Name: Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEAs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer hoe u neuronale netwerken kweekt, registreert en stimuleert op micro-elektrode arrays (MEA's). Deze methode maakt langdurige studies van netwerkactiviteit en informatieverwerking in vitro mogelijk met rattenembryo's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de leden van de Potter-groep bedanken voor het verstrekken van waardevolle commentaar op het protocol. Dit werk werd gefinancierd door een klinisch onderzoek training fellowship van de American Academy of Neurology Stichting CMH, een beurs van het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen (NIGMS, <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) naar JDR (GM08169 ), een subsidie ​​van de NIH Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NS054809), een Ruth L. Kirschstein National Research Service Award uit aan JDR (NS060392), een NSF EFRI subsidie ​​(0.836.017), de Coulter Stichting Translational Research Award, en een translationeel onderzoek fellowship aan JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH heeft niets te onthullen.<br /&gt; JDR en SMP worden betaald consultants voor Axion Biosystems.<br /&gt; De indiening kosten en videoverwerking vergoedingen voor dit artikel en video werden vriendelijk gesponsord door Multi-Channel Systems.

Dit protocol geeft instructies over hoe de cultuur en onderhouden van neuronale netwerken op micro-elektrode arrays, alsook een introductie tot opname van en het stimuleren van neuronale netwerken. Enkele van de meest voorkomende problemen bij het opnemen van MMO&#39;s zijn ook besproken in de MEA gedeelte Problemen oplossen. Er zijn af en toe variaties in het protocol zoals besproken tijdens en vaak deze veranderingen worden gebruikt om specifieke voorwaarden vereist door bepaalde experimentele ontwerpen te optimaliseren. Hoewel de opname en het stimuleren van het systeem hier wordt gepresenteerd is samengesteld uit onze op maat ontworpen NeuroRighter 15 met de MCS voorversterker, er zijn meerdere andere systemen die een interface kan voorzien van de neuronale netwerken. Het kiezen van een bepaalde installatie zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften. Simplistisch opname en stimulatie voorbeelden werden in dit protocol echter deze culturen op MMO&#39;s kunnen gebruikt worden om inzicht te geven in complexe vragen over de synaptische activiteit en neuronale netwerk connectiviteit. Zoals hierboven vermeld, de lopende werkzaamheden is gebruik te maken van deze technologie om processen zoals mobiele plasticiteit onderzoek, ontwikkeling, excitotoxiciteit en neurodegeneratie. 6-10 Bijvoorbeeld, een recente publicatie van ons laboratorium toonde reproduceerbare doel leren in vitro met real-time closed-loop stimulatie in reactie op de huidige neuronale netwerk activiteit 3. Hoewel de MEA culturen zijn vaak pietluttige en delicaat, dankzij hun eenvoud en toegankelijkheid (in vergelijking met intacte dieren), bieden ze een krachtig model voor het bestuderen van de neuronale activiteit op het netwerk niveau.

