Name: Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Leer primaire fibroblastculturen isoleren uit huid- en longweefsel van wilde knaagdieren met behulp van collageenasedigestie. Dit protocol levert tot 10 miljoen cellen per cm² weefsel en ondersteunt vergelijkend celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. Steven Austad voor het verstrekken van ons met de eerste versie van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH en de Ellison Medical Foundation om VG en AS

1. Voordat u begint <ol><li> Steriliseren schaar en pincet met 70% ethanol. </li><li> Plaats kleine magneetroerder in een 30 ml beker, deksel met twee lagen folie en autoclaaf. </li><li> Bereid een 28 Wunsch eenheden / ml stockoplossing van Liberase Blendzyme 3 in steriel water. Maak 0,5 ml porties en invriezen bij -20 ° C. Dooi een nieuwe hoeveelheid voor elk gebruik. De oplossing kan verschijnen bewolkt na het ontdooien. Vortex de oplossing totdat duidelijk wordt. </li><li> Warming-up van de cel cultuur media. </li></ol> 2. Dier Monstervoorbereiding Let op: wilde dieren kunnen ziekteverwekkers bevatten, zoals een hondsdolheid virus. Altijd bewust zijn van scherpe voorwerpen te openen. <ol><li> Euthanaseren het dier en de plaats van het karkas bij 4 ° C. Het beste is om het karkas direct gebruiken echter, wanneer dit niet praktisch is, zoals wanneer de dieren worden verzameld in het veld, kan de karkassen worden gebruikt binnen 24 uur. Na 24 uur de cel opbrengst daalt. </li><li> Ontleden het dier in de chirurgische suite of in de chemische kap (niet in weefselkweek kap). </li><li> Oksels gebied is een handige site om de huid monsters te verzamelen als oksels huid is dunner, bevat minder vet, en de vacht wordt minder dicht. Reinig de incisie site met 70% ethanol. Zorg ervoor dat de vacht is doordrenkt met ethanol. </li><li> Scheren de vacht rondom de incisie site met een scherp scalpel. Shave een groter gebied dan de gewenste incisie site. Probeer te bezuinigingen op de huid te minimaliseren. Spray het gebied met 70% ethanol en laat het drogen. </li><li> Om een skin monster accijnzen te verzamelen een fragment van ongeveer 1 cm 2. Knijp de huid met weefsel tang, en snijd met een schaar. Probeer niet om de vetlaag gesneden met de huid, als vet interfereert met collagenase spijsvertering. Voor het verzamelen van de longen monsters, was de borst met 70% ethanol, en open de huid op de borst met een schaar door het maken van een T-vormige incisie en trekken elkaar de flappen van de huid. Was de geopende spier gebied met 70% ethanol en laat drogen. Knip de ribbenkast met steriele pincet en een schaar (gebruik bot kotters voor grotere dieren). Gebruik steriele technieken om te voorkomen dat vervuilende interne organen. Raak de inwendige organen met instrumenten die de vacht van dieren aangeraakt. Snijd long fragmenten van ongeveer 1 cm 2 met behulp van steriele pincet en een schaar. </li><li> Plaats weefselfragmenten in 50 ml buizen met steriel PBS om uitdrogen te voorkomen. </li><li> Was de buitenkant van de 50 ml buizen met tissue fragmenten met ethanol, en breng ze naar de weefselkweek kap. </li><li> Gooi van dierlijke karkas. </li></ol> 3. Extraheren Cellen <ol><li> Breng de weefsel fragmenten in een 10 cm schotel met behulp van weefselkweek steriel scalpel. Niet overdragen teveel PBS met het monster. </li><li> Snijd de weefsel in ~ 1 mm stukken met behulp van twee scalpels. Gebruik twee bladen met behulp van een schaar actie begint bij het centrum en trekken elkaar. Houd het weefsel gebald omhoog, niet stuk gesneden door stuk. Wanneer het snijden voldoende is de huid lijkt op stopverf, zal het niet te splitsen in stukken, maar zal strekken dun. Het longweefsel is makkelijker te snijden, en het zal apart in kleine stukjes. </li><li> Met behulp van een scalpel, de overdracht van de gesneden weefsel in steriele 30 ml bekerglas met steriele roer bar. Was de plaat wordt gebruikt voor het snijden van weefsel met 10 ml DMEM/F12 media met 0,14 Wunsch eenheden / ml Liberase Blendzyme 3, en 1x antibiotica / antimycotica, en voeg de oplossing voor de 30 ml bekerglas met weefsel fragmenten. </li><li> Dek het bekerglas af met steriele folie, en incuberen bij 37 ° C, al roerend langzaam, gedurende 30 tot 90 minuten. De lengte van de incubatietijd is afhankelijk van de soort en weefseltype. Zorg ervoor dat u over-verteren het weefsel. De beste rendementen worden verkregen wanneer weefselfragmenten zijn nog steeds aanwezig aan het eind van de spijsvertering. Huid langer duurt om te verteren dan de long. Huid van grote dieren langer duurt om te verteren. Controleer de spijsvertering na 30 min, en daarna elke 10 minuten. Wanneer de huid spijsvertering is voltooid, de media troebel en de huid fragmenten van elkaar te scheiden, en de randen van de stukken worden "fuzzy". Long spijsvertering moet worden gestopt wanneer long fragmenten van kleur veranderen van rood naar wit en begin vormen van plakkerige