dode tumorcellen mogelijk op basis van membraanintegriteit, wat een kwantitatieve maat geeft van levensvatbare cellen voor assay-inputs. Deze meting ondersteunt betrouwbare celtelling via een hemocytometer, wat essentieel is voor het normaliseren van stroomafwaartse experimentele condities. Een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid garandeert dat alleen functionele T-ALL-cellen worden gebruikt in screening- of validatiestudies.

Hoe draagt het isoleren van GFP-gelabelde T-ALL-cellen bij aan de validatie van targets in leukemieonderzoek?

Het isoleren van GFP-gelabelde T-ALL-cellen maakt directe visualisatie en zuivering van tumorcellen uit zebravissen mogelijk, waardoor contaminatie door niet-tumorpopulaties wordt verminderd. Deze gezuiverde celpopulatie maakt specifieke analyse van leukemie-geassocieerde pathways en targets mogelijk zonder interferentie van gezonde lymfocyten. De methode verhoogt zo de betrouwbaarheid van het target door een ziekte-verrijkt systeem te bieden voor mechanistische risicoreductie.

Welke rol speelt het wassen van de lichaamsholte met heparine-oplossing bij de isolatie van T-ALL-cellen?

Het wassen van de lichaamsholte met heparine-oplossing verwijdert overtollige rode bloedcellen die het tumorcelmonster kunnen contamineren en downstream-analyses kunnen verstoren. Deze stap verbetert de zuiverheid van het monster door het achtergrondsignaal en cellulair debris tijdens fluorescentie-gebaseerde celcollectie te verminderen. Schonere monsters verhogen de betrouwbaarheid van trypaanblauw-kleuring en de kwantificatie van levensvatbare cellen.

Waarom wordt het aanbevolen om de cel-suspensie door een 40 μm mesh te filteren vóór het tellen?

Filtratie door een 40 μm mesh ontbindt celklonten en verwijdert debris, wat een single-cell suspensie garandeert voor nauwkeurige telling met de hemocytometer. Deze stap voorkomt overschatting van de celdichtheid door aggregaten en verbetert de reproduceerbaarheid tussen replica's. Een uniforme suspensie is cruciaal voor het verkrijgen van precieze, kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele in celgebaseerde assays.

Hoe beïnvloedt de reproduceerbaarheid van T-ALL-celisolatie de cross-functionele samenwerking bij het ontdekken van geneesmiddelen?

Reproduceerbare isolatie van levensvatbare T-ALL-cellen maakt consistente assay-inputs mogelijk voor biologie-, screening- en analyseteams, waardoor de variabiliteit in experimentele resultaten wordt verminderd. Gestandaardiseerde protocollen zorgen ervoor dat de gegenereerde gegevens vergelijkbaar zijn tussen studies en locaties, wat betrouwbare beslissingen bij de prioritering van targets ondersteunt. Deze consistentie versterkt de translationele continuïteit door een betrouwbare bron van ziekterelevante cellen te bieden voor preklinische evaluatie.

Fluorescently Labeled T-ALL Cells Isolation: A Method to Isolate T-ALL Cells from Adult Zebrafish

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kankeronderzoek

0 weergaven • 4:43 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- T-cell acute lymphoblastic leukemia, or T-ALL, is a type of cancer that occurs when lymphocytes fail to mature and remain as immature cells called lymphoblasts. These abnormal cells are ineffective in fighting infection. As these immature cells divide rapidly, they outnumber healthy blood cells and can travel to the organs such as the spleen, liver, and CNS.

Tumors in zebrafish are similar to those formed in humans. Therefore, zebrafish is the preferred model to generate T-ALL tumor cells.

Begin by selecting the transformed fishes that exhibit fluorescent signals, indicating the spread of tumor cells. Remove the euthanized fish's head and wash the body cavity with heparin solution to remove excess red blood cells. Now, inject a suitable buffer into the body cavity. Apply gentle pressure from outside and collect the buffer containing tumor cells in a microfuge tube.

Stain the cells with trypan blue and observe them under a microscope. Live tumor cells appear fluorescent and colorless when stained with trypan blue, as the negatively charged cell membrane excludes the negative trypan blue from entering inside the cell. Trypan blue enters dead cells through the porous membrane, staining them blue. In the following protocol, we will isolate GFP-labeled T-ALL tumor cells from adult zebrafish.

- Prepare 20 milliliters of 10% heat-inactivated FBS in 0.9X PBS. Add 1 milliliter of the FBS/PBS solution to a vial of a heparin sodium salt containing 300 units of the anticoagulant. Then, using an epifluorescent microscope, select fish in which tumor cells have invaded 50% of the body or fish that are identified as having difficulty eating or swimming.

Euthanize the fish by transferring it to a solution of 1 to 2 milligrams per milliliter tricaine in fish water. Observe the animal for gill movement and heartbeat to confirm euthanasia.

After removing the head of the fish, inject with a pipette, 100 microliters of heparin solution into its body cavity to remove excess red blood cells. Aspirate all liquid that pours out and pipette it into a 1.5 millimeter microcentrifuge tube. Then, using fresh pipette tips, wash the body cavity two more times or until the washing solution does not contain any blood and discard the liquid collected from all washes.

To collect leukemia cells, inject 100 microliters of FBS-PBS solution into the prewashed body cavity. Under a dissecting microscope, apply gentle pressure to the body of the fish with a pipette tip to force out the tumor cells. Collect the released liquid into a 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Repeat isolation until most of the tumor cells are harvested.

Collect all cells in the same 1.5 milliliter microcentrifuge tube and keep the obtained suspension at room temperature. Then mix the isolated tumor cells by gently pipetting to dissociate cell clumps. Filter the cell suspension through a 40 micrometer mesh filter and wash the filter one to two times with 100 microliters of FBS-PBS.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Fluorescently Labeled T-ALL Cells Isolation: A Method to Isolate T-ALL Cells from Adult Zebrafish

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschapsgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie

Strategische toepassingen in BioPharma R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & assay-ontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van pijplijn & workflow

Operationele impact en impact op de organisatie

Overwegingen voor de implementatie

Veelgestelde vragen over biofarmaceutica

Het kwantificeren van de Frequentie van Tumor voortplantende cellen met behulp van beperkte verdunning Cell Transplantation in syngene zebravis

Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie

Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

Side Population Assay: A Method to Isolate Side Population of Tumor Cells from Zebrafish

Brain Cell Isolation from Zebrafish Larvae: A Technique to Obtain Intact Neurons, Macrophages, and Microglia from Zebrafish Brain Tissue

Microglia Isolation by Immunostaining Coupled Cell Sorting: An Immunostaining Method to Isolate Microglia from Zebrafish Brain Cells Using Fluorescent Activated Cell Sorting

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's

Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen