Name: Methode voor de isolatie van Francisella tularensis Buitenste membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer de isolatie van buitenste membraanvesikels uit Francisella tularensis via osmotische lysis en sucrose-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie. Deze methode scheidt binnenste en buitenste membraanproteïnen voor virulentieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De beschreven project werd ondersteund door Grant Numbers P01 AI055637 en U54 AI057156 van NIAID / NIH. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de RCE Programma&#39;s Bureau, NIAID, of NIH.

Dag 1: F. tularensis plaat inoculatie <ol><li> Plaat bevroren voorraad culturen van F. tularensis op Mueller-Hinton agar aangevuld met 2,5% (vol / vol) donor kalfserum, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol) glucose en 0,025% (wt / vol) IJzerpyrofosfaat. Grow F. tularensis bij 37 ° C met 5% CO 2 voor ongeveer 24 uur </li></ol> Dag 2: F. tularensis vloeibare media inoculatie <ol><li> Voorbereiden en autoclaaf van 1 liter kation-aangepaste Mueller-Hinton medium (met 1,23 mM calciumchloride-dihydraat en 1,03 mM magnesiumchloride hexahydraat). Wanneer afgekoeld tot 37 ° C, verder aan te vullen medium met 0,1% (wt / vol) glucose, 0,025% (wt / vol) ijzer pyrofosfaat, en 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filter steriliseren (0,22 μ) medium in twee porties van 500 ml. </li><li> Verwijder de 12 ml aangevuld Mueller-Hinton medium en brengen in een steriele 50 ml Falcon buis. </li><li> Met behulp van een steriele 10-ul enting loop, schraap een grote entoog met bacterie F. tularensis groei van agar-platen (vanaf dag 1) en overdracht bacteriën in 12 ml van Mueller-Hinton medium (zie stap 2). Pipetteer oplossing meerdere keren te breken-up klonten en voor te bereiden homogene bacteriële suspensie. Niet vortex. </li><li> Met behulp van een steriele pipet, enten elk 500 ml schip met 5 ml van de bacteriële suspensie van stap 3. Grow bouillon culturen bij 37 ° C voor 14 tot 18 uur onder zacht schudden (190 tot 200 rpm op een New Brunswick Innova 2300-serie shaker). </li></ol> Dag 3: Spheroplasting, osmotische lysis, en sucrose dichtheid gradiënt centrifugatie <ol><li> Verkrijgen van F. tularensis culturen uit het schudden incubator en verwijderen van een 1-ml aliquot van elk 500 ml cultuur aan de respectieve optische dichtheid te controleren. Wij hebben gevonden optimale membraan extractie en isolatie resultaten bij het ​​gebruik van F. tularensis cellen in de vroege logaritmische fase van de groei, die met een OD 600 correleert tussen 0,2 en 0,4 (~ 10 juli-10 augustus CFU / ml). Culturen met een OD 600 minder dan 0,2 zal niet toegeven voldoende hoeveelheid van het totaal membraan materiaal voor de volgende sucrose gradiënten. Omgekeerd, hebben culturen met een OD 600 groter is dan 0,4 (bijna stationaire fase) is gebleken dat mixed-membraan fusies opbrengst. </li><li> Centrifugeer culturen op 7500 x g gedurende 30 minuten bij 15 ° C om de cellen te verzamelen. Wij raden centrifugeren van culturen in vier van 250 ml centrifuge flessen, want het vergemakkelijkt de daaropvolgende pellet schorsing. </li><li> Verwijder voorzichtig de media supernatant van elk centrifuge fles en stevig tik op de flessen op absorberend materiaal om het overtollige groeimedium te verwijderen. </li><li> Binnen 10 minuten na voltooiing van centrifugeren, te schorsen elke bacteriële pellet in 8,75 ml 0,75 M sucrose (in 5 mM Tris, pH 7,5). Alle vier de bacteriële pellets moet worden opgeschort en overgedragen (35 ml totaal van bacteriële suspensie) in een steriele 250 ml (met een kleine stirbar) binnen 10 minuten. </li><li> Terwijl zachtjes het mengen van de celsuspensie op een stirplate, voeg langzaam 70 ml (2 volumes) van 10 mM EDTA (in 5 mM Tris, pH 7,8) in de loop van 10 minuten. Voeg de EDTA-oplossing met de punt van de pipet onder de celsuspensie niveau aan verhoogde lokale concentraties van EDTA te voorkomen. De stirbar moet draaien met een snelheid voldoende is om goed te mengen de celsuspensie, maar niet snel genoeg om schuimvorming veroorzaken of belvorming. Nadat de EDTA-oplossing is toegevoegd, incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na de 30 min incubatie, voeg langzaam 11 ml (1 / 10 ste volume) van een 2 mg / ml lysozym-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 200 ug / ml. Ga verder naar de celsuspensie