Name: Ultrasound-Guided micro-injectie in de muis voorhersenen In Utero At E9.5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer een ultrasone geleide micro-injectiemethode voor het muizen voorbrein in utero bij E9.5. Deze techniek maakt gerichte genexpressiemanipulatie in neurale stamcellen mogelijk voor ontwikkelingsneurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deel 1. Bereid de chirurgische gebied <ol><li> Als het werken met biologisch gevaarlijk reagentia (bijv. retrovirale vectoren), moet de operatie worden uitgevoerd in een bioveiligheid II kast (BSC). De ultrasone backscatter microscoop (UBM) moet naast de BSC te zitten, met de transducer in de BSC, en zijn plaats gehouden door een motor gestuurde ondersteuning op een speciaal ontworpen chirurgische podium. De componenten die nodig zijn om het podium in de video-construct staan ​​on line. Deze lijst, samen met beelden van de etappe vanuit verschillende invalshoeken (beschikbaar op aanvraag), moet het mogelijk maken de bouw. </li><li> Het openen en sluiten van de laparotomie (chirurgische ingreep waarbij de buikholte wordt opengesneden om de toegang tot de interne organen vergunning) wordt meestal uitgevoerd op een absorberende pad met kunststof achterplaat. Voor de operatie alle benodigde tools (bijvoorbeeld scheermes, chirurgische scharen, tangen, geladen autoclip aanvrager, enz.) en materialen (bijv. PBS, hechtingen, verdoving, de muis houder en liggende plaat, enz.) moeten worden gesteriliseerd en geplaatst in de chirurgisch gebied. Het beperken van de hoeveelheid tijd die de incisie open is belangrijk voor het maximaliseren van de kansen op succes met de operatie. Alle dierlijke behandeling moet worden uitgevoerd met handschoenen die zijn ontsmet met MB-10-oplossing, of het equivalent. Herhaalde desinfectie moet worden uitgevoerd als nodig is om te verzekeren dat de handschoenen steriel zijn. </li></ol> Deel 2. Muis Anesthesie <ol><li> Vul een 1 cc spuit met de verdoving oplossing die een deel Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) voor 4 delen gefilterd gesteriliseerd zijn 25 mg / ml magnesium-sulfaat in PBS. Dit zal resulteren in een oplossing die 10 mg / ml pentobarbital en 20 mg / ml magnesiumsulfaat. Elke muis moet individueel worden gewogen, en geïnjecteerd met 90 mg pentobarbital per kg lichaamsgewicht (bijvoorbeeld, zou een 28 gm muis worden geïnjecteerd met 250 pi). </li><li> Injecteren in de buik (intraperitoneaal, IP) van een zwangere muis embryonale dag (E) 9.5 (kan gebruik maken van andere leeftijden als nodig) dringen zowel de huid en de buikspieren. Laat 8-12 minuten voor de muis te worden niet meer reageert. Adequate anesthesie moet worden bevestigd door de ontspannen houding van het dier, en het gebrek aan beweging in reactie op de staart en teen knijpt. Zachtjes knijpen tussen de vingernagels is zeer gevoelig, en het ontbreken van enige reactie op dergelijke knijpen geeft aan dat de dieren voldoende verdoofd. Let op, zelfs dieren die volledig reageren op de staart en teen knijpt kan soms een beetje twitch in reactie op de initiële chirurgische incisie. Echter, dit is een reflexieve respons en duidt niet op onvoldoende anesthesie. Op basis van aardolie oogheelkundige balsem moet worden toegepast op de ogen van de muis om uitdrogen te voorkomen tijdens de operatie. </li><li> Set-up de chirurgische gebied en de ultrasone machine in afwachting van de muis te worden verdoofd. Aangezien het gebruik van retrovirus of lentivirus vereist BSL2 insluiting, zoals hierboven vermeld zijn de virale injecties moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid II kabinet. Daarnaast moeten alle oplossingen en disposable materialen die in contact komt met het virus