Name: Muis embryonale Lung Cultuur, een systeem om de moleculaire mechanismen van Vertakken Evalueer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer een methode voor het isoleren en kweken van embryonale muizenlongen om epitheel-mesenchymale interacties te bestuderen. Deze techniek maakt observatie van groei en vertakking mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Saban Research Institute Pre-doctorale Award (PMDM), en door NIH RO1 HL75773 (DW).

Orgelcultuur is een zeer nuttige en veelzijdige techniek om gen-en eiwitexpressie te bestuderen. Deze ex vivo cultuur methoden kunnen worden gebruikt als een voorafgaande of in aanvulling op de in vivo studies. 1. Embryonale Lung Isolatie <ol><li> Timed-zwangere muizen worden opgeofferd op postcoitum dag 11,5 of 12,5 (E11.5-12.5) door de CO 2 narcose volgens de NIH en OLAW richtlijnen. Het dier is geplaatst in een kamer en 100% CO 2 wordt geïntroduceerd. Nadat het dier bewusteloos is de CO 2-stroom wordt verhoogd. Klinisch dood van het dier moet worden gewaarborgd. </li><li> Al de volgende stappen moeten worden voltooid onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De baarmoeder is verwijderd uit de zwangere vrouwtjes. Voor het verwijderen van de baarmoeder van het dier, worden de zwangere vrouwtjes die op hun rug en besproeid met 70% ethanol. Een incisie wordt gemaakt in de buik, en de huid wordt verwijderd door het trekken van de huid naar boven terwijl het dier achterpoten. De peritoneale holte wordt geopend en de baarmoeder is verwijderd uit het dier. </li><li> Het bloed wordt weggespoeld door het plaatsen van de baarmoeder in een 50 ml conische buis gevuld met koud Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), en de buis wordt zachtjes geschud gedurende 2 minuten. </li><li> De baarmoeder wordt dan geplaatst in een petrischaal onder de microscoop stereoscopische ontleden, en de embryo's vrijgelaten uit de baarmoeder door incisie de baarmoederwand met behulp van de lente een schaar. De embryo's worden geoogst met behulp van een geperforeerde lepel, en geplaatst op ijs in een nieuwe petrischaal met HBSS. </li><li> Onder de stereoscopische microscoop ontleden, zijn embryonale longen doorsneden een voor een in een petrischaal met koud HBSS (figuur 1). </li><li> De geïsoleerde embryonale long is geplaatst op ijs in een petrischaal met HBSS met behulp van een steriele pipet overdracht. </li></ol> 2. Embryonale Lung Cultuur <ol><li> 500 microliter tot 1 milliliter per putje van D-MEM/F-12 aangevuld met 50 eenheden / ml penicilline-streptomycine is toegevoegd in een Nunclon Polystyreen schotel. </li><li> Een Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch Membraan wordt geplaatst op de top van de media. Wanneer de Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch Membraan wordt geplaatst op de top van de media, ervoor zorgen dat de glimmende kant is tegen de media, en de ruwe zijde naar boven is gericht. </li><li> Een ontleed embryonale longen is geplaatst op de top van de Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch membraan met behulp van een steriele pipet overdracht. </li><li> De embryonale long positie wordt aangepast met de tang. Embryonale long op de filter moet een intact luchtpijp en worden geplaatst met hun luchtpijp met een rechte positie, zodat alle longen naar dezelfde interne druk hebben. </li><li> De Nunclon Polystyreen schotel wordt overgedragen voor de gewenste cultuur van de tijd in een cel incubator (figuur 2). </li></ol> 3. Materialen 1. Embryonale Hele Lung Isolatie <ol><li> Timed-zwangere (C57Bl6 wild-type of transgene) muizen worden opgeofferd op postcoitum dag 11,5 tot 13,5 (E11.5-13.5). </li><li> Balanced Salt Hanks 'Solution (HBSS) (1x), vloeistof, zonder calciumchloride, magnesiumchloride of magnesiumsulfaat. (Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 50 eenheden / ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Bewaar de HBSS bij kamertemperatuur en bij 4 ° C na opening. Aliquot en opslaan van de penicilline-streptomycine bij -20 ° C. </li><li> Stereoscopische ontleden microscoop (Leica, Wetzlar, Duitsland). </li><li> Dissection tools zoals Dumont tang, schaar Fine iris (recht), Noyes voorjaar schaar en Moria ® lepel (geperforeerd) (Fine Science Tools, Foster City, CA). </li></ol> 2. Embryonale Hele Lung Cultuur <ol><li> Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1x), vloeistof, 01:01 Bevat L-glutamine, maar geen HEPES buffer. (Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 50 eenheden / ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Houd de DMEM/F-12 fles weg van het licht (bv. onder aluminiumfolie) en bewaar bij 4 ° C. Aliquot en opslaan van de penicilline-streptomycine bij -20 ° C. </li><li> Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch Membraan, 8,0-m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membraan (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Nunclon Polystyreen schotel met deksel, 4 putten (Rochester, NY). </li><li> Wegwerp overdracht pipetten, steriele (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Dissectie van de E12 embryonale longen. (A) E12.5 hele embryo gezien vanaf de rechterkant. (B) Rechter voorpoot is verwijderd uit het embryo. (C) Tang in het bezit van de linkerhand die de embryo stabiel in de schaal. Pijlen geven plan van dissectie (D) Embryonale long ligt posterior naar het hart (verwijderd) En anterior van de wervelkolom. Deze figuur toont de longen na de huid en het hart te verwijderen. (E) Pharynx verwijderen scheiding van de intacte long maakt van het embryo. (F) onzuiverheden faryngeale weefsels en slokdarm zijn weggesneden. Ontleed E12.5 embryonale long met intacte luchtpijp en het strottenhoofd wordt weergegeven. (Cr) Craniale kwab, (Med) mediale kwab, (Ca) Caudal kwab, (Acc) accessoire kwab, (Le) Linker kwab. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. FGF9 induceert uitbreiding van het mesenchym en de verwijding van het epitheel in de longen gekweekt in vitro. (AC) E12.5 longen wordt verbouwd voor 48 uur in afwezigheid van FGF9. Let op de toename van de vertakking. (DF) E12.5 longen geteeld voor 48 uur in aanwezigheid van FGF9. Let op de verwijding van het epitheel en mesenchym zo vroeg als na 24 uur van de cultuur (E). Na 48 uur (F), het effect op het epitheel is nog meer uitgesproken. Schaalbalk: AF 400 um 4. De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">Springer Protocols</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