mix tijdens de lysozym-oplossing toevoeging. Zoals hierboven vermeld, voeg de lysozym-oplossing met de pipetpunt onder de celsuspensie vloeistofniveau aan verhoogde lokale concentraties van lysozym te voorkomen. Stock lysozyme-oplossingen (2 mg / ml) kunnen worden bereid in voor eenmalig gebruik aliquots en opgeslagen bij -20 ° C gedurende drie tot vier maanden. Incubeer de verkregen oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens de 30 min incubatie, bereiden een steriele 1L fles met een kleine stirbar en 530 ml op kamertemperatuur Cellgro moleculair-biologische kwaliteit dH 2 O (4,5 volumes). </li><li> Osmotisch lyse de celsuspensie (vanaf stap 6) door middel van langzame verdunning (snelheid van ongeveer 11 ml / min) in 530 ml van de moleculair-biologische kwaliteit dH 2 O (vanaf stap 7) in de loop van 10 tot 15 minuten met zachte mengen. Vanwege het grotere volume oplossing in deze stap, verhoging van de stirbar snelheid een goede menging te garanderen. De stirbar moet draaien met een snelheid voldoende is om zich gelijk de celsuspensie eens toegevoegd aan de dH 2 O, maar niet snel genoeg om te leiden tot schuimen of belvorming. Voeg de celsuspensie met het puntje van de pipet rust op de bodem van de kolf, grenzend aan de stirbar, om een ​​uniforme verdunning van de cel te vergemakkelijkenl schorsing. We hebben gevonden dat de 25-ml pipetten beste werk tijdens deze stap. Zorgvuldig toezien op de verdunning proces en onderbreekt het debiet als nodig is om de lokale ophopingen van cellen, bosjes, en cel slierten verspreiden. Incubeer de verkregen oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Merk op dat deze stap lijkt te zijn een van de meest uitdagende en kritische voor het algehele welslagen van het experiment. </li><li> Na de 30 min incubatie, 40 ml porties van de osmotische lysis oplossing overbrengen naar 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 7500 xg gedurende 30 minuten bij 10 ° C en intacte cellen en vuil te verwijderen. </li><li> Na centrifugatie, verwijder voorzichtig 27 tot 30 ml van de bovenstaande uit elke conische buis en het zwembad supernatant in een steriele 1L fles </li><li> Breng 25 ml van samengevoegde supernatant, elk, in 16 ultracentrifuge en centrifugeer op 200.000 x g (44400 rpm in F50L-8x39 FiberLite ultracentrifuge rotor) gedurende 2 uur bij 4 ° C. Merk op dat elke rotor 8 buizen houdt, dus deze stap vereist twee rotoren en twee ultracentrifuges. Als alternatief zou de tweede set van 8 buizen worden gehouden op 4 ° C tot gecentrifugeerd. </li><li> Binnen 10 min van de voltooiing van de ultracentrifuge draaien, bereiden gewijzigd membraan resuspensie buffer. Overdracht 8 ml van membraan suspensie buffer (25% [wt / wt] sucrose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) in een steriele buis en voeg een tablet van EDTA-vrije protease remmer cocktail en 375 U van Benzonase. Voorzichtig mengen oplossing voor proteaseremmer tablet is opgelost. </li><li> Na ultracentrifugatie, voorzichtig afgieten supernatants, omkeren ultracentrifuge buizen op absorberend materiaal en stevig tap buisjes om overtollig supernatant te verwijderen. Markeer de locatie van elke membraan pellet met een marker om te helpen bij visualisatie. Voorzichtig mengen acht membraan pellets met 600 ul elk van gemodificeerde membraan resuspensie buffer. Overdracht elk membraan resuspensie naar de volgende reeks van acht buizen, zacht deze acht pellets, en het zwembad van het resulterende membraan resuspensions opnieuw in suspensie in een steriele buis. Het ingehulde membranen zijn moeilijk te mengen, dus ga verder langs de gewijzigde membraan resuspensie buffer op de korrel tot het pelt weg van de wand van de buis. Het is vaak nodig om de micropipet tip te gebruiken om het membraan pellet schraap de buiswand en steun in de resuspensie proces. Bij het pipetteren, vermijd schuimen of belvorming. Merk op dat deze stap lijkt te zijn een van de meest uitdagende en kritische voor het algehele welslagen van het experiment. </li><li> Wanneer het membraan pellets zijn geresuspendeerd en uit alle 16 buizen, wassen om de vier buizen met 600 ul van gewijzigde membraan resuspensie buffer. Het wassen dient te worden geconcentreerd rond het gemarkeerde gebied (membraan pellet) van elke buis. Breng de was in het membraan resuspensie buis. Herhaal de wasstap voor de resterende drie sets van vier buizen. </li><li> Incubeer