worden ontsmet met een 10% bleekwater oplossing. De chirurgische instrumenten en echografie apparatuur moet worden behandeld met een steriliserende oplossing zoals MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), of een equivalent wordt gebruikt door de voorziening in kwestie. </li></ol> Deel 3. Blootstelling van de Embryowet <ol><li> Indien mogelijk (afhankelijk van de beperkingen van de gegeven dier-faciliteit en de beschikbare ruimte) heeft het de voorkeur om de chirurgische voorbereiding gebied hebben in een andere locatie dan het operatiegebied. Dit zal de kans op kruisbesmetting tussen dieren. Tot inleiding van de operatie, plaats het dier op zijn rug op een steriele absorberende oppervlak en grondig de buikstreek met 70% ethanol. Meer uitgebreide pre-operatieve behandelingen kunnen worden gebruikt (bijvoorbeeld opeenvolgende rondes van Betadine en 70% ethanol wast), maar in onze ervaring is dit niet nodig voor dit type van knaagdier overleven chirurgie. Met behulp van een dubbele rand scheermes, scheren de haren uit de buik in een gebied van ongeveer 1 cm breed en 1,5 cm lang. Gebruik korte snelle bewegingen met het scheermes op ongeveer een hoek van 45 °. Het is belangrijk dat de chirurgische gebied geschikt worden behandeld, maar niet blootgesteld aan overmatig natmaken, omdat dit kan leiden tot onnodige koeling van de dieren, en mogelijk zelfs onderkoeling. </li><li> Met behulp van fijne chirurgische schaar maken een een 'longitudinale incisie door de huid eerst, en vervolgens door de buikspier van het dier (snijden door middel van bindweefsel die de huid om de spier zal helpen met de tweede snede). Merk op dat de gehele procedure zorg moet worden genomen om te verzekeren dat de chirurgische instrumenten steriel blijven, en de behandeling met een ontsmettingsmiddel worden uitgevoerd als nodig is (dwz als de tooltips in contact komen met niet-steRILE materiaal). </li><li> Met behulp van een tang voorzichtig trekken uit de baarmoeder hoornen, en noteer het aantal embryo's aan elke kant. Terwijl twee embryo's worden blootgesteld aangrenzende (selectie waarvan twee hangt af van de configuratie aan elke kant), plaats het grootste deel van de baarmoederhoorns terug in het dier. In dit verband zal twee embryo's worden blootgesteld op een gegeven moment en badend in PBS, terwijl de moeder blijft op haar rug. </li><li> Leg het dier op zijn rug in het plexiglas houder waar het zal worden tijdens de operatie (Figure1A) *. Vervolgens lager de 10cm weefselkweek schotel ** (dat moet worden gedesinfecteerd met MB-10 voor gebruik) naar beneden over de moeder, met een pincet licht geplaatst via de groene silastic membraan (gemaakt met behulp van L RTV siliconen rubber basis, en verharder; Dow-Corning product nummers 3142761 en 2156946, respectievelijk). Zoals je lager de plaat naar beneden over het dier, gebruik de tang om de baarmoeder weefsel grip tussen de twee embryo's te injecteren, en zachtjes te trekken door het membraan. Op hetzelfde moment, is de plaat helemaal naar beneden op de houder verlaagd en de punaises worden geduwd in om het op zijn plaats houden. Voorverwarmde (tot 37 ° C) PBS wordt dan toegevoegd aan het gerecht volledig dekking van de embryo's. </li><li> Plaats van de injectie stadium waarin het dier en de blootgestelde embryo's onder de ultrasone sonde (Figure1A) om real-time beeldvorming van de blootgestelde embryo's creëren door middel van de baarmoederwand (Figure1B). De sonde wordt dan verlaagd (met behulp van de gemotoriseerde controles) in het PBS bad direct over de embryo's af te beelden. Beelden kunnen worden verkregen wanneer de sonde is ongeveer 2-3 mm afstand van de embryo's. Het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de