vezels. </li><li> Pipet de oplossing die weefsel fragmenten op en neer om de klonten te breken. Breng de oplossing om steriele 50 ml buis. Als de fragmenten bewegen makkelijk door de 10 mL pipet te snijden en de spijsvertering is goed gedaan. Spoel de beker drie keer met 10 ml warm DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotica / antimycotica en voeg de media om de 50 ml buis met weefsel fragmenten. Sluit de 50 ml buis en meng door inversie een paar keer. De FBS in de media zal stoppen Liberase spijsvertering. </li><li> Draaien op 524 g in een swingende emmer weefselkweek centrifuge gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 10 ml warm DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotische / antimycotische. Pipet de suspensie metmaximale kracht om het weefsel stukken breken. </li><li> Voeg nog eens 30 ml DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotica / antimycotica, mix en centrifugeer bij 524 g in een swingende emmer weefselkweek centrifuge gedurende 5 minuten. Herhaal dit nog een keer om de sporen van Liberase te verwijderen. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM/F12 media met 15% FBS, 1X antibiotica / antimycotica en over te dragen aan een 10 cm weefselkweek schotel en plaats in een weefselkweek incubator bij 37 ° C, 5% CO 2, 3% O 2 . </li><li> Controleer of de platen elke dag voor fibroblasten en media kleur. Als de isolatie is gelukt, fibroblasten kruipen van het weefsel fragmenten en hechten aan de plaat (figuur 1). De fibroblasten beginnen met weefsel fragmenten af ​​te sluiten binnen 2-5 dagen. </li><li> Als de media van kleur verandert naar geel, geeft dit aan mogelijke verontreiniging of de overbevolking van de cellen. Onderzoek de platen onder de microscoop bij een hoge vergrotingsfactor. Als bacteriën, schimmels of wormen aanwezig zijn gooi de platen (dit is zelden een probleem met proefdieren, maar kan optreden wanneer de monsters worden genomen uit het wild). Als er geen verontreiniging aanwezig is, maar de media van kleur veranderd, wordt dit veroorzaakt door een te veel cellen of weefsel te veel fragmenten in dezelfde schotel. Als meer dan 60% van de plaat is bedekt met aangesloten fibroblasten, wijzigt u de media op de plaat en breng het weefsel fragmenten naar een nieuwe plaat met de nieuwe media. Als niet veel fibroblasten aan de plaat, verander de media en de splitsing van de stukjes weefsel een 2-4 platen. </li><li> Na 7 dagen, als de media niet was eerder veranderd, veranderen de media en overdracht van het weefsel fragmenten naar een nieuwe plaat met nieuwe media. </li><li> Incubeer de cellen en weefsels fragmenten voor een extra 7 dagen. Op dag 14 alle levensvatbare fibroblasten hebben verlaten het weefsel fragmenten. </li><li> Na 14 dagen vanaf het begin van de cel isolatie, gooi de oude media en weefsel fragmenten, de oogst van de cellen en de plaat ze op een nieuwe plaat op 5x10 5 cellen / plaat EMEM met 15% FBS, 1X penicilline / streptomycine, niet-essentiële aminozuren , en natrium pyruvaat. EMEM media zal ondersteuning van de groei van fibroblasten alleen en andere celtypes zullen sterven of stoppen prolifererende. </li><li> Nadat de cellen te bereiken 80-90% confluentie, te bevriezen een hoeveelheid van cellen voor toekomstig gebruik. </li><li> Ga door het kweken van de cellen door ze te splitsen in 5x10 5 cellen / plaat wanneer de cellen bereikt 80-90% confluentie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Normale fibroblasten zijn grote cellen met prominente uitsteeksels (lamellipodia) (figuur 2). Fibroblasten groeien in een monolaag. Een gezonde groeiende cultuur bevat 1-10% cellen in M ​​stadium, erkend als afgerond cellen verhoogd over het oppervlak van de plaat, maar niet los van de plaat (figuur 3). Typisch, een 10 cm schotel gezaaid met 5x10 5 cellen wordt confluent in 3-4 dagen. De verdubbelingstijd verschilt sterk tussen soorten, en groter kan zijn voor een deel van de langlevende knaagdieren 1. Wanneer cellen een bord ze proliferatie arrestatie in G1-fase te vullen. Typische samenvloeiing plaat van fibroblasten bevat een dicht opeengepakte laag van cellen (figuur 4). Wanneer de cellen 90% confluentie bereiken ze klaar zijn voor splitsing. Indien gewenst, kunnen de cellen worden gehandhaafd op een aangehouden samenvloeiing plaat voor langere tijd met de reguliere media veranderingen (of twee keer per week). <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Fibroblast isolatie van de huid van muizen (A) en longen (B). De media werd veranderd verwijderen voordat losse cellen en puin aan het nemen van de foto's op dag 7. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Muis longfibroblasten. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een veld van muis fibroblasten met cellen in de M-fase, gefotografeerd bij 10X vergroting. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Een samenvloeiing plaat van muizen fibroblasten, gefotografeerd bij 10X vergroting.