het membraan resuspensie met zachte schommelen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur aan DNA en hulp worden afgebroken in vermindering van vlokkig materiaal. </li><li> Verwijder een kleine hoeveelheid van het membraan schorsing en uit te voeren eiwit kwantificering van de totale opbrengst membraan te bepalen. We meestal voor te bereiden onverdund, 1:01 verdund (in 2,5% SDS), en 1:3 verdund (in 2,5% SDS) membraan monsters, warmte de monsters bij 90 ° C gedurende 10 minuten, en gebruik de BioRad DC Protein Assay te kwantificeren het membraan resuspensie eiwit concentratie. Totaal eiwit opbrengst is over het algemeen tussen 1,0 mg / ml en 1,6 mg / ml. Het gebruik van warmte en SDS zijn nodig om Omps vrijlating uit de uitgepakte membranen, zodat een meer accurate kwantificering eiwit waarde kan worden verkregen. </li><li> Bereid lineaire sucrose gradiënten door lagen 1,8 ml van elk van sucrose oplossingen (gew / gew, bereid in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear ultracentrifuge buizen in de volgende volgorde: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Gelaagdheid van sucrose gradiënten is het makkelijkst uit te voeren bij het gebruik van een lamp pipet, niet door een geautomatiseerd pipet. </li><li> Op basis van het membraan resuspensie eiwit kwantificering (stap 16), laag 1,5 mg van het membraan resuspensie op de top van elk verloop. Elke 14 x 95 mm ultracentrifuge buis heeft een maximale capaciteit van 12,5 ml en, gezien het feit dat 10,8 ml komt voor rekening van de sucrose oplossingen van stap 17, moet je nooit meer dan 1,7 ml membraan resuspensie per verloop. Stuksgewicht en zorgvuldig aan te passen de uiteindelijke gewicht van elke sucrose gradiënt buis (door het toevoegen of verwijderen van membraan resuspensie), zodat alle buizen dezelfde (± 0,01 g) wegen. </li><li> Overdracht sucrose gradiënten in een SW-40Ti swingende emmer rotor en centrifugeer bij 256.000 x g (38.000 rpm) voor een minimum van 17 uur bij 4 ° C. </li></ol> Dag 4: Het verzamelen van sucrose gradiënt fracties <ol><li> Na 17 uur van centrifugeren, stop de centrifuge draaien, en zorgvuldig sucrose gradiënten te verwijderen uit de SW-40Ti rotor. </li><li> Reinig de onderkant van de sucrose gradiënt buis met 70% ethanol, doorboren debodem van de buis met een 21g naald, en het verzamelen van sequentiële 500 pi fracties uit de gradiënt in steriele microcentrifuge buizen. Herhaal dit voor de volgende hellingen. De helling moet worden toegestaan ​​om druppelen door de zwaartekracht stroom, om niet de sucrose gradiënt verstoren. Echter, als de druipende ophoudt van de bodem van de gradiënt buis, kan een kleine hoeveelheid druk wordt toegepast op de bovenkant van de buis met behulp van een vinger. </li><li> Bepaal de brekingsindex van elk sucrose gradiënt fractie met behulp van een refractometer en correleren van de brekingsindex met een specifieke dichtheid in g / ml 1. Beoordeel eiwit lokalisatie door het opstellen van vertegenwoordiger van sucrose gradiënt fracties (dichtheid in stappen van 0,01, van 1,11 g / ml tot 1,26 g / ml) voor SDS-PAGE scheiding, transfer naar nitrocellulose, en immunoblotting. </li></ol> Representatieve resultaten Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, deze procedure resulteert in de volledige scheiding van IM en OM blaasjes van zowel type A (bijv. SchuS4) en Type B (bv LVS) stammen van F. tularensis. Zoals weergegeven in representatieve immunoblots in figuur 1, F. tularensis Omps lokaliseren tussen de dichtheid van 1,17 en 1,20 g / ml. Ter vergelijking, GMP lokaliseren tussen de dichtheid van 1,13 en 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Immunoblotting van F. tularensis sucrose dichtheidsgradiënten. Opeenvolgende fracties werden verzameld uit gradiënten en dichtheden (g / ml) werden berekend op basis van brekingsindex. Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar nitrocellulose, en immunoblotted te OMP en IMP fractionering op te sporen. mw, moleculair gewicht normen prestained met maten (in kDa) vermeld op de linkerkant van elke blot. LVS, hele cellysaten van F. tularensis LVS. De bijbehorende sucrose gradiënt fractie dichtheden worden genoteerd boven hun respectieve rijstroken. Omps en GMP's, zoals vermeld in de linkermarge, werden gedetecteerd met polyklonale, monospecifieke antisera. Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor F. tularensis SchuS4.

