Name: Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer chronische in vivo beeldvorming van de visuele cortex bij muizen met een verdunde-schedel voorbereiding. Deze methode maakt observatie van dendritische spine-dynamica mogelijk voor onderzoek naar corticale plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Burroughs Wellcome Career Award in de Biomedische Wetenschappen (AKM), The Whitehall Stichting Research Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), en een NEI gefinancierd, Vision Training Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Te visualiseren neuronen in de intacte hersenen met behulp van twee-foton microscopie, een voorbereiding waar de neuronen worden gelabeld met een fluorescerende merkers wordt gebruikt. In de experimenten die hier gebruiken we de GFP-M transgene muis lijn die labels laag 5 piramidale cellen 1. Laag 5 piramidale cellen project dendritische processen in oppervlakkige lagen, waardoor de visualisatie van dendrieten en dendritische spines tot een diepte van 300 micrometer onder het niveau van de pia. Een alternatieve aanpak is om het etiket cellen met behulp van virale markers (zie Lowery et al.. Voorgelegd aan Jupiter). </li><li> Steriliseer de werkruimte met behulp van 70% ethanol en autoclaaf tools voor aseptische chirurgie. De exploitatie-oppervlak met schoon dressing. </li><li> Verdoven muizen met een Fentanyl cocktail (fentanyl 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg), gevolgd door een kwart dosis Avertin (0,0075 mg / ml) met behulp van IACUC goedgekeurde procedures. Voorbehandelen muizen met de pijnstillende, buprenorfine (0,5 mg / kg) subcutaan (SQ). Toezicht op het niveau van de verdoving vliegtuig door het testen van reactie op de staart / teen knijpen. </li><li> Houden van dieren bij 37,5 ° C met behulp van warmte deken met aangehechte rectale thermometer. </li><li> Van toepassing zijn oogheelkundige zalf voor de ogen om de ogen niet uitdrogen. Kap ogen met kleine vel papier voor de ogen te beschermen tegen de lichtbron tijdens de operatie. </li><li> Met een schaar, te verwijderen haren vanaf de achterkant van het hoofd (achter de oren), voor de ogen. </li><li> Reinig de bovenkant van het hoofd van het dier met een sequentiële toepassing van 70% ethanol, gevolgd door de Betadine scrub en Betadine-oplossing. </li><li> Maak een L-snede incisie achter de oren en langs zowel de linker-of rechterkant van de middellijn (afhankelijk van welke halfrond zal worden afgebeeld) voor de ogen. Vouw de huid over en uit de buurt van een operatie site. Verwijder niet de huid als de huid wordt gehecht na de opnamesessie. </li><li> Met behulp van fijne tang trek de huid omhoog en weg van uw interessegebied. </li><li> Schraap voorzichtig het periost van het blootgestelde oppervlak van de schedel met een schone pincet of een microchirurgische mes. Met behulp van een wattenstaafje, breng een kleine hoeveelheid van 10% IJzer-chloride in de schedel volledig droog het periost membraan en dat het volledig is verwijderd te verzekeren. Het is belangrijk dat de schedel volledig droog is om een ​​goede hechtende van de lijm te garanderen (zie 11). Met behulp van een tang of een microchirurgische blad, voorzichtig weg te schrapen gedroogde periosteum membraan. </li><li> Breng een dun laagje van cyanoacrylaat lijm rond de beeldvorming raam van de roestvrij stalen kop plaat (zie figuur 1) en het aanbrengen van de plaat aan de schedel. </li><li> Met behulp van de houten einde van een katoen-swab stick, lijm naar binnen naden van de imaging-venster, zorg ervoor dat alle leemtes op te vullen tussen de beeldvorming plaat en kromming van de schedel. </li><li> Plaats een druppel lijm versneller in het venster. Snel weg veeg overtollige lijm versneller met een wattenstaafje of kim vegen. De lijm moet volledig gestold voordat u gaat boren. </li><li> Begin met de schedel dun in de imaging-venster met behulp van een tandartsboor is voorzien van een 0,7 mm roestvrij staal braam. Wissel boren met af en toe de toepassing van 0,9% steriele zoutoplossing om te voorkomen dat het genereren van al te veel warmte op de schedel. </li><li> Dunne een 4x4 mm venster op de schedel met kleine halen over de schedel oppervlak met de tandartsboor. Test de geringe dikte van de schedel met stompe eind pincet. De schedel oppervlak zal licht streepje, met lichte druk. De optimale dikte van de schedel voor de beeldvorming ligt tussen 10 