Name: Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie om dynamische histonmodificaties te analyseren tijdens STAT1-geactiveerde genexpressie in menselijke cellen. Deze methode kwantificeert transcriptiefactorbezetting en chromatineveranderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de Universiteit van Virginia, de Universiteit van Virginia Cancer Center en The Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Wij danken de James E. Darnell Lab (Rockefeller University) de Robert Ross Lab (Fordham University) voor cellijnen.

PLANNING De dag voor een ChIP experiment is gepland, moeten cellen worden gekweekt, zodat een voldoende aantal beschikbaar is. Ga ervan uit dat elke chip test zal ~ 1-1,5 x 10 7 cellen vereisen. Altijd van plan om zowel de negatieve (IgG) en positieve (pan histone antilichaam) controles en dubbele experimenten te doen. Tip - Voor 2FTGH cellen, elke chip test duurt ongeveer een 15 cm weefselkweek schotel bij 80% confluentie. DEEL 1: bereid chromatine en uit te voeren ChIP <ol><li> Verwijder de cultuur media en induceren cellen voor de keren dat nodig is met 20 ml van 10% kosmische kalf serum (CCS) / DMEM met IFN-gamma op 5 ng / ml. Vervang de media op de niet-geïnduceerde borden met 20 ml van 10% CCS / DMEM ook. </li><li> In een zuurkast, voeg 540 ul 37% formaldehyde en 20 ml van de media (1% eindconcentratie) in de 15 cm schotel. Tip - Tilt plaat en voeg de formaldehyde aan de mediagroep - dan rots plaat gelijkmatig te verspreiden. </li><li> Laat verknoping om door te gaan gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg toe aan 0,125 M glycine uiteindelijke concentratie verknoping te stoppen. </li><li> Vacuüm zuigen van de media en een keer wassen cellen met 10 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Verzamel cellen met een cel schraper in ~ 7 ml PBS en combineer cellen (vanaf 6 platen) die identiek behandeld werden in 50 ml conische buis op ijs. </li><li> Centrifuge (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrifugeer) bij 1800 tpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten en zuig het PBS. Tip - Snap bevriezing van de celpellet indien stoppen hier en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 4 mL Zwelling buffer (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Voeg 1 mM DTT, Complete proteaseremmers en chillen op het ijs voor gebruik) en over te dragen aan een 15 mL conische buis. Tip - Deze zwelling buffer volume is geschikt voor een 6 plaat pooling (~ 6-9 x 10 7 cellen). Meer of minder buffer kan veranderen de douncing efficiency. </li><li> Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Overdracht vering om een ​​pre-gekoelde 15 ml douncer (Wheaton) en dounce 20 slagen met stamper A. </li><li> Overdracht dounced cellen terug naar een 15 ml conische buis op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de nucleaire pellet (~ 200 pi van 6 platen) in 3 ml (15 pellet volumes) van Ultrasoonbehandeling buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS. Add Compleet protease-inhibitoren en chillen op het ijs vlak voor gebruik). Tip - Deze sonicatie buffer volume is geschikt voor een 6 plaat pooling (~ 6-9 x 10 7 cellen). Meer of minder buffer kan veranderen de ultrasoonapparaat efficiency. </li><li> Ultrasone trillingen kernen schorsing op ijs gedurende 10 cycli (20 seconden on/40 seconde uit / amplitude instelling van 8) met behulp van een Misonix ultrasoonapparaat 3000 uitgerust met de microtip. Dit resulteert meestal in chromatine fragmenten van gemiddeld 200-1000 basispunten in grootte. Tip - Omdat sonicators zal variëren, de sonicatie efficiëntie moet empirisch worden bepaald. Om dit te doen, neem fracties van 20 il voor sonificatie en na elke sonicatie cyclus. Warmte deze monsters bij 65 ° C gedurende 4 uur. Voeg DNA laadbuffer en uitvoeren van een standaard 1% agarose / TBE gel om DNA-fragmenten visualiseren.) </li><li> Overdracht gesoniceerde materiaal naar een SS34 centrifugebuis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C bij 13000 rpm in