<ol><li>Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+outer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li>
<li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li>
<li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li>
<li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li>
<li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li>
<li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li>
<li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+live+vaccine+strain%3A+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li>
<li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li>
<li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li>
<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
</ol>

Dit protocol beschrijft een variant van de spheroplasting, osmotische lysis, en sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie &quot;gouden standaard&quot; voor de fysieke scheiding en verrijking van Gram-negatieve bacteriën OMS van andere cellulaire componenten 2, 3, 4. Terwijl we eerder beschreven van de toepassing van deze methode voor het isoleren van OMS van zowel type A en type B stammen van F. tularensis 5, deze presentatie biedt een meer gedetailleerde en geoptimaliseerd procedure voor OM-isolatie. Inderdaad, dit is een belangrijke stap vooruit voor het identificeren van mogelijke oppervlakte-belichte en vermoedelijke virulentie factoren van deze dodelijke ziekteverwekker. De betekenis van deze procedure werd aangetoond in onderzoeken door ons lab laten zien dat immunisatie van muizen met gezuiverde Omps geboden aanzienlijke bescherming tegen virulente type A F. tularensis pulmonale uitdaging 6. Zoals hierboven is opgemerkt, groeifase van de bacteriële cellen, is een zorgvuldige monitoring tijdens osmotische lysis, en zachte resuspensie van membraan pellets zijn kritische stappen die lijken te correleren met succes / falen van deze membraanscheiding procedure. Hoewel deze methode geoptimaliseerd is streng en onderworpen aan een aantal experimentele variabiliteit, de daaruit voortvloeiende OMS lijken te zijn van opmerkelijk verbeterd zuiverheid in vergelijking met die vergaard uit het gebruik van detergenten, lithium chloride, of natriumcarbonaat 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>Kalfsserum van donor</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro molecular grade dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaatfles van 38.5 ml</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>F50L-8x39 ultracentrifugerotor</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini EDTA-vrije protease-inhibitorcocktail</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>DC proteïne-assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear centrifugebuizen van 14x95mm</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Abbe tafelrefractometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