en 30 um. </li><li> Wanneer de schedel dun is en het venster ontdaan van alle puin, plaats zoutoplossing op de schedel. Foto van de beeldvorming venster met een digitale camera gemonteerd op een ontleden scope. Fotografie en het gebruik van de hersenen vasculatuur zal helpen bij het lokaliseren van de positie om de beeldvorming plaat plaats voor latere beeldvorming sessies. </li><li> Vervoer het dier naar de twee-foton rig. Het dier moet blijven liggen op de verwarming deken (met rectale probe) tijdens de volledige opnamesessie. Let op: terwijl onder sedatie, het dier kerntemperatuur van het lichaam sterk zal fluctueren in de afwezigheid van een verwarmings-unit resulteert in corticale schade of eventueel de dood. </li><li> Een twee-foton microscoop met een Mai Tai laser, een 10W solid state pomp voor maximaal vermogen en een aangepaste Olympus Fluoview confocale-eenheid wordt gebruikt. Het systeem is geoptimaliseerd voor deep tissue beeldvorming en externe detectoren worden geplaatst zo dicht mogelijk bij de objectief mogelijk tot maximale detectie van fluorescentie toestaan ​​van de hersenen. Een Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA objectief wordt gebruikt. 0,9% zoutoplossing wordt gebruikt tijdens de beeldvorming voor de doelstelling van onderdompeling. </li><li> Met behulp van deze microscoop, en een lage digitale zoom (x1) identificeren een gebied met fel gelabeld neuronen. </li><li> Met behulp van een digitale camera aangebracht op de microscoop oculair, neem een ​​foto van de beeldvorming gebied. Als alternatief, schetsen het bloed vasculatuur patroon. Dit is nodig om opnieuwbeurt om op dezelfde imaging locatie op een later tijdstip. </li><li> Verkrijgen van een lage vergroting stack (x20 doel, 512x512 pixel, 5 um stap) door het gehele zichtbare omvang van de hersenen (meestal spanning ~ 200 pm), waaruit de omvang van dendritische vertakking. Let op: deze lage vergroting afbeelding zal worden gebruikt om de beeldvorming buurt te zoeken op latere tijdstippen als zowel de bloedvaten en dendrieten behouden hun structuur in jonge en volwassen dieren. </li><li> Met behulp van imaging-software (Fluoview, v. 5.0, FV300), toename van digitale vergroting 8-voudige. Stel de X, Y-coördinaten (pan coördinaten), indien nodig en het verzamelen van een hoge vergrotingsfactor stack die gedetailleerde dendritische morfologie inclusief de locaties en de structuur van dendritische spines zal laten zien. Maak gedetailleerde opmerkingen ten aanzien van elke stapel verzamelen, dat wil zeggen pan coördinaten, het bereik van de collectie, de z-stap grootte en het aantal stappen in je stack. Deze nota's zullen worden gebruikt bij het terugkeren naar deze dendriet of axon op een later tijdstip. </li><li> Na de beeldvorming, verwijder de kop plaat door zachtjes te scheiden plaat uit schedel oppervlak. Met behulp van een tang, verwijder eventuele lijmresten nog op de schedel en wrijf schedel oppervlak met 0,9% steriele zoutoplossing. Suture de huid over de schedel samen met # 6 hechten draad. Veeg gebied met 70% ethanol. Te verlichten pijn tijdens het postoperatieve herstel, het beheer van 0,1 mg / kg Buprenorfine pijnstillend, SQ. </li><li> Plaats van dieren in een schone kooi onder een warmtelamp totdat hij wakker en is mobiel. Keer terug naar de oorspronkelijke dier kooi. </li><li> Om Reimage dier op een later tijdstip (onze beeldvorming tijdstippen kan overal worden vanaf 2 dagen tot vele maanden uit elkaar), verwijder steken of heropenen van de huid op het hoofd met behulp van aseptische methoden als hierboven. Gebruik maken van de digitale afbeelding van de hersenen vasculatuur (genomen op de eerste operatie datum) naar de oorspronkelijke beeldvorming locatie te vinden. Opnieuw aan roestvrij staal headplate (stap 10-12). Gebruik een microchirurgische mes om zachtjes weg te dun elk bot dat zou kunnen hebben opnieuw gegroeid tussen de beeldvorming tijdstippen. Indien nodig, dun met tandheelkundige boren. Duidelijke beeldvorming raam van puin en toepassen van een daling van 0,9% steriele zoutoplossing. </li><li> Carry dier tot twee-foton microscoop en zoek originele beeldvorming veld. Gebruik maken van de digitale foto genomen tijdens de eerste opnamesessie voor hulp. </li><li> Open het Fluoview programma en open de oorspronkelijke lage vergroting afbeelding. Aanbrengen van een transparant vel op het computerscherm en schets de belangrijkste bloedvat