sonde het hoofd niet in de embryo's hit als het oscilleert heen en weer te verzamelen beelden. </li></ol> * De houder van de moeder rust in tijdens de operatie kan eenvoudig worden gemaakt door een machine winkel. Het moet een brede basis van plexiglas, met twee plexiglas zijkanten gelijmd op de top, en een ruimte tussen hen (breed genoeg voor de muis aan te passen liggend op zijn rug). De zijkanten moeten een vallei grond van hen, die vervolgens wordt gevuld met zwarte was (bijvoorbeeld van een dissectie lade). Dat was fungeert als het materiaal waarin punaises zal worden gedrukt Houd de plaat van PBS dat de embryo's worden gebaad in de loop van injectie. ** 10cm bacteriële gerechten moeten een gat (circa 2 cm in diameter) gestanst uit het midden van de bodem (dit kan worden gedaan met een Heavy Duty Portable Punch en een 13/16 ste inch rond sterven: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Daarnaast moeten twee kleine gaatjes aan weerszijden van het gat in het midden (ongeveer 1,5 cm afstand) worden verbrand met een vlam verwarmde naald (of ze kunnen worden gemaakt met een boor natuurlijk). Deze gaten zijn dan bedekt met vacuüm vet en zal zijn waar de punaises die de plaat op de houder te houden door te zetten in de zwarte was. Het vacuüm vet is om het PBS te voorkomen dat naar buiten lekken. Deel 4. Het laden Virus in een micro-injectie naald <ol><li> Fashion een micro-injectie naald door afschuining een 1 mm (inwendige diameter) getrokken glas capillair. De scherpte van de naald is van cruciaal belang, en werken met een onvoldoende scherpe naald kan ernstig in gevaar penetratie van de baarmoederwand en de amnionic weg, en kan leiden tot experimentele mislukking. De geslepen naald wordt vervolgens geplaatst in de pipet houder, die verbonden is via een slang aan op 25 il micro gemonteerd in een handleiding infuus / terugtrekking pomp (andere apparaten kunnen worden gebruikt voor het laden en lossen van de naald te regelen, maar dit is wat er weergegeven in de video). Voor een optimale responsiviteit (de uitbreiding en compressie verband gebracht met een met lucht gevulde systeem te voorkomen), moet de micro-, slangen, en naald worden gevuld met minerale olie. </li><li> Voorafgaand aan het laden van de naald zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem van de spuit helemaal naar de punt van de naald. Vervolgens terug te trekken een kleine luchtbel (1-2 mm in de lengte) in de naald voorafgaand aan het starten om virus te laden. Deze lucht pocket helpt om scheiding tussen het virus en de minerale olie. De virale voorraad worden geïnjecteerd moet bevatten polybreen bij een uiteindelijke concentratie van 0,08 mg / ml (voor meer informatie over virus productie verwijzen wij u naar referenties 1, 2). Merk op dat geconcentreerde retrovirale voorraden over het algemeen een aanzienlijke hoeveelheid fijn stof, die de meerderheid van de besmettelijke materiaal bevat bevatten, en kunnen dus niet worden gefilterd zonder een 5 - tot 10-voudige daling van de titer. Ook, afhankelijk van de voorbereiding, kan de virale voorraad worden viskeuze uit het genomisch DNA van gelyseerde verpakking cellen (vooral het geval bij gebruik van 293-cellen tot MLV / VSV pseudogetypeerde virus te genereren). Als de hoeveelheid van het virus is viskeus, een kleine hoeveelheid DNAse I kan en moet worden toegevoegd aan de voorraad los te maken, of het laden van de naald zal het uiterst moeilijk. Een druppel van de virale voorraad (8-10 pi) moet worden gelegd op een steriel stuk parafilm ter voorbereiding van de naald laden. Dan, met de terugtrekking pomp, voorzichtig de naald aandacht te besteden aan klompen te voorkomen. Plaats de geladen naald in de micromanipulator