methode voor de isolatie van francisella tularensis buitenste membranen

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is een Gram-negatieve intracellulaire Coccobacillus en de verwekker van de zoönotische ziekte tularemie. In vergelijking met andere bacteriële pathogenen, de extreem lage infectieuze dosis (&lt;10 CFU), snelle progressie van de ziekte, en de hoge morbiditeit en mortaliteit suggereren dat de virulente stammen van Francisella coderen voor nieuwe virulentiefactoren. Het oppervlak belicht moleculen, namelijk de buitenste membraaneiwitten (Omps), is aangetoond dat bacteriële gastheercel binding, ingang, intracellulaire overleving, virulentie en immuno-evasie te bevorderen. De relevantie voor het bestuderen Omps wordt verder onderstreept door het feit dat ze kunnen dienen als beschermende vaccins tegen een aantal bacteriële ziekten. Overwegende dat de Omps kan worden gewonnen uit gram-negatieve bacteriën door middel van bulk membraan extractie technieken, waaronder sonicatie van cellen, gevolgd door centrifugeren en / of afwasmiddel extractie, zijn deze voorbereidingen vaak besmet met periplasmatische en / of cytoplasmatische (innerlijke) membraan (IM) verontreinigingen. Voor jaar, de &quot;gouden standaard&quot; methode voor de biochemische en biofysische scheiding van gram-negatieve IM en buitenste membranen (OM) is van onderwerp bacteriën spheroplasting en osmotische lysis, gevolgd door een sucrose dichtheid gradiënt centrifugatie. Eens lagen op een sucrose gradiënt, kan OMS worden gescheiden van IMs op basis van de verschillen in dichtheden uitbundige, vermoedelijk gebaseerd grotendeels op de aanwezigheid van lipopolysaccharide (LPS) in het OM. We beschrijven hier een rigoureuze en geoptimaliseerd methode te extraheren, te verrijken, en isoleren F. tularensis buitenste membranen en de bijbehorende Omps.

Een protocol voor het scheiden van innerlijke en uiterlijke membranen van<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Door spheroplasting, osmotische lysis, en sucrose dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.

Methode voor de isolatie van Francisella tularensis Buitenste membranen

*Francisella tularensis* is een Gram-negatieve intracellulaire coccobacillus en het veroorzakende agens van de zoönotische ziekte tularemie. In vergelijking met andere ...