Supplies <ul><li> Wegwerp fles top filter (150ml, 0.2μm poriegrootte; Nalgene # 565 tot 0,020) </li><li> Embryonale dag 18 timed-zwangere vrouwelijke ratten </li><li> Micro-elektrode arrays (zie beschrijving in het protocol, B1) </li><li> Micro-elektrode-array deksels (zie beschrijving in het protocol, B3) </li><li> Nylon cel zeef (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polypropyleen conische flacons (steriele, 15ml) </li><li> Polystyreen Petrischalen (steriel, 35mm en 100x15mm) </li><li> Pipet tips (steriel, 20μl, 200μl en 1000μl) </li><li> Serologische pipetten (5 ml) </li></ul> Uitrusting: <ul><li> Biologische veiligheid kast / laminar flow hood </li><li> Celgetalmeter </li><li> Centrifuge </li><li> Container van ijs </li><li> Ontleden schaar en pincet (gesteriliseerd) </li><li> Ontleden microscoop in een laminaire stroming kap </li><li> Handheld elektrische Pipetman </li><li> Hemacytometer </li><li> Isofluorane en gaskamer </li><li> Lichtmicroscoop </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA-opname-systeem (zie beschrijving in het protocol, D1) </li><li> Knaagdieren Guillotine </li><li> Tri-gas incubator (zie beschrijving in het protocol, B15) </li><li> Vacuüm kolf met aspirator bevestigd in de kap </li><li> Draaikolk </li><li> Waterbad (35-37 ° C) </li></ul> Oplossingen en reagentia: BSA oplossing: Maak 5% BSA (Sigma A-9418) in fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 en gefilterd 0.2μm. Deze oplossing kan van tevoren worden bereid en bewaard bij 4 ° C voor enkele maanden. Cel Medium: Combineer 90 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml paard serum (Gibco 16.050), 1 ml natrium pyruvaat (100mm, Gibco 11360), 250 ul Glutamax (Gibco 35050) en insuline (eindconcentratie 2,5 ug / ml, Sigma I-5500), dan passeren door een 0,2 um filter.22 Warm en evenwicht de cel medium in de incubator voor gebruik. Dissection oplossing voor het bereiden van papaïne oplossing: 23 <table border="1"><tr><td> Dissectie oplossing (100ml voorraad) </td><td> Combineer in orde, filter 0,22 pm en bewaren bij 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume ml </td><td> Uiteindelijke concentratie (mM) </td></tr><tr><td> Dubbel gedestilleerd water </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0.58 </td><td> 5.8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0.025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0.32 </td><td> 1.6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% Fenolrood </td><td> 0.2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0.2 </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M Kynurenic zuur </td><td> 1.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1.0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Deze oplossing kan van tevoren worden bereid en bewaard bij 4 ° C voor enkele maanden. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). 50μl aliquots zijn flash ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C. Een deel wordt ontdooid in de laminaire flow kap vóór het begin van de cel dissociatie proces. Gebalanceerde zout Hank&#39;s oplossing: Sigma (# 4891). Een 1X oplossing wordt bereid in gedemineraliseerd water, steriel gefiltreerd bij 0.2μm en opgeslagen bij 4 ° C. Hibernate oplossing: Voor te bereiden op de dag van kweken. Combineer 98 ml L-15-medium (Invitrogen 11415) met 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen # 17504) en filter op 0,2 um. Laminine oplossing: Voor te bereiden op de dag van kweken. Verdunnen 20μl van laminine (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 pl cel medium voor een uiteindelijke concentratie van 0.02mg/ml. 20 ui aliquots van de laminine (1mg/ml) zijn opgeslagen bij -80 ° C en vlak voor ontdooid te gebruiken. Ontdooien dient plaats te vinden op de bank top en niet in het waterbad zo snel ontdooien kan soms leiden tot geleren van de laminine. Papaïne oplossing: 23 Warm 10 ml van dissectie oplossing (boven) tot 30-32 ° C. Voeg 200 eenheden papaïne (Sigma P-4762) en 1,6 mg L-cysteïne (Sigma C-7880). Breng de pH tot 7,4 met ongeveer 14 pi van 0,1 N NaOH. Incubeer gedurende ongeveer 30 minuten tot de oplossing cloren, filter 0,2 micrometer, flits bevriezen met vloeibare stikstof in 2 ml in 15 ml polypropyleen steriel conische flacons en bewaar bij -80 ° C. Dooi een aliquot bij 35-37 ° C vóór de start van het protocol. Polyethyleenimine (PEI) oplossing: 13 100 ul van PEI (50% w / v, Sigma P-3143) wordt verdund in 100 ml natriumboraat buffer (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) voor een uiteindelijke concentratie van 0,05% w / v. Steriel filter op 0,2 um. Dit kan worden voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor de maand. Steriel gedeïoniseerd water: Autoclaaf en laten afkoelen voordat op kamertemperatuur te gebruiken. Trypsine (0.25% met EDTA, Gibco 25.200): 1 ml porties zijn flash ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C. Monsters worden ontdooid in de 35-37 ° C waterbad voor gebruik.