een SS34 rotor (Sorvall RC6 Plus Centrifugeer) om pellet wat is meestal een kleine hoeveelheid van de cel puin. </li><li> Breng voorzichtig de supernatant om een ​​15 ml conische buis op ijs. </li><li> Pre-clear door het toevoegen van 360 pi zalmsperma DNA / Proteïne A of G agarose parels drijfmest en rocken bij 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Tip - Deze stap vermindert de ruis in de test die voortvloeit uit niet-specifieke binding gebeurtenissen. </li><li> Centrifugeer bij 1000 tpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten om pellet de agarose parels. </li><li> Transfer pre-goedgekeurde supernatant naar de andere 15 ml conische buis op ijs. </li><li> Meet de A260-eenheden van de pre-gewist chromatine en regel het volume met Ultrasoonbehandeling Buffer naar vier (4) A260-eenheden (0,2 mg / ml uitgaande van een A260-eenheid = 0,050 mg / ml) Tip - Om de A260-eenheden te meten, verdunnen 10 pi van pre-goedgekeurde chromatine in 190 pL DDW; blanco spectrofotometer met 10 pi sonicatie buffer in 190 uL DDW. </li><li> Bespaar 75 pi van het chromatine (op 4 A260-eenheden) als de Input Sample en bewaar bij 20 ° C tot gebruik verknopingen te keren. Tip - Deze stap is cruciaal voor data-analyse. Vergeet niet, aan de ingang aliquot te nemen. </li><li> Aliquot de chromatine bereid om 1,7 ml microfugebuizen buizen op ice als 1 ml monsters. Tip - Als het stoppen van hier, bevriezen de voorbereide chromatine op droog ijs en op te slaan snap bij -80 ° C. NB: opgeslagen chromatine kan degraderen, die minder dan een optimaal resultaat, dus vermijd indien mogelijk. </li><li> Voeg de ChIP-grade antilichamen tegen de geïnduceerde en niet-geïnduceerde samples sets tweevoud in. Voeg IgG (2 ug) en pan histon H3 antilichaam (15 pi) als de negatieve en positieve controles geïnduceerde en niet-geïnduceerde samples sets. Tip - De hoeveelheid antilichamen gebruiken, moet empirisch worden bepaald of raadpleeg de leverancier product sheet voor aanbevolen hoeveelheden. Typisch 1-2 ug van een ChIP-grade antistof werkt goed. Het juiste volume dient empirisch te worden vastgesteld voor de antilichamen die worden geleverd als serum. </li><li> 'S nachts rots alle buizen bij 4 ° C. </li></ol> DEEL 2: Verzamel immunocomplexen <ol><li> Voeg 60 ul van zalmsperma DNA / proteïne A of proteïne G agarose parels drijfmest op alle buizen. Tip Gebruik Proteïne A voor konijnen polyklonale antilichamen en Proteïne G voor de muis monoklonale antilichamen. </li><li> Rots bij 4 ° C gedurende ten minste 60 minuten. </li><li> Pellet de immunocomplexen (agarose parels) door microfuging voorzichtig bij 2000 tpm bij 4 ° C gedurende 3 minuten. </li><li> Zuig het supernatant. </li><li> Was de immunocomplexen met 1 ml van elk van de volgende Wash Buffers voor 10 minuten met rocken bij 4 ° C. Microfuge gedurende 3 minuten bij 2000 rpm bij 4 ° C tussen elke wasbeurt en zuig supernatant. Houden monsters gekoeld op ijs. Voeg PMSF vlak voor gebruik. <ul><li> Low Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> Hoge Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF </li><li> TE Wash - twee wassen met TE-buffer -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF </li></ul></li><li> Verwijder de laatste TE-buffer te wassen en naar de kralen, voeg 500 ul elutiebuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Tip - de elutiebuffer moet vers worden bereid. </li><li> Vortex op agarose parels mengen in elutiebuffer en verwarm gedurende 30 minuten bij 65 ° C. Tip - vortex elke buis ten minste om de 10 minuten tijdens deze 30 minuten. </li><li> Microfuge gedurende 30 seconden bij 2000 rpm en breng het eluens naar een nieuw microfugebuis. Tip - Tijdens de elutie, dooi uw input samples en 500 ui elutiebuffer aan ieder toe te voegen. Inclusief deze monsters in alle stappen voor de toekomst. </li><li> Voeg 5 M NaCl tot een uiteindelijke concentratie van 200 mm tot alle monsters en vortex. </li><li> Incubeer bij 65 ° C gedurende de nacht (of ten minste 4 uur). </li></ol> DEEL 3: zuiveren ChIP'd