De isolatie van buitenmembraanvesikels van Francis Cellis en hun bijbehorende buitenmembraaneiwitten begint met osmotische lyse van bacteriële cellen. Bacteriën in de logaritmische fase worden opeenvolgend behandeld met hypertone sucrose-, EDTA- en lysozymoplossingen voordat ze langzaam worden verdund in gedeïoniseerd water. De resulterende bacteriële lysaten worden onderworpen aan centrifugatie bij lage snelheid om cellulair debris en onbeschadigde cellen te verwijderen, gevolgd door centrifugatie bij hoge snelheid om de membraanvesikels te pelletteren.Vervolgens worden totale membraanvesikels op sucrose-dichtheidsgradiënten gelaagd om binnenmembraan- (IM) en buitenmembraan- (OM) vesikels te scheiden. OM-vesikels kunnen worden gescheiden van IM-vesikels op basis van verschillen in drijfvermogensdichtheden, waarvan wordt aangenomen dat deze grotendeels berusten op de aanwezigheid van lipopolysacharide (LPS) in het OM. Immunoblotting van opeenvolgende fracties uit sucrose-dichtheidsgradiënten toont een ruimtelijke scheiding van binnenmembraaneiwitten en buitenmembraaneiwitten. Hallo, ik ben Dr. Michael Norgaard, en dit is Dr. Jason Huntley van de Department of Microbiology aan het UT Southwestern Medical Center in Dallas.Vandaag zal Dr. Huntley u een procedure laten zien voor het extraheren, verrijken en isoleren van de buitenmembranen van Francisella cellen en hun geassocieerde membraaneiwitten. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de in het buitenmembraan gelokaliseerde en potentieel aan het oppervlak blootgestelde moleculen van deze intracellulaire bacteriële pathogeen te bestuderen. We hebben een drukke dag, dus laten we beginnen.Om deze procedure te starten, bereid en kweek twee culturen van 500 milliliter FCIs-bacteriën zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Haal de bacterieculturen uit de schudincubator en neem een aliquot van één milliliter uit elke cultuur voor de OD-meting om lorenza-cellen in de vroege logaritmische groeifase te verkrijgen, wat correspondeert met een OD 600 tussen 0,2 en 0,4. Voor optimale resultaten bij de membraanextractie en -isolatie moeten de culturen de gewenste OD 600 hebben bereikt.Gebruik vier centrifugeflessen van 250 milliliter om de culturen te centrifugeren bij 7.500 Gs gedurende 30 minuten bij 15 °C om de cellen te verzamelen. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het mediumsupernatans uit elke centrifugefles en tik de flessen stevig tegen absorberend materiaal om overtollig groeimedium te verwijderen. Suspendeer elk bacterieel pellet binnen 10 minuten na voltooiing van de centrifugatie in 8,75 milliliter 0,75 molar sucrose in vijf millimolar Tris pH 7,5.Breng na resuspensie van elk pellet de oplossing over in een steriele fles van 250 milliliter met een kleine roerstaf. Herhaal dit voor alle vier de bacteriële pellets tot er een totale bacteriële pelletsuspensie van 35 milliliter is verkregen. Meng de celsuspensie grondig op een roerplaat, maar niet te snel.Om schuimvorming of bellen tijdens het langzaam mengen te voorkomen, voegt u gedurende 10 minuten 70 milliliter 10 millimolaire EDTA toe aan de oplossing. Houd de pipetpunt onder het niveau van de celsuspensie om verhoogde lokale concentraties EDTA te voorkomen. Incubeer de oplossing na toevoeging van de EDTA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens, terwijl u langzaam blijft mengen, 11 milliliters van een lysozymoplossing van twee milligram per milliliter toe tot een uiteindelijke concentratie van 200 micrograms per milliliter. Blijf de celsuspensie mengen tijdens het toevoegen van de lysozymoplossing. Houd, zoals eerder, de tip onder het niveau van de celsuspensie.Incubeer de cellen met het lysozym gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens deze incubatie een steriele kolf van één liter voor met een klein roertangetje en 530 milliliters gedioniseerd water van moleculaire kwaliteit bij kamertemperatuur, geschikt voor celgroei.Wanneer de cellen klaar zijn met incuberen, wordt de osmotisch gelyseerde celsuspensie met een pipette van 25 milliliter, rustend op de bodem van de kolf naast de roerkolf, gedurende 10 tot 15 minuten langzaam verdund in het water in de kolf van één liter onder voorzichtig roeren. Deze stap is uitdagend en cruciaal voor het algemene succes van het experiment. Het roeren moet snel genoeg zijn om de celsuspensie grondig te verspreiden, maar niet zo snel dat er schuim of belletjes ontstaan, naar behoefte.Verhoog langzaam de snelheid van de roerstaf om een goede menging te garanderen. Houd het verdunningsproces nauwlettend in de gaten en pas de stroomsnelheid aan of roteer de kolf indien nodig om lokale ophopingen van cellen, celklonters en celvlokken te verspreiden. Zodra alle cellen zijn toegevoegd, wordt het mengsel 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Breng aan het einde van de incubatie aliquots van 40 milliliter van de osmotische lysisoplossing over in 50 milliliter conische buizen en centrifugeer deze 30 minuten bij 7.500 Gs bij 10 °C.Om intacte cellen en debris na centrifugatie te verwijderen, worden voorzichtig 27 tot 30 milliliters supernatant uit elke conische buis verwijderd en de supernatten samengevoegd in een steriele kolf van één liter. Breng 25 milliliters van de samengevoegde supernat over in elk van de 16 ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende twee uur bij 200, 000 Gs bij vier graden Celsius. 