muis embryonale lung cultuur, een systeem om de moleculaire mechanismen van vertakken evalueer

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung oorspronkelijke specificaties als vertakking morfogenese, en de vorming van diverse pulmonale cellijnen vereist een specifieke interactie van de long endoderm met de omringende mesenchym en mesothelium. Lung mesenchym is aangetoond dat de bron van inductieve signalen voor long vertakking morfogenese worden. Epitheliale-mesenchymale-mesothelial interacties zijn ook van cruciaal belang embryonale long morfogenese. De vroege embryonale long orgelcultuur is een zeer nuttig systeem om epitheliale-mesenchymale interacties te bestuderen. Zowel de epitheliale en mesenchymale morfogenese verloopt onder specifieke omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in dit systeem (in afwezigheid van de moeder invloed en de doorbloeding). Nog belangrijker is deze techniek kan eenvoudig worden gedaan in een serumless, chemisch gedefinieerde cultuur media. Winst en verlies van functie kan worden bereikt met behulp van tot expressie gebrachte eiwitten, recombinante virale vectoren en / of analyse van transgene muizenstammen, antisense RNA, evenals RNA-interferentie-gen knockdown.

De vroege embryonale long orgelcultuur is een zeer nuttig systeem om epitheliale-mesenchymale interacties te bestuderen. Zowel de epitheliale en mesenchymale morfogenese verloopt onder specifieke omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in dit systeem.