positie in het injectiegebied, zorg dat u de naald op de embryo's, of het echoapparaat te breken. Merk op dat als om wat voor reden dan ook de naald is sterk geladen voordat de injectie moet plaatsvinden kan het handig zijn om een ​​kleine hoeveelheid lucht te trekken naar de tip, die vooraf kan worden afgevoerd naar het starten van de injecties. Deze luchtzak kan beschermen tegen de virale voorraad drogen bij de punt van de naald (een gebeurtenis die bijna altijd te maken dat de geplaatste naald nutteloos). </li></ol> Deel 5. Echografie Begeleide Viral Injection <ol><li> De real-time beeld gecreëerd door de ultrasone sonde is gevisualiseerd op de video-monitor, en kan gebruikt worden om de micro-injectie naald gids in het embryo. Met behulp van dit systeem virus kan worden geïnjecteerd in de vruchtzak van E8.5 of een van de vruchtzak of het ventriculaire systeem van E9.5-E11.5 (Figure1B). Dit is het moeilijkste deel van de procedure en vereist een aanzienlijke hoeveelheid hands on ervaring de knie te krijgen (in de orde van 5-20 uur, afhankelijk van de onderzoeker). De punt van de naald is zichtbaar in de echografie beeld als de helderste plek op het scherm, en moet worden gezien bewegen in overeenstemming met de aanpassingen van de probe positie (met behulp van de gemotoriseerde besturingselementen in de y en z vliegtuigen, en de manuele bediening in de x vlak). Het is van cruciaal belang dat de oscillatie richting van de probe wordt parallel aan de lengte van de naald. Dit zorgt ervoor dat de naaldpunt blijft in het beeldvlak in beweging is naar de positie voor injectie in de embryo. </li><li> Het embryo moet worden geplaatst zodanig dat de doelstelling regio (in dit geval de voorhersenen ventrikel) is goed zichtbaar en toegankelijk is voor de naald met de minste hoeveelheid materiaal in de baarmoeder de injectie pad. Daarnaast is het essentieel niet te injecteren via de placenta. Zodra het doel hersengebied is bekleed met de richting van de naald vooruitgang (met behulp van de knop aan de micromanipulator), moet de naald net aanraken van de baarmoederwand, en dan een korte snelle jab naar voren moeten het weefsel doordringen. Een soortgelijke benadering wordt gebruikt om de amnionic zak en vervolgens in de hersenen binnendringen. In sommige gevallen, en ervaren onderzoeker kan de ventrikel raken in een beweging, vooral als de naald is zeer scherp. De mechanica van het verplaatsen van de sonde, de naald, en de embryo's (door het verplaatsen van de moeder op het podium), vereisen hands-on praktijk de knie te krijgen. </li><li> Zodra het gewenste aantal embryo's is geïnjecteerd, sluit de buikwand met 5,0 zijden hechtingen. De mechanica van hechten zijn niet specifiek voor deze vorm van chirurgie. Tot slot, de veterinaire autoclips gebruiken samen te nieten de huid over de steken in de buikspier. Hechten van de huid wordt niet aangeraden, omdat de muis uit knagen de steken. Analgesie moet worden toegepast op de incisie gebied om de hoeveelheid pijn ervaren door de muis als het ontwaakt te verminderen. Het is aanbevolen dat een 0,25%-oplossing Bupivacaïne worden geïnjecteerd (0,8 ml / kg, of 2 mg / kg) subcutaan om de paar millimeters langs de incisie site. </li><li> Terwijl de muis zich herstelt voorzichtig lag het dier op absorberend papier in een schone kooi met daarin een gel pack (voor het voeden en hydratatie te vergemakkelijken). Plaats de kooi op een dia warmer ingesteld op 37 ° C tot lichaamstemperatuur te handhaven. Toen ontwaakte, plaatst u de muis en de gel-pak in een schone kooi en terug te keren naar het dier rack. </li><li> De volgende dag controleert de muis voor een vaginale bloeden, abdominale contracties en / of een algemeen distressed look, die