hoe te cultuur, record en het stimuleren van neuronale netwerken op de micro-elektrode arrays (mea&#39;s)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Voor de laatste eeuw hebben veel neurowetenschappers over de hele wereld hun leven gewijd aan het begrijpen hoe neuronale netwerken werken en waarom ze stoppen met werken in verschillende ziekten. Studies hebben opgenomen neuropathologisch observatie, fluorescentie microscopie met genetische etikettering, en de intracellulaire opname in zowel los neuronen en slice preparaten. Dit protocol gaat in een andere technologie, wat inhoudt dat steeds meer los neuronale culturen op micro-elektrode arrays (ook wel multi-elektrode arrays, MMO&#39;s). Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van dit systeem ten opzichte van andere technologieën. Gedissocieerd neuronale culturen op MMO&#39;s zorgen voor een vereenvoudigd model waarin het netwerk activiteit met elektrische stimulatie sequenties worden gemanipuleerd via meerdere van de array elektroden. Omdat het netwerk klein is, is de invloed van stimulatie beperkt tot de waarneembare gebieden, die niet het geval is in intacte preparaten. De cellen groeien in een monolaag het aanbrengen van wijzigingen in de morfologie eenvoudig om toezicht te houden met verschillende beeldvormende technieken. Ten slotte kunnen culturen op MMO&#39;s overleven voor meer dan een jaar in vitro waarin geen duidelijke tijd beperkingen die inherent zijn met andere kweektechnieken verwijderd 1. Ons laboratorium en anderen over de hele wereld maken gebruik van deze technologie om belangrijke vragen te stellen over het neuronale netwerken. Het doel van dit protocol is om de nodige informatie te verstrekken voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO&#39;s. In vitro netwerken bieden een middel voor het stellen van fysiologisch relevante vragen op het netwerk en cellulair niveau leidt tot een beter begrip van hersenfunctie en dysfunctie.