10 minuten voordat de centrifugatie voltooid is.Bereid de gemodificeerde membraanresuspensiebuffer voor. Combineer acht milliliters membraansuspensiebuffer met één tablet EDTA-vrije protease-inhibitorcocktail en 375 units Benzonase in een steriele buis en meng dit voorzichtig na centrifugatie van de gelyseerde cellen. Ga verder met het terugwinnen van het membraanpellet.Wanneer de ultracentrifugatie van de gelyseerde cellen is voltooid, schenk dan voorzichtig het supernatant af, keer de buisjes vervolgens om op absorberend materiaal en tik er stevig tegenaan. Om overtollig supernatant te verwijderen, markeert u de locatie van elk membraanpellet met een marker ter ondersteuning van de visualisatie. Resuspendeer voorzichtig acht membraanpellets in elk 600 µL gemodificeerde membraanresuspensiebuffer.Het is moeilijk om de membraanpellets opnieuw te suspenderen. Blijf daarom voorzichtig de gemodificeerde membraan-resuspensiebuffer over de pellet gieten totdat deze loslaat van de wand van de buis. Dit is een weitere stap die uitdagend is en cruciaal is voor het algemene succes van het experiment.Schraap indien nodig met de tip van de micropipet het membraanpellet van de wand van de buis. Vermijd bij het pipetteren schuimvorming of belletjes; overmatige schuifkrachten leiden tot de vorming van gemengde cellen, wat membraanscheiding verhindert. Breng elke membraanresuspensie over naar de volgende set van acht buisjes.Resuspendeer de resterende pellets voorzichtig en voeg alle suspensies samen in een steriele buis. Nadat de membraanpellets uit alle 16 buizen zijn verwijderd, worden elke vier buizen gewassen met 600 µL gemodificeerde membraan-resuspensiebuffer. Richt het wassen op het gemarkeerde gebied van elke buis en voeg het wasmiddel toe aan de geresuspendeerde membranen.Herhaal de wasbeurt voor de overige buizen. Incubeer de membranen resus suspensie 30 minuten bij kamertemperatuur onder zachte schudbeweging om DNA af te breken en de reductie van vlokkig materiaal te bevorderen. Neem vervolgens een kleine hoeveelheid van de membraansuspensie af en voer een eiwitkwantificering uit.Om de totale membraanopbrengst te bepalen, bereidt u een verdunning van één-op-één en één-op-drie van de membraansuspensie in 2,5% SDS; verhit de onverdunde één-op-één en één-op-drie membraansuspensies gedurende 10 minuten bij 90 °C. SDS en warmte zijn nodig om O MPS vrij te maken uit de geëxtraheerde membranen. Gebruik de BioRad DC protein assay om de proteïneconcentratie van de membraanresuspensie te kwantificeren.De totale eiwitopbrengst ligt over het algemeen tussen 1 en 1,6 milligram per milliliter. Zodra de eiwitconcentratie in de membraanpreparatie is bepaald, kunnen de monsters worden gescheiden op een sucrosegradiënt. Begin met het bereiden van een reeks sucrose-oplossingen in EDTA.Om de lineaire sucrosegradiënten voor te bereiden, gebruikt u een pipetvulballon om 1,8 milliliters van elke sucroseoplossing in de volgende volgorde in 14 bij 95 millimeter UltraClear ultracentrifugebuizen te gelaagd: 55% 50% 45% 40% 35% en 30%. Breng vervolgens 1,5 milligrams membraanresuspensie aan bovenop elke gradiënt. Laad niet meer dan 1,7 milliliters membraanresuspensie per gradiënt. Weeg elke buis afzonderlijk en pas het eindgewicht zorgvuldig aan door membraanresuspensie toe te voegen of te verwijderen, zodat alle buizen hetzelfde gewicht hebben. Plaats de sucrosegradiënten in een SW 40 TI swinging bucket rotor en centrifugeer gedurende minimaal 17 uur bij 256,000 GS en vier graden Celsius.Stop na 17 uur centrifugeren de centrifuge en verwijder voorzichtig de sucrosegradiënten uit de rotor. Verzamel vervolgens de fracties. Reinig de onderkant van de buis met de sucrosegradiënt zorgvuldig met 70% ethanol.Doorboor vervolgens de bodem van de buis met de 21 gauge naald en vang opeenvolgende fracties van 500 µL uit de gradiënt op in steriele microcentrifugebuisjes. De gradiënt moet door zwaartekracht laten druppelen om de sucrosegradiënt niet te verstoren. Indien het druppelen aan de onderkant van de gradiëntbuis echter stopt, kan er met de vinger een kleine hoeveelheid druk op de bovenkant van de buis worden uitgeoefend.Bepaal tot slot de brekingsindex van elke sucrosegradiëntfractie met behulp van een refractometer en correleer de brekingsindex met een specifieke dichtheid in gram per milliliter. Beoordeel de eiwitlokalisatie van representatieve sucrosegradiëntfracties via SDS-PAGE-scheiding en immunoblotting. Hier is een immunoblot van fracties uit de sucrosegradiënt die is gebruikt om de membranen te scheiden die zijn geëxtraheerd uit de gelyseerde Freis live vaccine-stam; de outer membraanproteïnen van Freis of Omp's zijn gelokaliseerd tussen dichtheden van 1,17 en 1,2 gram per milliliter.Ter vergelijking waren binnenmembraaneiwitten of ip's gelokaliseerd tussen densiteiten van 1,13 en 1,14 gram per milliliter. Vergelijkbare resultaten werden behaald voor de FHU-vier-stam. Ik heb zojuist gedemonstreerd hoe u buitenmembraanvesikels van Francis Cellis kunt extraheren en isoleren via osmotische lyse en sucrose-densiteitsgradiënt-ultracentrifugatie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat bacteriële cellen in de vroege logaritmische groeifase moeten worden gebruikt om deze bacteriële cellen langzaam maar consistent te verdunnen in gedeïoniseerd water tijdens de osmotische glycostap, en om voorzichtig te zijn bij het resuspenderen van de ultracentrifuge membraanpellets. Hiermee is onze membraanscheidingsprocedure voltooid. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw toekomstige experimenten.