allemaal wijzen op abortus. Als dit het geval is, onmiddellijk laten inslapen van de muis. Goed verzorgd haar en een algehele gezonde uitstraling geven aan een succesvol herstel van een operatie. De geïnjecteerde embryo's kunnen embryonaal of postnataal worden opgeofferd voor verdere analyse. Als het virus drukt een reportergen, zoals humaan alkalische fosfatase (PLAP) of GFP, zal een vlekken onthullen gebieden van positieve virale infectie (Figure1C). </li></ol> Representatieve resultaten Geïnjecteerde embryo's kunnen worden opgeofferd 1-2 dagen na injectie helemaal door naar volwassenheid. Als het virus drukt een reportergen, zoals PLAP of GFP, dan reporter uitdrukking dient te identificeren viraal geïnfecteerde cellen en klonen van deze cellen. Bijvoorbeeld, afgebeeld in figuur 1C is een weefsel gedeelte van een postnatale hersenen die was in de baarmoeder besmet bij E9.5 met een retrovirale vector die PLAP. Geïnfecteerde cellen worden gevisualiseerd als paars clusters na histochemische kleuring. In aanvulling op het identificeren van viraal geïnfecteerde cellen, reporter uitdrukking laat toe om na te gaan celmorfologie en positie, evenals genexpressie status. nt "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Viral injectie in de E9.5 muis voorhersenen ventrikels. A. De verdoofde dier wordt geplaatst op de injectie podium. Twee embryo's zouden worden blootgesteld en gepositioneerd onder het echoapparaat waar aangegeven (pijl). De micro-injectie naald gevuld met virus is gelegen nabij de embryo's en bekleed met het echoapparaat. B. Screen capture van een real-time echografie afbeelding van een E9.5 muis embryo. V, ventrikel, AS, vruchtzak, UW, baarmoederwand. C. Embryo's werden geïnjecteerd met een PLAP expressie virus op E10.5. Histochemische kleuring voor PLAP onthult de locatie van de virale infectie gebeurtenissen.

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

Virale injecties met behulp van echografie begeleiding kunnen worden uitgevoerd vanuit E8.5-E11.5, waarbij alleen de vruchtzak kan worden geïnjecteerd in E8.5, terwijl zowel de vruchtzak en ventriculaire systeem kan worden geïnjecteerd bij E9.5-E11.5. Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, virale deeltjes ingespoten in het ventriculaire systeem met behulp van echografie begeleiding hebben toegang tot de epitheelcellen van de ventriculaire systeem en daarom kunnen de verschillende structuren van de voorhersenen (neocortex, basale ganglia, diencephalon, ogen, enz.), middenhersenen infecteren , en achterhersenen (Figure1C). Virus geïnjecteerd in de vruchtzak heeft toegang tot de cellen aan de buitenkant van het embryo. In aanvulling op virus, kan echografie begeleiding ook worden gebruikt om cellen te injecteren in de zich ontwikkelende embryo. Daarom is deze techniek biedt meerdere opties om uit te kiezen (ontwikkelings-periode, de structuur, virus / cellen) bij het ontwerpen van een experiment. Het is cruciaal dat de geïnjecteerde virus of cellen een verslaggever voor gemakkelijke identificatie van geïnfecteerde / geïnjecteerde cellen uit te drukken. Historisch gezien hebben de menselijke placenta alkalische fosfatase (PLAP) of GFP zijn gebruikt. Uit ervaring hebben we gemerkt PLAP kunnen een zeer nuttige reporter-gen zijn omdat zowel PLAP histochemische en immunohistochemische kleuring geeft een scherp en duidelijk single cell vlek die het mogelijk maakt een te analyseren celmorfologie en positie, en om een ​​klonale analyse uit te voeren. Sinds virale GFP expressie kan worden vaag, kan een GFP reporter niet ideaal voor de kleuren van het weefsel, maar het is handig als men wil enkele cellen te verkrijgen door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS).