EN INPUT DNA <ol><li> Microfuge alle monsters gedurende 30 seconden om condensatie te verzamelen over deksels. </li><li> Voeg 1μL van RNAse A (10 U / pl) aan elke buis en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 10 pi 0,5 M EDTA, 40 pi 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 pl proteïnase K (10 mg / ml) en incubeer bij 45 ° C gedurende 60 minuten. Tip Maak een master mix van deze reagentia en voeg 52 ul aan elke buis. </li><li> Fenol / chloroform / isoamylalcohol extract en dan chloroform / isoamylalcohol extract van de monsters. </li><li> Voeg 2 pl glycogeen (25 ug / pi) en 0,1 volumes van 3M Na acetaat pH 5,2 en vortex. </li><li> Voeg 2,5 volumes 100% ethanol en vortex. </li><li> Incubeer bij 20 ° C gedurende de nacht. </li></ol> DEEL 4: zuiveren ChIP'd EN INPUT DNA VERVOLG <ol><li> Microfuge monsters voor een minimum van 20 minuten bij 13000 rpm bij 4 ° C voor het neerslaan van de DNA / glycogeen pellets. </li><li> Was met DNA / glycogeen pellets met 1 ml van 70% ethanol. </li><li> De lucht drogen van de pellets of drogen snel in het DNA Savant snelheid vacuüm centrifuge. Tip - niet te droog het DNA. </li><li> Resuspendeer DNA / glycogeen pellets in 200 pi TE-buffer. </li><li> DNA (een pi) is klaar voor de kwantificering via real-time PCR. Bewaar de resterende DNA bij 20 ° C. Tip - Het gebruik van meer dan 1 pi van het DNA kan de real-time PCR-reacties te remmen, zodat op schaal met de nodige voorzichtigheid. </li></ol> Deel 5: representatieve resultaten: ChIP en Input DNA-monsters worden gekwantificeerd met de Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) met behulp van primers die specifiek zijn voor het gen locus van belang. Primers die richt zich op bekende genomische sequentie te worden verrijkt of ontbreekt in de histon-modificaties die getest kan worden gebruikt als positieve en negatieve controles ook. Gegevens worden gepresenteerd als percentage van de input. De ChIP procedure moet volledig worden repeated met drie biologische repliceert om ervoor te zorgen gemelde veranderingen in de histon modificaties zijn statistisch significant. Er zijn een aantal belangrijke kwesties om te overwegen bij het gebruik van real-time PCR op DNA, met inbegrip primer design, PCR-efficiëntie, en de juiste manier is om het percentage van de input en normalisatie procedures te berekenen kwantificeren. Bij het profileren van histon-eiwitten bezetting in een gen, moet de PCR-efficiëntie consistent zijn onder alle primer paren. De real-time PCR-systeem fabrikant kan de nodige informatie en opleiding. Figuur 1 toont representatieve resultaten van chromatine immunogeprecipiteerd tijdens STAT1 activering van het IRF1 gen 9, veroorzaakt door IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Bezettingsgraad van STAT1, RNA polymerase II en H3K36me3 is dynamisch tijdens STAT1 activering van het IRF1 gen. (A, B, C) ​​chip met α-H3K36me3, α-STAT1 en α-Pol II van chromatine verzameld van 2FTGH cellen geïnduceerd met IFN-γ gedurende 30 minuten (rode vierkanten), 1,5 uur (blauwe cirkels), 5 uur ( groene driehoeken) of niet-geïnduceerde (zwarte diamanten). IgG is de negatieve controle (grijs kruisjes). (D) Pan H3 is de positieve controle en toont de histon bezettingsgraad over de locus in de geïnduceerde (blauwe cirkels) en geïnduceerde voorwaarden (zwarte diamanten). De dip ongeveer -5 bp is te wijten aan het nucleosoom uitputting die wordt gevonden op de transcriptie start sites.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

De geschetste ChIP protocol is met succes gebruikt in het lab voor het testen van meer dan twintig verschillende histon-modificaties. Daarnaast hebben we gekarakteriseerd veranderingen in de bezetting van transcriptiefactoren, histon-modificerende enzymen, eiwitten die histon modificaties en het RNA polymerase II de transcriptie machinerie te herkennen, op een aantal IFN-γ geïnduceerde genen. We hebben ook gebruik gemaakt van de procedure om veranderingen in histon modificaties karakteriseren tijdens de differentiatie v...