<ol><li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li>
<li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li>
</ol>

Normale primaire fibroblasten bieden een uitstekend alternatief voor gevestigde kanker cellijnen in biologisch onderzoek. Een belangrijk voordeel van fibroblasten is dat ze niet te voeren mutaties in oncogenen en tumor onderdrukkers en onderhouden van intacte cel-cyclus controleposten. Dit maakt normale fibroblasten een voorkeur voor de studies van de celcyclus, DNA reparatie, en apoptose. De hier beschreven protocol voorziet in een eenvoudig recept voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblasten. Dit pro...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12-medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Bovine Serum (FBS), Gekwalificeerd</td><td>Invitrogen</td><td>01437-036</td><td>Het gekwalificeerde serum was vooraf getest om goede groeiondersteuning te bieden voor primaire fibroblasten.</td></tr><tr><td>Antibioticum/Antimycoticum</td><td>Invitrogen</td><td>15420-096</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Liberase TM Research Grade&lt;/strong&gt;</td><td>Roche</td><td>&lt;strong&gt;05401127001&lt;/strong&gt;</td><td>Vervangend enzym.</td></tr><tr><td colspan="4">Een opmerking van de auteurs: Sinds Roche Liberase Blendzyme 3 (11814184001) heeft stopgezet, bevelen zij aan om in plaats daarvan Liberase TM Research Grade medium Thermolysin te gebruiken (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100 mg). Wij zijn succesvol overgestapt op dit enzym zonder problemen.</td></tr><tr><td>EMEM-medium</td><td>ATCC</td><td>30-203</td><td>Het EMEM-medium van ATCC bevat al niet-essentiële aminozuren en natriumpyruvaat.</td></tr><tr><td> disposable, steriel scalpel #21 met vlijmscherpe rand</td><td>Diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Three Gas Control incubator</td><td>Forma of Heraeus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tot vaststelling van primaire adult fibroblast culturen van knaagdieren

