Generation of Organotypic Full Skin Reconstructs: A Procedure to Establish 3D Skin Model Using Human Skin Samples
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 4:07 min • April 30th, 2023
Skin primarily consists of an upper epidermal layer and a lower dermal layer. The epidermal cells are stratified into multiple layers ranging from the least differentiated cells present at the base to the highly differentiated cells at the periphery. To grow a skin tissue mimicking the morphological and biochemical aspects of normal skin, we can establish an organotypic skin model.
To begin, take a multi-well plate with a membranous insert. Add dermal fibroblasts mixed with collagen to the insert. Incubate to facilitate collagen matrix solidification to embed the fibroblasts and mimic the dermal compartment of the skin.
Next, add a keratinocyte cell suspension over the dermal layer. Incubate the plate to allow keratinocytes to adhere to the dermal compartment. Supplement the culture with an epidermalization medium to initiate keratinocyte proliferation and the formation of an epidermal layer.
Finally, transfer the inserts to a fresh multi-well plate. Add a stratification medium such that it covers only the base of the construct, thereby creating an air-liquid interface. Upon incubation, the air-liquid interface facilitates the differentiation of keratinocytes into a stratified multilayered epidermis.
In the following protocol, we will generate 3D organotypic skin reconstructs having dermal and epidermal counterparts from isolated human skin cells.
To generate the dermal counterpart of the skin reconstructs, place 8 micrometer pore size membrane inserts in a 24-well cell culture plate. For each insert, resuspend 100,000 fibroblasts in gel neutralization solution. Next, quickly mix the fibroblast suspension with collagen type 1 at a ratio of 1:3 in a final volume of 500 microliters without forming bubbles.
Then, use a pipette to add the suspension to each insert. Inside a sterile hood, place the inserts at room temperature without medium for 30 minutes to allow the dermal gels to settle. Next, cover the gels with DMEM and incubate overnight at 37 degrees Celsius.
After the overnight incubation, remove the DMEM from the dermal gels and equilibrate them with EGM for 2 hours at 37 degrees Celsius to generate the epidermal counterpart of the skin reconstructs. Next, use a pipette to remove the EGM from the gels.
Then, carefully seal 100,000 keratinocytes resuspended in 100 microliters of EGM on top of each gel. Incubate the reconstructs for 1.5 hours at 37 degrees Celsius to allow the keratinocytes to adhere to the dermal gel. Using a pipette tip, carefully remove the residual gel from the insert wall.
Next, cover each reconstruct with 800 microliters of EGM and culture for 7 days at 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide.
Carefully remove residual gel from the insert wall with a small white pipette tip.
On day 8, place the inserts into separate wells of a 6-well plate. Next, add 1.2 to 1.4 milliliters of metastatic melanoma medium to each well to cover only the base of the skin reconstruct. Then, incubate for 10 to 17 days at 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide.
Overzicht
Dit artikel beschrijft het proces voor het creëren van een 3D organotypisch huidmodel dat de structuur en functie van de menselijke huid nabootst. Het model bevat zowel dermale als epidermale lagen, waardoor de studie van huidbiologie en pathologie mogelijk wordt.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Tissue engineering
Achtergrond
- De huid bestaat uit een bovenliggende epidermale laag en een onderliggende dermale laag.
- Epidermale cellen zijn gestratificeerd in meerdere lagen met verschillende gradaties van differentiatie.
- Organotypische modellen zijn essentieel voor het bestuderen van de biologie van de huid.
- Het creëren van een huidmodel omvat het laagjes maken van dermale fibroblasten en keratinocyten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar organotypisch huidmodel te ontwikkelen.
- Om de studie naar huidaandoeningen en behandelingen te faciliteren.
- Om de morfologische en biochemische eigenschappen van normale huid na te bootsen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van multi-well platen met membraaninserts.
- Inbedding van fibroblasten in een collageenmatrix.
- Toevoegen van keratinocyten om de epidermale laag te vormen.
- Toepassing van lucht-vloeistofinterface-kweekcondities.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van 3D organotypische huidconstructen.
- Vestiging van een gestratificeerde meerlaagse epidermis.
- Demonstratie van keratinocyt-differentiatie in kweek.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van huidgerelateerde ziekten.