Muis embryonale Lung Cultuur, een systeem om de moleculaire mechanismen van Vertakken Evalueer

De specificatie van de longprimordia, evenals de vertakkende morfogenese en de vorming van diverse pulmonale cellijnen, vereist een specifieke interactie van ...

In deze video wordt een methode gedemonstreerd voor de dissectie en kweek van embryonale longen van muizen. De procedure begint met het oogsten van embryo's op E 11.5 of E 12.5. Vervolgens worden de embryo's geopend en worden de longen geëxtraheerd.De longen worden vervolgens geplaatst in een vloeistof-luchtinterface en na de kweek geïncubeerd. Veranderingen in de groei en vertakking van het mesenchyem en epitheel van de embryonale long als reactie op specifieke behandelingen kunnen worden waargenomen met een stereomicroscoop. Hallo, ik ben David War Burton.Ik leid het programma voor ontwikkelingsbiologie en regeneratieve geneeskunde aan het Ban Research Institute Children's Hospital in Los Angeles. En ik ben Jan Carro, senior postdoc in het laboratorium van Dr. War Burton. Vandaag gaan we u een techniek laten zien voor het isoleren van embryonale longen van muizen en het plaatsen hiervan in een organcultuur.Deze techniek is voortgekomen uit de oorspronkelijke beschrijving van Tina Jaco Halkin en Pablo bring us aan de USC School of Dentistry ongeveer 20 jaar geleden. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de vertakkingsmorfologie van lamina te bestuderen. Laten we beginnen.Plaats op Postum Dag 11.5 of 12.5 een met kooldioxide geofferde, getimede drachtige muis op de rug onder een laminaire flowkast. Besproei met 70% ethanol. Maak een incisie in de abdomen.Terwijl u de achterpoten van het dier vasthoudt, verwijdert u de huid door deze omhoog te trekken. Open de peritoneale holte en verwijder de uterus. Plaats de uterus in een conische buis van 50 milliliter gevuld met koude hanks balanced salt solution of HBSS en schud deze voorzichtig gedurende twee minuten om het bloed af te spoelen.Breng vervolgens de uterus over naar een Petrischaal onder een stereodissectiemicroscoop. Knip met veerschaartjes de uteruswand door om de embryo's vrij te maken. Oogst daarna de embryo's met een geperforeerde lepel, breng ze over in een Petrischaal met HBSS en plaats deze op ijs.Werk verder onder de stereoscopische dissectiemicroscoop en begin met het dissekeren van de embryonale longen. Begin door het embryo op zijn linkerzijde te plaatsen. Verwijder met een pincet in de linkerhand de rechtervoorpoot.Snijd het embryo open beginnend bij de opening van de ledemaat en verwijder de huid. Deze stap stelt u in staat om de interne organen te zien en het hart en de longen te lokaliseren voor de volgende stap. Verwijder het hart.De embryonale longen bevinden zich posterior ten opzichte van het hart en anterior ten opzichte van de ruggengraat. Scheid vervolgens de intacte long van het embryo. Trim daarna het overtollige weefsel en de slokdarm weg.Zodra de longen zijn verwijderd, gebruikt u een steriele transferpipet om ze over te brengen naar een Petrischaal met koud HBSS op ijs. Voeg aan elke well van een no clone delta polystyreen schaal 0,5 tot 1 mL D-M-E-M-F 12 toe, aangevuld met 50 units per mL penicilline streptomycin. Plaats vervolgens een nucleo polycarbonaat track etch membraan bovenop het medium, met de glanzende zijde naar beneden en de ruwe zijde naar boven.Plaats met een steriele transferpipet een gedissecteerde embryonale long bovenop het nucleo polycarbonaat track etch-membraan. Pas met behulp van de stereomicroscoop de positie van de embryonale long aan. De embryonale long moet een intacte trachea hebben die in een rechte positie is geplaatst, zoals hier getoond.Om ervoor te zorgen dat alle longen dezelfde interne druk hebben, wordt het schaaltje overgebracht naar een celincubator om gedurende de gewenste tijd te kweken. In dit geval werden E 12.5 longen gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van FGF nine. FGF nine is een lid van de fibroblast growth factor-familie die na 48 uur de expansie van het mesenchym en de dilatatie van het epitheel induceert in in vitro gekweekte longen.Bij afwezigheid van FGF nine is een toename van de vertakking waarneembaar. Deze afbeeldingen zijn foto's van de embryonale long, genomen onder een stereomicroscoop. In tegenstelling hiermee vertonen longen die 48 uur in aanwezigheid van FGF nine zijn gekweekt een gedilateerd epitheel en een mazenstructuur.Na 24 uur cultuur. Na 48 uur is het effect op het epitheel nog uitgesprokener. We hebben u hiermee laten zien hoe u organculturen bereidt van embryonale longen van de muis.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de long zo snel mogelijk uit het embryo moet worden verwijderd om weefseldeterioratie te verminderen. Bedankt voor het kijken. Hopelijk vindt u dit een nuttige techniek.Veel succes met uw experimenten.

