Opname Meercellige Gedrag in Myxococcus Xanthus Biofilms met Time-lapse Microcinematography

Het algemene doel van het volgende experiment is om een ​​goedkope time-lapse microcinematografie-assay te ontwikkelen met voldoende nauwkeurigheid om reproduceerbare en kwantificeerbare resultaten te genereren. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van goedkope herbruikbare siliconen pakkingen om agros media platen of microscoopglazen te construeren. Resultaten worden verkregen die aantonen dat deze plaatcomplexen gedurende meer dan een week gehydrateerd en voldoende geoxygeneerd blijven voor een verscheidenheid aan mediatypen en agarconcentraties.

Omdat time-lapse microcinematografie een langzaam proces is, helpt het gebruik van acht goedkope microscopen om de dataverwerving te versnellen. Hallo, ik ben Ryan Taylor van het laboratorium van Dr. Roy Welch van de afdeling Biologie aan de Universiteit van Syracuse. Vandaag laten we u een procedure zien voor het maken van time-lapse films van bacteriële biofilms in ons lab, we zullen deze procedure gebruiken om het multicellulaire gedrag van MTIs-biofilms te bestuderen.

Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, meet u de celdichtheid van een overnachtelijke mix Occus sanus-cultuur met een clutmeter, brengt u een milliliter van de cultuur over in een 2,5 milliliter centrifugeerbuis, wast u het pellet en suspendeert u de bacteriën opnieuw in TPM-media zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol, pipetteert en vortext u om het pellet volledig op te schorsen, wat even kan duren. Voeg vervolgens 0,5 gram aros toe aan 50 milliliter TPM, wat het assay-media is.

Voeg ook 0,5 gram aros toe aan 50 milliliter C-T-T-Y-E, wat het voedingsschijfmedia is. Autoclaveer voor sterilisatie. Bewaar vervolgens het media op 55 graden Celsius in een incubator of waterbad. Terwijl u de tracking assay aan het construeren bent.

Plaatcomplexen Ga door met het construeren van de voedingsschijf. Sterieliseer eerst het glas microscoopglaasje in een vlam. Plaats een steriele siliconenrubber pakking van 0,5 millimeter dik op de bovenkant van het glas. Pipetteert ongeveer 300 microliters van C TT YE media aros in het wel gecreëerd door de pakking op het glas.

Het C-T-T-Y-E media aros zou moeten gaan liggen, sterieliseer opnieuw in een vlam en zet het op een schuine hoek op de C-T-T-Y-E media aros. Het glas op een hoek plaatsen voorkomt bubbeltjesvorming. Zodra het glas op zijn plaats is, zet u het complex samen met minibinderclips aan elke kant vast.

Plaats het vastgeklemde complex op vier graden Celsius en laat het C-T-T-Y-E media aros gaan liggen. Dit duurt meestal ongeveer vijf minuten. Zodra het aros is gegaan liggen, kan men de plaatcomplexen die in de tracking assay worden gebruikt, voorbereiden.

Begin met het voorbereiden van de glazen voor het construeren van de assaycomplexen. Sterieliseer voor elke complex twee glas microscoopglazen in een vlam. Plaats een autoclave pakking op een van de glazen om de onderkant van de assay te vormen.

Het andere glas wordt gebruikt om de agros plat te maken en als steunglas. De bovenkant van de assay is een dekglas. Wikkel eerst een microscoopglas met etiketteringstape, sterieliseer vervolgens het glasdekglas in een vlam en plaats het op de gewikkelde gesteriliseerde glas.

Schuif het gewikkelde glas omhoog, het steunglas ondersteunt het dekglas en voorkomt dat het barst. Plaats een autoclave pakking op de bovenkant van het glasdekglas met een pincet. Druk op de pakkingen op de onderste glas en het dekglas om ervoor te zorgen dat ze een afdichting vormen met het glas.

Anders kunnen de media a arrays uitdrogen. Zet de glas pakking en de dekglas pakking assemblages opzij met de gesteriliseerde kanten omhoog. Vanaf nu werkt u alleen aan één complex tegelijk om te voorkomen dat de media agros gaan liggen, wat zou resulteren in een slechte filmkwaliteit. Begin met het plaatsen van de voedingsschijf.

Verwijder het voedingsschijf complex uit vier graden Celsius. Verwijder de bind eclipsis en scheid de glazen, waardoor het nu gegone liggende C-T-T-Y-E aros zichtbaar wordt. Gebruik een micro bemonsteringspipet met een wegwerpbare glaspunt van 100 microliter. Verwijder een voedingsschijf van één millimeter diameter uit de C-T-T-Y-E media aros en plaats deze in het wel gecreëerd door de pakking op het dekglas.

Haal vervolgens de TPM media aros uit de incubator en pipetteer 300 microliters in het wel gecreëerd door de pakking op het dekglas en dat het voedingsschijfje bevat. De TPM media Agros zou moeten gaan liggen om het T-P-M-S-A medium aros te vlakken. Plaats een van de in een vlam gesteriliseerd glazen zonder pakking schuin op de TPM media aros. Het glas op een hoek plaatsen helpt bubbeltjesvorming te voorkomen.

Klem het complex samen met minibinderclips aan elke kant vast. Plaats het vastgeklemde complex op vier graden Celsius en laat het media aros gaan liggen. Dit duurt meestal ongeveer vijf minuten.

Zodra het media aros is gegaan liggen, verwijdert u het complex uit vier graden Celsius. Verwijder de binderclips en knijpt u in het uiteinde van het complex. Om de tape gewikkelde glas te verwijderen, verwijdert u het tape gewikkelde glas en plaatst u het op de werkbank voor verder gebruik.

Gebruik vervolgens een pincet als wig. Scheid het dekglas pakking media aros complex van het steunglas en gooit het steunglas weg. Gebruik geen prikbeweging om het dekglas pakking complex te scheiden, omdat dit ervoor kan zorgen dat het dekglas breekt en/of dat de media aray aan het steunglas blijft kleven.

Na het verwijderen van het steunglas, plaatst u het dekglas pakking media aray complex op het tape gewikkelde glas met de pakkingkant omhoog. Plaats dit complex naast een brander om alle zichtbare vocht te laten verdampen van de nieuw blootgestelde media aros oppervlakte. Laat het media aros niet langer dan een minuut drogen.

Omdat dit het