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/Isoamylalcohol</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Protease Inhibitors</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glycogeen</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Deoxycholzuurnatrium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/isoamyl</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteïnase K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>Zalm-sperma DNA/Proteïne A Agarose</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>Zalm-sperma DNA/Proteïne G Agarose</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA-polymerase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitatie (chip) om assay dynamic histon-eiwitten in actieve genexpressie in menselijke cellen

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In antwoord op een verscheidenheid van extracellulaire liganden, het STAT (signaal transducer en activator van transcriptie) transcriptiefactoren snel gerekruteerd uit hun latente toestand in het cytoplasma naar receptoren op het celoppervlak, waar ze worden door fosforylatie geactiveerd op een tyrosine residu 1. Vervolgens dimeriseren en verplaatsen naar de kern om de transcriptie van doelwitgenen rijden, gevolgen hebben voor groei, differentiatie, homeostase en de immuunrespons. Niet verrassend, gezien hun brede betrokkenheid bij normale cel processen, ontregeling van de STAT functie draagt ​​bij aan menselijke ziekten, met name om vormen van kanker en auto-immuunziekten 2 3. Het is bekend dat transcriptie wordt gereguleerd door veranderingen in het chromatine template 4,5. Deze veranderingen omvatten de activiteiten van de ATP-afhankelijke complexen, evenals covalente histon-modificaties en DNA-methylatie 6. Vanwege STAT activatie van gen-expressie is zowel snel als van voorbijgaande aard, het vereist specifieke mechanismen voor het moduleren van de chromatine template op STAT-afhankelijke genloci. Te definiëren deze mechanismen, we karakteriseren de histon modificaties en de enzymatische activiteiten die ze genereren op genloci die reageren op STAT-signalering. Dit protocol beschrijft chromatine immunoprecipitatie, een methode die is waardevol voor de studie van STAT signalering naar chromatine in actief genexpressie.

Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

Als reactie op een verscheidenheid aan extracellulaire liganden worden de STAT-transcriptiefactoren (signal transducer and activator of transcription) snel gerekruteerd ...