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO&#39;s.<em&gt; In vitro</em&gt; Netwerken bieden een middel voor het stellen van fysiologisch relevante vragen op het netwerk en cellulair niveau leidt tot een beter begrip van de hersenfunctie en dysfunctie.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Het algemene doel van deze procedure is om neuronale netwerken te kweken, te registreren en te stimuleren op micro-elektrodenarrays. Dit wordt bereikt door eerst reagentia en micro-elektrodenarrays voor cultivering voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is om corticale neuronen te dissociëren van een rattenemfyo op dag 18.De derde stap van de procedure is om neuronen op micro-elektrodenarrays te plateren en twee tot drie weken te kweken. De laatste stap van de procedure is om te experimenteren met de neuronale netwerken via stimulatie en registratie van de micro-elektrodenarrays. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die spontane en stimulus-geïnduceerde activiteit in neuronale netwerken laten zien met registratie- en stimulatiesoftware door nauwgezette celcultivering op Micro-elektrodenarrays.Hallo, ik ben professor Steve Potter. Ik ben de directeur van het Laboratorium voor Neuro Engineering in de afdeling Biomedische Techniek bij Georgia Tech. Die afdeling wordt gedeeld met de Emory University School of Medicine.En ik ben Chad Hales, een postdoc in het lab van Dr. Potter. Ik ben ook een cognitief gedragsfellow in de afdeling Neurologie aan de Emory University School of Medicine. Vandaag laten we je zien hoe je neuronen op multi-elektrodenarrays kweekt en verzorgt.Zoals deze. We gebruiken ze om leren en geheugen in vitro en netwerkinformatie verwerking te bestuderen. Dus laten we beginnen. Begin in een laminare stromingshaak met het voorbereiden van het meerkanaals systeem micro-elektrodenarray of MEA-pipet 100 microliter polyethyleeniamine in het centrum van een schone en steriele MEA die in een 100 millimeter Petri-schaal rust om schade aan de elektroden te voorkomen.Raak nooit vaste objecten aan het MEA-oppervlak aan. Bedek de schaal lichtjes met een steriele deksel voorzien van een gasdoorlatende Teflon-membraan en incubeer deze 30 minuten in de haak. Het Teflon-membraandekvlak zorgt voor gasuitwisseling met minimale verdamping en de mogelijkheid om in omgevingen met lagere luchtvochtigheid te cultiveren.De lagere luchtvochtigheid maakt het gebruik van delicate elektronica in de incubator mogelijk en vermindert de besmettingssnelheid. Aspirieer de PEI weg, spoel de MEA drie keer met een tot twee milliliter sterieel gedeïoniseerd water. Laat ze minstens 30 minuten of tot ze helemaal droog zijn, met het deksel open in de haak drogen.Voltooi een E 18 corticale neuron dissociatie zoals beschreven in het tekstdeel van dit protocol. Zeef de cellen na het zeefn. Breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis en breng het celsuspensievolume zorgvuldig op vier milliliter aan met celmedium.Leg 500 microliter van een 5%BSA-oplossing onder de celsuspensie en centrifugeer gedurende zes minuten bij 200 G's. Terwijl de cellen draaien, controleer of de MEA volledig droog is. Pipet voorzichtig 20 microliter van de laminaat oplossing in het midden van de MEA.Vermijd het introduceren van luchtbellen en zorg ervoor dat alle elektroden bedekt zijn. Plaats voorzichtig het Teflon-deksel op de MEA om verdamping van de laminine te voorkomen. De MEA moet op een volledig vlakke oppervlakte liggen wanneer het deksel wordt geplaatst.Anders kan de druk het glazen onderdeel van het array breken. Incubeer de schaal gedurende 20 minuten bij 35 tot 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, 9% zuurstof en 65% luchtvochtigheid. Breng nu de gesponnen cellen over naar de haak.Een cellenpellet moet zichtbaar zijn op de bodem van de buis. Verwijder en reserveer de supernatant in geval van onvolledige pelletering. Resuspendeer voorzichtig het pellet.Tel het aantal cellen in 10 microliter van de suspensie op een hemo cytometer en verdun de suspensie tot de gewenste concentratie. Meestal 1000 tot 3000 cellen per microliter met celmedium. Wanneer de laminaatincubatie van de array voltooid is, aspireer de druppel onmiddellijk weg.Pipet 15 tot 20 microliter van de celsuspensie over het met laminaat bedekte gebied van de MEA. Bedek de schaal met het Teflon-deksel en plaats deze 30 minuten in de incubator. Controleer onder een fasecontrastmicroscoop of de cellen zijn gehecht en of alle elektroden zijn bedekt.Als de dekking onvolledig is, voeg meer cellen toe en incubeer opnieuw. Spuit de schaal langzaam door met één milliliter opgewarmd cellen evenwichtsmedium. Vervang het Teflon-deksel en plaats de schaal 24 uur terug in de incubator.De volgende dag. Controleer onder de fasecontrastmicroscoop of de gekweekte cellen zijn gehecht en dat de hoeveelheid puin en celdood beperkt is met de juiste zorg en voeding. Zoals uitgelegd in de bijbehorende tekst, kunnen neuronen die op deze manier worden gekweekt langer dan een jaar overleven.Na twee tot drie weken hebben de culturen een stabiele activiteitstoestand bereikt en kunnen ze worden geregistreerd. Deze video zal nu registratie demonstreren met het op maat gemaakte neuroschrijfprogramma. Breng de schaal over in de registratie-incubator die opnieuw op 35 tot 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, 9% zuurstof en 65% luchtvochtigheid wordt gehouden. Om de ideale temperatuur en pH te behouden, moet de schaal bij het verplaatsen parallel aan de grond worden gehouden en moeten snelle bewegingen worden vermeden die de cellen van het substraat kunnen losmaken.Til de MEA uit de schaal en plaats deze in de meerkanaals systemen. Registreer preem versterker, zorg ervoor dat de interne grond goed is aangesloten met de Preem versterker grond. De voorversterker zit op een pelt-apparaat, dat dient om warmte af te voeren zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Hier is de voorversterker uit de incubator gehaald.Laat het goede zitten van de schaal beter zien. Gebruik een doek bevochtigd met 70% ethanol om de contacten rond de omtrek van het array schoon te maken. Zorg ervoor dat de MEA goed zit en sluit het deksel.Gebruik een wattenstaafje om de contacten van het array indien nodig uit te lijnen. Kies in neuroschrijver instellingen die geschikt zijn voor het experiment. De opnamekn