mouse-embryonic-lung-culture-system-to-evaluate-molecular-mechanisms

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier een protocol voor het kweken van muizen pulmonale endotheelcellen. Deze methode bestaat uit mechanische en enzymatische longweefsel dissociatie evenals een 2-staps zuiveringsproces met behulp van anti-PECAM-1 en anti-ICAM-2 antilichamen geconjugeerd aan magnetische korrels, die een pure endotheelcellen bevolking van voornamelijk microvasculaire oorsprong produceert.

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Mechanische krachten spelen een belangrijke rol in de longen de ontwikkeling en longschade. Hier wordt beschrijven een werkwijze voor knaagdier foetale long type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en blootstellen aan mechanische stimulatie met...

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

We geven een in vitro muizen foetale lever erytroblast kweeksysteem dat de vroege en late stadia van terminal erytropoëse ontleedt. Dit systeem vergemakkelijkt de functionele analyse van specifieke genen in verschillende ontwikkelingsstadia.

Muis foetale lever Cultuur System Doel Gene functies ontleden in de vroege en late stadia van Terminal Erytropoëse

Het gebruik van reporter muizen gekoppeld aan ganse berg en rubriek vlekken, microscopie en in vivo assays vergemakkelijkt de analyse van de onderliggende mechanismen van het normale patroon van de luchtwegen. Hier beschrijven we hoe deze technieken hebben bijgedragen aan de analyse van Wnt signalering gedurende tracheale ontwikkeling.

Studeren Wnt Signalering Tijdens patroonvorming van Conducting Airways

Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Het artikel beschrijft stapsgewijze gerichte differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar driedimensionale hele longorganoïden die zowel proximale als distale epitheellongcellen bevatten, samen met mesenchym.

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Het protocol presenteert een methode om menselijke longorganoïden af te leiden uit primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw fenokopie.

Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren

Hier beschrijven we een eenvoudig en economisch protocol om onbevooroordeelde kwantificering van de pulmonale microvasculaire dichtheid voor longweefsel van hele muizen uit te voeren met behulp van enkelvoudige kleuring van isolectine B4.

Kwantificering van pulmonale microvasculaire dichtheid bij muizen over lobben

In dit rapport beschrijven we een methode voor de isolatie en de cultuur van de progenitor cel niche van de embryonale muis nier die gebruikt kan worden om signaalwegen reguleren van stam / voorlopercellen van de zich ontwikkelende nier te bestuderen. Deze gekweekte cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die een efficiënte manipulatie van de kandidaat-wegen mogelijk maakt.

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Leer een methode voor het isoleren en kweken van embryonale muizenlongen om epitheel-mesenchymale interacties te bestuderen. Deze techniek maakt observatie van groei en vertakking mogelijk.

Muis embryonale Lung Cultuur, een systeem om de moleculaire mechanismen van Vertakken Evalueer

Meer video's verkennen