Conclusies
- Het organotypische huidmodel bootst de menselijke huid effectief na.
- Dit model kan worden gebruikt voor diverse onderzoeksapplicaties.
- Toekomstige studies kunnen therapeutische interventies met behulp van dit model onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het vestigen van fysiologisch relevante 3D-huidmodellen maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij dermatologie en doelwitvalidatie in de oncologie door de menselijke huidarchitectuur en multicellulaire complexiteit na te bootsen. Dit ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de preklinische evaluatie van therapeutische kandidaten die de epidermale differentiatie, dermale-epidermale interacties of melanoominvasie beïnvloeden. Het model biedt een ziekte-relevant systeem voor het beoordelen van target engagement en padmodulatie in een context afgeleid van mensen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk in een gestratificeerd menselijk co-cultuursysteem van epidermis en dermale fibroblasten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door modellering van epidermale differentiatie en dermale-epidermale signalering.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert biologische risicoreductie van targets die betrokken zijn bij huidhomeostase, barrièrefunctie of de progressie van melanomen.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare menselijke huidequivalenten voor kwantitatieve beoordeling van de effecten van verbindingen op de epidermale stratificatie.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbaar platform voor assay-ontwikkeling met gedefinieerde dermale en epidermale compartimenten.
- Operationele waarde: Ondersteunt screeningworkflows met een medium doorvoersnelheid door gebruik te maken van membraaninserts in multi-well formaten.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem om de invasie van melanoom en het metastatisch potentieel te bestuderen in een gereconstrueerde menselijke huidmicro-omgeving.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt evaluatie mogelijk van translationele biomarkers gerelateerd aan epidermale differentiatie, invasie of stromale interacties.
- Operationele waarde: Slaat de brug tussen discovery- en preklinische workflows door een model van menselijke oorsprong te bieden voor lead-optimalisatie en mechanistische profilering.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode voor organotypische huidreconstructie integreert in workflows voor discovery biology en preklinisch onderzoek door een menselijk huidmodel te bieden voor targetvalidatie, assayontwikkeling en studies naar melanoominvasie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van epidermale differentiatie en dermale-epidermale interactie in een gestratificeerd menselijk weefselmodel.
- Screening: Maakt assay-gereidheid mogelijk door gestandaardiseerde generatie van dermale en epidermale lagen met kwantitatieve read-outs voor stratificatie en barrièrevorming.
- Analytics: Faciliteert vergelijkende analyse van effecten van verbindingen op de epidermale dikte, keratinocyten-differentiatie of invasiediepte via histologische of imaging-eindpunten.
- Translational Research: Ondersteunt preklinische continuïteit door menselijke melanoominvasie te modelleren in een gereconstrueerde huidmicro-omgeving.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor dermatologie- en oncologieprogramma's die modellen van de menselijke huidpathofysiologie vereisen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door de architectuur van de menselijke huid en de multicellulariteit en complexiteit te modelleren.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde celzaairatio's, de bereiding van de collageenmatrix en lucht-vloeistofinterface-kweek.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit bij de validatie van huidgerelateerde targets te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van effecten op epidermale differentiatie, dermale integriteit of melanoominvasie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire menselijke celkweek, de bereiding van collageengel en technieken voor epitheliale-stromale cocultuur.
- Afhankelijk van een steriele celkweekinfrastructuur, multi-wellplaten met poreuze inserts en gecontroleerde incubatieomgevingen (37°C, 5% CO₂).
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams voor protocollen voor celisolatie, gelneutralisatie en mediumverversing om interlaboratoriumconsistentie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het modelleren van verschillende huidfenotypes of ziektebeelden (bijv. psoriasis, melanoom) met behulp van gewijzigde celbronnen of mediumformuleringen.
- Beperkt door donorvariabiliteit in primaire menselijke huidcellen, wat de kinetiek van de epidermale stratificatie en de activiteit van dermale fibroblasten kan beïnvloeden.
Biopharma Veelgestelde vragen
3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Organotypic 3D Skin Culture: A Cassette-based In Vitro Culture Technique to Regenerate Human Epidermis on Acellular Dermis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verbetering van 2D- en 3D-Skin
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026