&quot;Een van de volgende echo backscatter microscopen kan worden gebruikt voor deze procedure. Hoewel in de video van de P40 van de Paradigm-Medical is gebruikt, is de P40 is niet langer commercieel beschikbaar, en is vervangen door de P60, die op soortgelijke wijze is geprijsd en kunnen worden gebruikt voor dezelfde toepassing. De extra materialen omschreven voor fase bouw zijn voor gebruik met Paradigm-Medical device (s). De Vevo 2100 wordt geleverd met apparatuur voor beeldvorming van kleine proefdieren. <ol><li> P60 Echografie biomicroscoop (UBM) van Paradigm-Medical ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 van VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestheticum en Pijnstillende De Nembutal-oplossing (50 mg / ml injecteerbare natriumpentobarbital; geproduceerd door Abbott Laboratories) kan worden verkregen bij Bulter Schein Animal Health. Merk op dat dit is een schema II gereguleerde stof en vereist een Drug Enforcement Agency (DEA) licentie te verkrijgen. De Bupivacaïne-oplossing (0,25%, geproduceerd door Hospira, Inc, onder andere) kan worden verkregen bij een aantal distributeurs, waaronder Moore Medical.

ultrasound-guided micro-injectie in de muis voorhersenen in utero at e9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero overleven chirurgie bij muizen laat de moleculaire manipulatie van genexpressie tijdens de ontwikkeling. Echter, omdat de baarmoederwand is ondoorzichtig tijdens de vroege embryogenese, is de mogelijkheid om specifieke delen van het embryo voor de micro-injectie doelgroep sterk beperkt. Gelukkig hoogfrequente ultrasone beeldvorming maakt de generatie van de beelden die gebruikt kunnen worden in real time op een micro-injectie naald gids in de embryonale regio van belang. Hier beschrijven we het gebruik van dergelijke beeldvorming om de injectie van retrovirale vectoren begeleiden in het ventriculaire systeem van de muis voorhersenen op embryonale dag (E) 9.5. Deze methode maakt gebruik van een laparotomie om toegang te verlenen tot de baarmoeder hoornen, en een speciaal ontworpen plaat die host embryo&#39;s toelaat om te baden in een zoutoplossing, terwijl ze worden afgebeeld en geïnjecteerd. Succesvolle operaties resulteren vaak in de meeste of alle van de geïnjecteerde embryo&#39;s overleven op een later tijdstip bezienswaardigheid (embryonaal of postnataal). De principes hier beschreven kan worden gebruikt met lichte wijzigingen van injecties uit te voeren in de amnionic vloeistof van E8.5 embryo&#39;s (en daarmee het toelaat infectie langs de voorste achterste deel van de neurale buis, die nog niet is gesloten), of in de ventriculaire systeem van de hersenen op E10.5/11.5. Bovendien, bij mid-neurogene leeftijden (~ E13.5), kan echografie gebruikt worden directe injectie in specifieke hersengebieden voor virale infectie of stamceltransplantatie. Het gebruik van echografie te begeleiden in utero injecties bij muizen is een zeer krachtige techniek die de moleculaire en cellulaire manipulatie van muis embryo&#39;s toelaat op een manier die anders zouden zijn buitengewoon moeilijk zo niet onmogelijk.

In utero overleven chirurgie bij muizen laat de moleculaire manipulatie van genexpressie tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we het gebruik van hoge-frequentie ultrasonografie om de injectie van retrovirale vectoren gids in de muis hersenen op embryonale dag (E) 9.5.

Ultrasound-Guided micro-injectie in de muis voorhersenen In Utero At E9.5

In utero survivalchirurgie bij muizen maakt moleculaire manipulatie van genexpressie tijdens de ontwikkeling mogelijk. Omdat de baarmoederwand echter opaak is ...