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Het belang van het gebruik van primaire cellen, in plaats van kanker cellijnen, voor biologisch onderzoek wordt steeds alom erkend. Primaire cellen hebben de voorkeur in studies van de controle van de celcyclus, apoptose, en DNA-herstel, zoals kankercellen te voeren mutaties in genen die betrokken zijn bij deze processen. Primaire cellen kunnen niet voor onbepaalde tijd als gevolg van het ontstaan ​​van replicatieve veroudering of aneuploidization worden gekweekt. Vandaar, nieuwe culturen moeten regelmatig worden vastgesteld. De procedure voor het isoleren van embryonale fibroblasten knaagdier is goed ingeburgerd, maar het isoleren van volwassen fibroblast culturen vaak een uitdaging. Volwassen knaagdieren fibroblasten geïsoleerd van muismodellen van de menselijke ziekte kan een voorkeur controle zijn wanneer ze te vergelijken met fibroblasten van menselijke patiënten. Bovendien, volwassen fibroblasten zijn de enige beschikbare materiaal bij het werken met wilde knaagdieren, waar zwangere vrouwen niet gemakkelijk kan worden verkregen. Hier hebben we een protocol voor het kweken van volwassen fibroblasten uit knaagdier huid en longen. We gebruikten deze procedure met succes te fibroblasten isoleren van meer dan twintig soorten knaagdieren van laboratorium muizen en ratten aan wilde knaagdieren zoals bever, stekelvarken, en eekhoorn.

Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblast culturen van de huid en longweefsel van wilde knaagdieren.

Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

Het belang van het gebruik van primaire cellen, in plaats van kankercellijnen, voor biologische studies wordt in toenemende mate erkend. Primaire cellen hebben de voorkeur...

Het isoleren van levensvatbare fibroblasten uit dierlijke huid en longweefsel begint met het dissecteren van huid- en longfragmenten uit een dierlijk karkas. Met behulp van steriele technieken wordt het weefsel in kleine fragmenten gesneden en gedigesteerd met collagenase. De gedigesteerde weefselfragmenten worden vervolgens geïncubeerd in rijke kweekmedia totdat de fibroblasten uit het weefsel treden.Ten slotte worden de weefselstukjes verwijderd en wordt het rijke medium vervangen door fibroblastengroeimedium. Na het splitsen van de cellen worden aliquota cellen ingevroren voor toekomstig gebruik. Uiteindelijk levert een huid- of longweefselfragment van één vierkante centimeter tot passage 10^7 fibroblasten op.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden waarbij geen enzymatische digestie van weefsel wordt gebruikt, is dat het een groot aantal cellen oplevert uit een verscheidenheid aan dierspecimens. Deze methode zal onderzoekers in het veld van de vergelijkende biologie helpen om efficiënt bloedcellen te isoleren uit een breed scala aan zoogdiersoorten. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor weefseldiges

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we een typische manier om te isoleren en cultuur volwassen ratten hart myocyten. Collagenase en protease worden gebruikt voor het verteren en te isoleren single myocyten. Myocyten gekweekte volgen van dit protocol voldoen aan de meeste eisen experiment.

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Mechanische krachten spelen een belangrijke rol in de longen de ontwikkeling en longschade. Hier wordt beschrijven een werkwijze voor knaagdier foetale long type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en blootstellen aan mechanische stimulatie met...

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

This video describes the rapid method to isolate and culture the melanocytes and fibroblast simultaneously from the postnatal mouse pup’s skin. These cells can be maintained and manipulated in vitro to study skin cell biology, wound healing, and melanoma.

Rapid Culturing of Primary Murine Melanocytes and Fibroblasts: Isolating Melanocytes and Fibroblasts from Whole Murine Skin Sample

Wij rapporteren een methode om naïeve multipotente huid-afgeleide precursor (SKP) cellen uit primaire menselijke fibroblast culturen te isoleren. We laten zien dat deze SKPs afgeleid van fibroblastculturen delen dezelfde stamcel eigenschappen aan deze die direct afgeleid van de menselijke huid biopten. Deze cellen brengen de neurale marker, nestin naast multipotente merkers zoals OCT4 en Nanog.

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

We presenteren een protocol om primaire culturen van muis- en menselijke slokdarmstroomacellen met een myofibroblast-fenotype te genereren. De gekweekte cellen hebben een spindelvormige morfologie, drukken α-SMA en vimentin uit en missen epitheliale, hematopoëtische en endotheelcel-oppervlaktemarkers. Gekarakteriseerde stromacellen kunnen worden gebruikt in functionele studies van epitheel-stroma interacties.

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.

Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Leer primaire fibroblastculturen isoleren uit huid- en longweefsel van wilde knaagdieren met behulp van collageenasedigestie. Dit protocol levert tot 10 miljoen cellen per cm² weefsel en ondersteunt vergelijkend celbiologisch onderzoek.

Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

Meer video's verkennen