Het ChIP-experiment wordt gebruikt om dynamische veranderingen in histonmodificaties te monitoren die optreden tijdens STAT1-geactiveerde genexpressie; wijzigingen in de bezettingsgraad van transcriptiefactoren, histonmodificerende complexen en het transcriptiemachinerie zelf kunnen op deze manier ook worden geanalyseerd. Om de assay te starten, worden de cellen geïnduceerd met interferon gamma om de STAT1-signalering te activeren; daarna volgt het cross-linken van de cellen met formaldehyde en het oogsten ervan. Vervolgens worden de kernen geïsoleerd en gesoneerd, waardoor het chromatine wordt afgebroken in fragmenten van ongeveer 200 tot 1000 baseparen. Voeg daarna een antilichaam toe dat gericht is op het eiwit of de histonmodificatie van belang en precipiteer vervolgens de immunocomplexen.De immuuncomplexen worden gewassen, de crosslinks worden ongedaan gemaakt en het DNA wordt gezuiverd. De veranderingen in histonmodificaties of de rekrutering van eiwitten naar specifieke gebieden van een gen kunnen worden bepaald op basis van kwantitatieve realtime PCR-analyse van het immuunprecipiteerde DNA. Hallo, mijn naam is Lauren Borow van het laboratorium van Dr. Melissa Hendrickson en de afdeling Biologie aan de University of Virginia.Vandaag laten we u een procedure zien voor chromatine-immunoprecipitatie. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om dynamische histonmodificaties te bestuderen die optreden tijdens transcriptie stroomafwaarts van STAT1-signalering. Laten we beginnen.Cultureer de cellen één dag voordat u met deze procedure begint, zodat er een voldoende aantal beschikbaar is voor de twee FTGH-cellen die hier worden gebruikt. Bereid voor elke chip-assay één weefselkweekschaal van 15 centimeter voor met een confluentie van 80%. Neem in elk experiment een negatieve IgG-controle, een positieve pan-histon-antilichaamcontrole en duplicaten op.Om deze procedure te starten, verwijdert u het kweekmedium. Vervang dit door 20 milliliters DMEM aangevuld met 10% cosmic calf serum en bevattend interferon gamma in een concentratie van vijf nanograms per milliliter. Vervang daarnaast het medium op de niet-geïnduceerde platen door 20 milliliters 10%C-C-S-D-M-E-M.Werk vervolgens in een zuurkast. Kantel de 15 centimeter weefselkweekschaal en voeg 540 µL van een 37% formaldehydeloplossing toe aan 20 mL medium. Schud de schaal vervolgens voorzichtig om de oplossing gelijkmatig te verspreiden.Laat de cross-linking 10 minuten bij kamertemperatuur plaatsvinden. Voeg vervolgens glycine toe tot een eindconcentratie van 125 millimolar om de cross-linkingreactie te stoppen. Aspireer het medium met vacuüm en was de cellen één keer met 10 milliliters ijskoude PBS met behulp van een celscraper, verzamel de cellen in ongeveer zeven milliliters PBS en combineer cellen die identiek behandeld zijn van zes 15 centimeter platen in een 50 milliliter conische buis op ijs.Centrifugeer tot slot de verzamelde cellen 5 minuten bij 1.800 RPM bij vier graden Celsius en aspireer de PBS. Indien u hier stopt, vries dan de celpellet direct snel in en bewaar deze na cross-linking bij minus 80 graden Celsius. De volgende stap is het prepareren van het chromatine.Begin met het toevoegen van 1 mM DTT en complete protease-remmers aan zwelbuffer die op ijs is gekoeld. Resuspendeer het pellet van zes platen in 4 mL van de zwelbuffer en breng dit over naar een conische buis van 15 mL. Het gebruik van meer of minder buffer kan de efficiëntie van het proces beïnvloeden.Incubeer de celsuspensie 10 minuten op ijs. Wanneer de incubatie op ijs is voltooid, brengt u de suspensie over naar een vooraf gekoelde 15 milliliter centrifugebuis en voert u 20 streken uit met een P1000 pipet. Na het pipetteren brengt u de cellen terug naar een 15 milliliter conische buis op ijs, centrifugeert u 5 minuten bij 2.500 RPM bij 4 °C en verwijdert u het supernatant, zodat de nucleaire pellet overblijft.Voeg complete protease-remmers toe aan de sonicatiebuffer die op ijs is gekoeld. Zes platen