Het algemene doel van deze procedure is het afleveren van retrovirale vectoren in de voorhersenen van de muis voorafgaand aan het begin van de neurogenese in dat gebied. Deze methode maakt transductie van kiemzonecellen met genen van belang mogelijk. Andere virale vectoren of cellen kunnen eveneens met deze methode worden geïnjecteerd.Dit wordt bereikt door eerst een laparotomie uit te voeren bij een geanestheseerde drachtige muis, wat toegang tot de embryo's mogelijk maakt. De tweede stap van de procedure is om de drachtige muis op de injectietafel onder de echotransducer te plaatsen. Positioneer vervolgens de embryo's op de plaat voor injectie.De derde stap van de procedure is het gebruik van het real-time echobeeld om de micro-injectienaald naar de beoogde injectieplaats te geleiden. Embryo's worden opeenvolgend geïnjecteerd tot het gewenste aantal is bereikt. De laatste stap van de procedure is het verwijderen van de muis uit het injectieapparaat en het sluiten van de incisies in de lichaamswand, spieren en huid.Het dier krijgt vervolgens de tijd om te herstellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de locatie en fenotypische kenmerken van geïnfecteerde cellen aantonen via detectie van een specifiek reportergen in weefselcoupes en labeling met celtype-specifieke markers. Hallo, ik ben Taryn Pier Fois van het laboratorium van Nick Guyano in het Neurogeneration-programma aan de Johns Hopkins University School of Medicine.Vandaag tonen we u een procedure waarbij echografie wordt gebruikt om de microinjectie van retrovirale vectoren in de hersenen van een muis in utero op embryonale dag 9,5 te begeleiden. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om het effect van het manipuleren van de genexpressie tijdens de vroege hersenontwikkeling op het gedrag van neurale stam- en progenitorcellen en de cellulaire specificatie te bestuderen. Laten we beginnen.Als de injecties gemodificeerde virale vectoren bevatten, moet de procedure in een biosafety cabinet klasse 2 worden uitgevoerd. Plaats een geanestheseerde drachtige muis op haar rug. Gebruik een fijn chirurgisch schaartje om een longitudinale incisie van één inch door de huid te maken langs de middellijn.Verwijder het bindweefsel dat zich tussen de huid en de spieren rondom de incisie bevindt. Maak vervolgens met een pincet een iets kortere incisie door de buikspier. Trek de uterine hoorns voorzichtig naar buiten.Noteer het aantal embryo's aan elke zijde. Verplaats het dier naar de injectietafel van plexiglas om de embryo's te beschermen.Plaats het grootste deel van de uterine hoorns terug in het dier, waarbij slechts twee aangrenzende embryo's bloot blijven liggen. Gebruik een Petrischaal van 10 centimeter met twee kleine gaatjes (gemaakt met een punaise) en een centraal gat van twee centimeter dat is afgedicht met een stuk scholastisch membraan om de embryo's vochtig te houden. Gebruik een pincet dat enigszins door het scholastische membraan wordt geduwd.Plaats de schaal over de moeder. Terwijl de schaal wordt neergelaten, grijpt u het baarmoedertissue tussen de twee geselecteerde embryo's en trekt u deze voorzichtig door het membraan zodra de schaal is geplaatst.Zet het vast met twee punaise door de kleinere gaatjes in de was. Vul het schaaltje met 1x PBS bij 37 °C om de embryo's vochtig te houden. Positioneer de embryo's parallel aan de lengteas van de moeder.Plaats de injectietafel onder de echoprobe. Laat de probe zakken tot ongeveer twee tot drie millimeter boven de embryo's. Voor heldere echobeelden is het cruciaal dat de probekop de embryo's niet raakt terwijl deze heen en weer oscilleert.Voor het verzamelen van beelden koppelt u de naald aan een microspuit van 25 µL die is gemonteerd in een handmatige infusie- en extractiepomp. Plaats een schuine, geslepen micro-injectienaald in een pipethouder. Oefen lichte druk uit op een spuit van 10 cc gevuld met minerale olie in het bovenste deel van de stopkraan om olie door de slang, de houder van de micro-injectienaald en de naald te spoelen, en trek vervolgens olie op in de microspuit.