method-for-the-isolation-of-francisella-tularensis-outer-membranes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Cian, M. B. et. al., Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the separation of the inner and outer membrane fractions of Gram-negative bacteria using sucrose gradient ultracentrifugation. The membrane fractions are purified and stored at low temperatures for targeted analysis of membrane-specific components.

Separation of Inner and Outer Membrane Fractions of Gram-Negative Bacteria

Source: Watson, D. C., et.al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the isolation and concentration of extracellular vesicles (EVs) derived from the outer membrane of genetically engineered bacteria. The process involves culturing the bacteria to release EVs, followed by sequential centrifugation and filtration steps to remove cells and debris. Finally, ultrafiltration is used to...

Isolation and Enrichment of Outer Membrane-Derived Extracellular Vesicles from Bacteria

Source: Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the isolation of outer membrane vesicles (OMVs) from Legionella pneumophila using sequential centrifugation, sterile filtration, and ultracentrifugation. The purified OMVs, enriched in membrane proteins and lipopolysaccharides, are suitable for host-pathogen interaction studies.

Ultracentrifugation-Based Isolation of Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles

Dit protocol beschrijft intratracheale inentingen van Fischer 344 ratten met Francisella tularensis. Deze procedure bootst pulmonaire blootstelling van mensen aan deze potentiële biothreat agent en kan worden gebruikt voor het testen van vaccins en de therapeutische werkzaamheid tegen pulmonale tularemie.

Intratracheale inoculatie van Fischer 344 ratten met Francisella tularensis

Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Gram-negatieve bacteriën produceren twee ruimtelijk gescheiden membranen. Het buitenste membraan wordt van het binnenste membraan verdeeld door een periplasma en een peptidoglycanlaag. Het vermogen om de dubbele tweelagen van deze microben te isoleren is van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van hun fysiologie en pathogenese.

Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Dit protocol beschrijft grootte-uitsluitingschromatografie, een gemakkelijke en reproduceerbare techniek voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes uit kweeksupernatanten.

Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Dit protocol scheidt onoplosbare celwand- en membraaneiwitten in eenvoudige fracties (1-5 eiwitten) met behulp van preparatieve iso-elektrische focussering (IEF) op basis van iso-elektrisch punt, gevolgd door scheiding op molecuulgewicht. De resulterende fracties kunnen direct worden gebruikt voor immunologische en proteomische analyse zonder verdere zuivering.

Scheiding en fractionering van celwand- en celmembraaneiwitten van Mycobacterium tuberculosis voor stroomafwaartse eiwitanalyse

Leer de isolatie van buitenste membraanvesikels uit Francisella tularensis via osmotische lysis en sucrose-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie. Deze methode scheidt binnenste en buitenste membraanproteïnen voor virulentieonderzoek.

Methode voor de isolatie van Francisella tularensis Buitenste membranen

Meer video's verkennen