leveren ongeveer 200 microliter nuclear pellet Resus op. Suspendeer de pellet in 15 pelletvolumes of drie milliliter van de sonicatiebuffer.Het gebruik van een ander volume voor deze hoeveelheid cellen kan de efficiëntie van de sonicatie beïnvloeden. De sonicatie-efficiëntie dient vooraf te worden bepaald voor de sonicator in uw laboratorium. Hier wordt een Miss Sonic sonicate 3000 gebruikt die is uitgerust met de microchip.Sonicateer de kernsuspensie op ijs gedurende 10 cycli van 20 seconden aan en 40 seconden uit bij een amplitudinstelling van acht. Dit resulteert doorgaans in chromatinefragmenten met een gemiddelde grootte van 200 tot 1000 basenparen wanneer de sonicatie is voltooid. Breng het gesonicate materiaal over naar een SS 34 centrifugebuis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 13, 000 RPM bij vier graden Celsius.In een SS 34 rotor om celdebris te pelletteren, waarvan de hoeveelheid gewoonlijk klein is. Breng het supernatant voorzichtig over naar een conische buis van 15 milliliter op ijs. Ga verder met het chippen om de achtergrond door aspecifieke bindingsgebeurtenissen te verminderen.Zuiver eerst de chromatinepreparatie voor door 360 µL salmon sperm DNA proteïne A- of G-agro bead slurry toe te voegen en dit ten minste 30 minuten lang bij 4 °C te schudden. Centrifugeer vijf minuten bij 1000 RPM bij 4 °C om de agro beads te pelletteren. Draag vervolgens de voorgezuiverde supernatant op ijs over naar een andere conische buis van 15 mL.Meet vervolgens de absorbantie bij 260 nanometer of de A 260-eenheden van het chromatine. Verdun 10 µL van het vooraf verkregen chromatine in 190 µL dubbel gedestilleerd water. Gebruik voor de blanco een mengsel van 10 µL sonicatiebuffer en 190 µL dubbel gedestilleerd water.Pas het volume van het monster aan met sonicatiebuffer tot vier A 260 units. Bewaar 75 µL van het voorgezuiverde chromatine bij vier A 260 units als inputmonster en bewaar dit bij -20 °C tot de crosslinks worden omgekeerd. Onthoud dat deze stap cruciaal is voor de data-analyse.Vergeet dus niet om het input-aliquot te nemen en de resterende chromatinepreparatie in aliquots van 1 ml over te brengen in 1,7 ml microcentrifugebuisjes op ijs. Indien u hier stopt, vries de geprepareerde chromatine dan direct in op droogijs en bewaar deze bij -80 °C.Aangezien opgeslagen chromatine echter kan degraderen, is het raadzaam om direct door te gaan met de ip. Voeg nu de ChIP-grade antilichamen toe aan de geïnduceerde en niet-geïnduceerde monstersets. In dubbeltoets.Meestal werkt één tot twee microgram antilichaam goed, maar de hoeveelheid moet vooraf empirisch worden bepaald. Voeg twee microgram IgG en 15 microliters pan histone H3-antilichaam toe als respectievelijk negatieve en positieve controles aan de geïnduceerde en niet-geïnduceerde monstersets. Schud vervolgens alle buisjes een nacht lang bij 4 °C voordat u overgaat tot het isoleren van de immunocomplexen na de incubatie gedurende de nacht met de antilichamen.Voeg 60 µL van de salmon sperm DNA proteïne A- of proteïne G-bead slurry toe aan alle buisjes. Incubeer minimaal 60 minuten bij 4 °C om de immunocomplexen aan de beads te binden.Pellet de immuuncomplexen die aan de agros-beads zijn gebonden door voorzichtig te centrifugeren bij 2000 RPM gedurende drie minuten bij vier graden Celsius en aspireer het supernatant. Voer vervolgens een reeks bufferwasstappen uit, beginnend met een wasstap met een laag zoutgehalte, gevolgd door een wasstap met een hoog zoutgehalte. Sluit af met een lithiumchloride-wasstap.Voer tot slot twee TE-wasbeurten uit met elk van de wasbuffers. Voeg PMSF toe vlak voor gebruik, was gedurende 10 minuten met één milliliter buffer onder schudden bij vier graden Celsius, centrifugeer drie minuten bij 2000 RPM bij vier graden Celsius en aspireer het supernatant terwijl de monsters gekoeld op ijs worden bewaard. Voeg na het verwijderen van de laatste TE-bufferwas 500 microliters vers bereide Lucian-buffer toe aan de beads, vortex om de aros-beads in de