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Trek een luchtbel van één tot twee millimeter lang in de naald. Gebruik de vacuümpomp om de naald voorzichtig te vullen met de virusoplossing, zodat de scheiding tussen de minerale olie en het virus behouden blijft.Trek de oplossing gelijkmatig en langzaam op en let erop dat er geen verstoppingen ontstaan. Plaats de geladen naald in de positie van de micromanipulator in het injectiegebied. Zorg ervoor dat de naald niet breekt op de embryo's of de ultrasoonprobe.Verplaats de injectienaald naar een positie van één tot twee millimeter van de baarmoederwand. Onder een hoek van ongeveer 45 graden worden de door de echoprobe gegenereerde beelden op een videomonitor gevisualiseerd. De naaldpunt verschijnt als het helderste punt op het scherm.Zorg ervoor dat de oscillatierichting van de probe parallel loopt aan de lengte van de naald. Positioneer het embryo aan de hand van het echobeeld op de videomonitor zodanig dat het doelgebied, in dit geval de vierde hersenkamer, duidelijk zichtbaar en toegankelijk is voor de naald. Lijn het doelgebied in de hersenen uit met de voortbeweginingsrichting van de naald.Gebruik de micromanipulator om de punt van de naald tot net tegen de baarmoederwand te brengen. Steek de naal snel naar voren om het baarmoederweefsel te penetreren. Er kunnen meerdere soortgelijke steken nodig zijn om het vruchtzakje te penetreren en het embryo te injecteren met het juiste volume virus.Bij een succesvolle injectie komt een fijnstofachtige nevel in het ventrikel terecht en kan de ventriculaire ruimte enigszins uitzetten; trek de naald ongeveer vijf millimeter terug voordat het volgende embryo wordt geïnjecteerd. Wanneer beide embryo's zijn geïnjecteerd, gebruik dan een pincet om de volgende twee embryo's door het scholostische membraan te trekken en plaats de geïnjecteerde embryo's terug in de buikholte. Zodra het gewenste aantal embryo's is geïnjecteerd en terug in de buikholte is geplaatst, verplaatst u de muis van de injectietafel naar een absorberend kussen.Om de incisie te sluiten, laat u het dier herstellen in een schone, verwarmde kooi. Deze schermopname van een real-time echobeeld van een muisembryo van E 9.5 toont verschillende anatomische kenmerken die gebruikt kunnen worden om injecties te begeleiden. Hier is V het ventrikel, terwijl de vruchtzak en uw de baarmoederwand zijn.De injectienaald is het heldere punt aan de rechterkant van de afbeelding. In deze afbeelding vertoont een embryo dat is geïnjecteerd met A-P-L-A-P-expresserend virus PLAP-positieve viraal geïnfecteerde cellen binnen de ontwikkelende hersenen. Enkele weken na de infectie maakt de expressie van de reporter het mogelijk om de celmorfologie en celpositie te onderzoeken, evenals een clonale analyse uit te voeren.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een echogeleide micro-injectie van een retrovirale vector in muisembryo's in utero uitvoert op embryonale dag 9,5. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel te handelen, aangezien de overlevingskans groter is naarmate de muis minder lang wordt gemanipuleerd tijdens de operatie. Het is daarnaast belangrijk om voorzichtig te zijn bij het gebruik van biologisch gevaarlijke materialen, zoals retrovirale vectoren.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren...

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Hier presenteren we een protocol om echografie microbellen contrastmiddelen in levende, geïsoleerde late zwangerschap stadium muizen embryo's te injecteren. Deze methode maakt de studie van perfusie parameters en vasculaire moleculaire merkers binnen het embryo met contrastmiddel hoogfrequente ultrasone beeldvorming.

Contrast Imaging in muis embryo&#39;s met behulp van hoge-frequentie Ultrasound

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.

Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer een ultrasone geleide micro-injectiemethode voor het muizen voorbrein in utero bij E9.5. Deze techniek maakt gerichte genexpressiemanipulatie in neurale stamcellen mogelijk voor ontwikkelingsneurowetenschappelijk onderzoek.

Ultrasound-Guided micro-injectie in de muis voorhersenen In Utero At E9.5

Meer video's verkennen