how-to-culture-record-stimulate-neuronal-networks-on-micro-electrode

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een krachtige manier om de neuronale lawines, dat wil zeggen schaal-invariant spatio-temporele activiteit uitbarstingen, indicatief van kritieke toestand dynamiek in cortex te bestuderen. Lawines ontstaan ​​spontaan in de ontwikkeling van oppervlakkige lagen van gekweekte hersenschors, die voor de lange termijn metingen van de activiteit mogelijk maakt met vlakke geïntegreerde multi-elektrode arrays (MEA) onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden.

Multi-electrode array Opnamen van neuronale Lawines in organotypische culturen

This video demonstrates the development of a 3D neuronal culture coupled to a planar microelectrode array with hippocampal neurons. The isolated neurons form a 2D network on the microelectrode array's active area and adhere to glass microbeads in a multi-well plate with a membrane insert. Upon transferring these neuron-coated microbeads to the electrode, they organize into an interconnected 3D neural network.

Building Three-Dimensional Neuronal Networks Coupled to Micro-Electrode Arrays

The video demonstrates how to use a microelectrode array (MEA) to record the electrophysiological activity of neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Electrophysiological activity from a multiwell MEA containing a neuron-astrocyte co-culture is recorded to detect action potentials from multiple neurons in the network, confirming the successful differentiation of hiPSCs into neurons.

Measuring the Electrophysiological Activity of Neuronal Networks Using Micro-Electrode Arrays

This video demonstrates the recording of spontaneous and stimulation-dependent neural activity from primary murine spiral ganglion neuron (SGN) cultures on a multielectrode array (MEA). It involves washing and preparing the MEA, recording spontaneous neural activity, and applying controlled electrical stimuli to identify stimulation-dependent neuronal activity.

Analyzing Neural Activity in Primary Murine Spiral Ganglion Neurons Using Multielectrode Arrays

This video presents electrophysiological recordings from organotypic co-cultures of spinal cord slices, captured using a multi-electrode array or MEA device. These recordings assess neuronal regeneration between the slices. The synchronized electrical activity observed confirms successful neural regeneration.

Electrophysiological Recordings For Assessing Neuronal Regenerations in Co-cultured Spinal Cord Slices

This video demonstrates the procedure of using the multielectrode array (MEA) to measure synaptic physiology in 3D coculture spheres. This method allows to understand the neural network dynamics and synaptic network burst activity within the 3D spheres.

Utilizing Multielectrode Arrays to Measure Synaptic Physiology in 3D Coculture Spheres

This video demonstrates establishing a neuron-astrocyte co-culture for recording neuronal network activity. Upon establishing the co-culture of motor neurons and astrocytes on a multi-electrode array (MEA) plate, the synchronous rhythmic electrical activity of the neuronal network was recorded extracellularly using the MEA.

Recording Electrophysiological Activity of the Neuronal Network in a Neuron-Astrocyte Co-culture

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

We presenteren een protocol om primaire murine spiraalvormige ganglion neuron explantaten te kweken op multi-elektrode arrays om neuronale responsprofielen te bestuderen en stimulatieparameters te optimaliseren. Dergelijke studies zijn gericht op het verbeteren van de neuron-elektrode interface van cochleaire implantaten om het gehoor bij patiënten te verbeteren evenals het energieverbruik van het apparaat.

Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays

Muisneuronale cellen die op multi-elektrode arrays worden gekweekt, tonen een toename van de respons na elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronen kunt cultiveren, hoe u activiteiten opneemt en hoe u een protocol kunt opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen.

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

Leer hoe u neuronale netwerken kweekt, registreert en stimuleert op micro-elektrode arrays (MEA's). Deze methode maakt langdurige studies van netwerkactiviteit en informatieverwerking in vitro mogelijk met rattenembryo's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA's)

Meer video's verkennen