Laser Microdissection: A Technique to Isolate Invading Colorectal Cancer cells from a 3D Organotypic Culture Model
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 3:53 min • April 30th, 2023
- 3D organotypic models of colorectal cancer are in-vitro cultures engineered to mimic in-vivo tumor microenvironments. The culture often contains stromal cells, like fibroblasts, co-cultured with colorectal cancer epithelial cells, in a suitable extracellular matrix microenvironment.
In established cultures, tumor cells with metastatic potential invade the extracellular matrix. To isolate these invading cells, first, treat the organotypic model with formaldehyde to fix cells and extracellular matrix. Incubate with alcohol to dehydrate the sample.
Next, embed in liquid paraffin wax to generate a tissue block. Use an ultramicrotome to obtain thinly sliced sections. Mount the sections onto an appropriate glass slide.
Add Xylene to deparaffinize the sections. Sequentially, incubate the sections in decreasing concentrations of ethanol to rehydrate samples.
Treat with Cresyl Violet to stain and differentiate colorectal cancer cells from the microenvironment. Place the stained glass slide face down on the microscope stage. Using appropriate software, identify the cells to be microdissected and delineate the borders. Fire the laser to cut the highlighted section and collect the microdissected portion.
In the following protocol, we will show the isolation of colorectal cancer cells from a 3D organotypic co-culture model by laser microdissection.
- Remove the whole organotypic, including nylon sheet, from the well and place it on cling film. Bisect the organotypic and nylon sheet using a clean disposable scalpel and fix both halves in formaldehyde for 24 hours at room temperature. Replace formaldehyde with 70% ethanol after 24 hours and leave overnight prior to embedding in paraffin, sectioning, and staining.
To perform laser microdissection, first, section the organotypic to 10-micron thickness onto membrane-mounted slides. After treating the sections as described in the text protocol, prepare to conduct laser microdissection using the chosen platform.
Place the glass slide with the stained section to be microdissected face down on the microscope stage. Mount a 0.5 milliliter microcentrifuge tube into the collection cassette and add 50 microliters of cell lysis buffer to the cap into which microdissected tissue will collect. Under direct vision, use the joystick to identify the tissue of interest, and using the software interface, annotate the stained organic section, highlighting cells to be microdissected at the tumor invasion front.
Instruct the laser to fire, which should both cut out the highlighted section and propel the microdissected tissue into the cap of the microcentrifuge tube. Proceed to process samples by an appropriate method to extract the analyte of interest.
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van colorectale kankercellen uit een 3D organotypisch co-culturemodel met behulp van laser-microdissectie. De methode is erop gericht de tumoromgeving na te bootsen en de bestudering van het gedrag van kankercellen te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- 3D organotypische modellen bootsen in-vivo tumuromgevingen na.
- Co-cultuur met stromale cellen vergroot de relevantie van het model.
- Lasermicrodissectie maakt precieze isolatie van specifieke cellen mogelijk.
- Inzicht in tumorinvasie is cruciaal voor kankeronderzoek.
Doel van de studie
- Om colorectale kankercellen te isoleren uit een complex co-culturemodel.
- Om het metastatische potentieel van kankercellen te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van tumormicro-omgevingen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van 3D organotypische culturen met kankercellen en stromale cellen.
- Fixatie en inbedding van monsters in paraffine.
- Snijden van weefselblokken in dunne plakjes voor analyse.
- Gebruik van laser-microdissectie om specifieke cellen te isoleren.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van colorectale kankercellen uit het model.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het bestuderen van tumorinvasie.
- Identificatie van belangrijke cellulaire interacties binnen de micro-omgeving.
- Voorziening van een protocol dat kan worden aangepast voor andere kankertypes.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde studie naar het gedrag van kankercellen in een relevante context mogelijk.
- Laser-microdissectie is een waardevolle tool voor kankeronderzoek.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op de bevindingen om therapeutische doelwitten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Laser-microdissectie van 3D organotypische colorectale kankermodellen maakt de precieze isolatie van invaderende tumorcellen binnen een fysiologisch relevante micro-omgeving mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt de mechanistische risicoreductie en doelwitvalidatie bij het invasiefront, een kritiek omslagpunt voor oncologieportfolio's. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen voor downstream moleculaire profilering en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van interacties tussen kanker en stroma mogelijk in een bijna-fysiologische 3D-context.
- Ondersteunt functionele target-validatie door cellen met invasieve fenotypes te isoleren.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door onderscheid te maken tussen invasieve en niet-invasieve populaties.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van targets die gekoppeld zijn aan metastatisch potentieel.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische monsters voor voor downstream moleculaire en fenotypische assays.
- Garandeert reproduceerbaarheid en standaardisatie door het isoleren van gedefinieerde celpopulaties.
- Maakt kwantitatieve analyse van invasie-gerelateerde biomarkers in een gecontroleerd systeem mogelijk.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van kandidaatverbindingen die gericht zijn op invasiemechanismen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in-vitro bevindingen met ziekte-relevante invasieprocessen die in vivo zijn waargenomen.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van invasiedoelen.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van moleculaire profilering van invasieve cellen.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers voor klinische ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen targetvalidatie en de ontwikkeling van translationele biomarkers in oncologische pijplijnen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypotheseonderzoek naar invasiemechanismen en stromale interacties.
- Screening: Levert assay-klare, goed gekarakteriseerde invasieve celpopulaties voor downstream-analyse.
- Analytics: Biedt kwantitatieve output voor het vergelijken van invasie-fenotypes en moleculaire signaturen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in-vitro invasiegegevens met preklinische en klinische biomarkerstrategieën.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbare workflow voor het isoleren van gedefinieerde celpopulaties in verschillende kankermodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in de invasiebiologie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie van invasieve cellen, wat de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid ondersteunt.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door te focussen op gevalideerde invasiedoelen.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van assets die zich richten op metastatische progressie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in 3D-cultuur, histologie en instrumentatie voor laser-microdissectie.
- Vraagt toegang tot gespecialiseerde beeldvormings- en microdissectieplatforms.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor monsterbereiding en analyse.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende tumortypes of stromale samenstellingen.
- De monsterdoorvoer en weefselverwerking moeten worden geoptimaliseerd voor schaalbaarheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
CRC Organoid Culture: A Method to Obtain 3D Organoids from Colorectal Cancer Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Molecular Profiling van de invasieve tumor micro in een 3-dimensionaal model van colorectale kanker cellen en
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026