Lucian-buffer te mengen en verhit gedurende 30 minuten bij 65 graden Celsius.Vortex elke 10 minuten terwijl de monsters elueren, ontdooi de startmonsters en voeg 500 µL elutiebuffer aan elk monster toe. Neem deze monsters mee in alle volgende stappen. Zodra de monsters de incubatie bij 65 °C hebben voltooid, centrifugeer deze gedurende 30 seconden bij 2000 RPM en breng de EENT over naar een nieuwe microcentrifugebuis.Keer tenslotte de cross-linking om. Voeg vijf molar natriumchloride toe aan alle monsters tot een eindconcentratie van 200 millimolar en vortex in een incubator op 65 °C gedurende ten minste vier uur tot overnacht. Zodra de cross-links van de immunocomplexen zijn omgekeerd, kan het gebonden DNA worden teruggewonnen wanneer de incubatie bij 65 °C is voltooid.Centrifuge de monsters kort in een microcentrifuge gedurende 30 seconden. Om condensatie op de doppen op te vangen, voegt u één microliter RNAse A toe aan elke buis en incubeert u dit 15 minuten bij kamertemperatuur, na de RNAse-behandeling van elke buis met 10 microliters 0,5 molair EDTA, 40 microliters 0,5 molair tris-chloride pH 6,5 en twee microliters proteinase K, of in totaal 52 microliters van een mastermix, en incubeert u dit bij 45 °C gedurende 60 minuten. Extraheer de monsters met fenol-chloroform, isoamylalcohol, en vervolgens met chloroform-isoamylalcohol.Voeg vervolgens om het DNA neer te slaan twee µL glycogeen en 0,1 volumes van 3 M natriumacetaat pH 5,2 toe aan elk monster en vortex deze; voeg 2,5 volumes 100% ethanol toe, vortex en incubeer gedurende één nacht bij -20 °C. Haal de monsters eruit en centrifugeer deze bij 13.000 RPM gedurende 20 minuten bij 4 °C.Was de DNA-glycogeenpellets met één milliliter 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen of gebruik een vacuümcentrifuge. Droog het DNA niet te veel; resuspendeer de pellets in 200 microliters TE-buffer en kwantificeer maximaal één microliter via real-time PCR.De hier getoonde PCR-resultaten zijn afkomstig van een ChIP-experiment waarbij de dynamiek van H3K36me3 werd gevolgd. Tijdens interferon-gamma-inductie van het IRF1-gen werd een H3K36me3-antilichaam gebruikt om chromatine neer te slaan, verzameld uit 2TGH-cellen die gedurende 30 minuten, 1,5 uur en vijf uur waren geïnduceerd met interferon-gamma, met IgG als negatieve controle. De bezettingsgraad van STAT1 werd op deze tijdstippen eveneens bepaald, evenals de bezettingsgraad van RNA-polymerase II.De histonbezetting over de locus van het IRF1-gen werd bepaald voor de niet-geïnduceerde en geïnduceerde condities met behulp van het pan-histon 3-antilichaam, dat tevens als positieve controle dient. De dip rond minus 5 baseparen is te wijten aan de nucleosoomdepletie die wordt aangetroffen bij transcriptiestartplaatsen. We hebben u zojuist de procedure voor chromatine-immunoprecipitatie getoond.Deze assay is nuttig voor het observeren van chromatine-modificaties die optreden tijdens geactiveerde gentranscriptie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om, voordat u met een chip-experiment begint, de shearing-procedure voor uw chromatine af te stemmen met uw mentor. Denk er ook aan om uw input-monsters te nemen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De differentiatie van ESC samenvalt met cel-type specifieke veranderingen in de structuur en samenstelling van het chromatine. De detectie van deze veranderingen geeft waardevolle inzichten in de mechanismen die stemcellness en celdifferentiatie te definiëren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) vormt een waardevolle methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen stamcellen differentiatie ontleden.

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Leer chromatine immunoprecipitatie om dynamische histonmodificaties te analyseren tijdens STAT1-geactiveerde genexpressie in menselijke cellen. Deze methode kwantificeert transcriptiefactorbezetting en chromatineveranderingen.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

Meer video's verkennen