patroon met behulp van een transparant pen. </li><li> Open de Live image en opnieuw uitlijnen van het bloed vasculatuur om de geschetste patroon op de transparante film. </li><li> Om Reimage de 8x ingezoomd in structuren, open de gewenste verzameld stack van de vorige opnamesessie. Schets van de structuur (dat wil zeggen axonen, dendritische, gliale) op een transparante film, aangebracht op het computerscherm. </li><li> Zoom in 8x van de Live Image en zet de pan coördinaten aan de eerste dag imaging parameters. Afhankelijk van de nauwkeurigheid van het uitlijnen van de lage vergroting locatie, kan het noodzakelijk zijn om ook de hoek van het beeld enigszins. Zodra de gewenste structuur gevonden is, overeenkomen met de structuur van uw schetsen een hoge vergrotingsfactor patroon. Verzamel de z-stack met de identieke stap grootte en het aantal z-stack beelden voor latere analyse. </li><li> Herhaal stap 29 en 30 totdat alle hoge vergrotingsfactor beelden worden opnieuw verzameld. </li><li> Wanneer beeldvorming is voltooid, herhaalt u de stappen 22-24. Re-imaging kan worden herhaald op maximaal twee aparte tijdstippen. </li><li> Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Vivarium en de afdeling Laboratory Animal Medicine van de Universiteit van Rochester School of Medicine en Tandheelkunde set, in de volledige erkenning door de Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care, internationale (AAALAC) en zijn in overeenstemming met de staatswet, federale statuten en NIH beleid. </li></ol> Representatieve resultaten In GFP-M uiten muizen, kan een subset van laag 5 piramidale cellen en de bijbehorende dendritische processen eenvoudig worden gevisualiseerd met behulp van twee-foton laser scanning microscopie (2PLSM) 1. Hier hebben we laten zien een verdunde-schedel preparaat waarin de schedel op de gewenste beeldvorming locatie is uitgedund tot ~ 10-30 pm. Correct wordt uitgevoerd, ons protocol liet ons toe om duidelijk te visualiseren corticale dendrieten en stekels in het intacte visuele cortex voor acute of chronische analyse (figuur 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Aangepaste kop en voetplaat. (A) Bovenaanzicht van custom made ​​hoofd-en bodemplaat gebruikt voor verdund-schedel chirurgie voorbereiding. (B) Zijaanzicht van custom-made hoofd-en bodemplaat. (C, D) Gedetailleerde schema en het imago van het hoofd plaat. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> in vivo in de visuele cortex van een transgene GFP-M muis met behulp van twee-foton microscopie. Beeld is een projectie van een beeld verkregen om de 5 micrometer van de pia tot een uiteindelijke diepte van 175 micrometer. De doos gebied in A staat voor het vergroot gebied in (B) en (C) afgebeeld op dag 0 (D0) en vier dagen later (D4). (D, E) Hogere vergroting van dendritische tak boxed in B en C tonen stabiele stekels (witte pijlpunten), verloren / terug te trekken stekels (rode pijl koppen) en nieuwe stekels (groene pijl koppen). Schaal bars = A. 200 urn, B, C. 20 urn, D, E. 5 micrometer.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Chronische beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie is een steeds populairder techniek om morfologische veranderingen ten gevolge gedurende plasticiteit 2-5 te bestuderen. Hier laten we zien een verdunde-schedel voorbereiding om de geconstateerde dendritische spines in de intacte hersenen van muizen te volgen op verschillende beeldvormende dag. In dit protocol is de schedel intact gelaten, waardoor minimale schade aan de cortex en resulteert in een zeer lage niveaus van ontstekingsprocessen die kunn...

<table><tbody><tr><td>Fentanylcitraat</td><td></td><td>In-house</td><td></td><td>Fentanylcocktail: anesthetische cocktail;&lt;br/&gt;IP-dosis: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Finale cocktailconc.: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Medetomidinehydrochloride</td><td></td><td>In-house</td><td></td><td>Fentanylcocktail: anesthetische cocktail;&lt;br/&gt;IP-dosis: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Finale cocktailconc.: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>In-house</td><td></td><td>Fentanylcocktail: Anesthesiecocktail;&lt;br/&gt;IP-dosis: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Finale cocktailconc.: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribroom&amp;#8211;ethanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin-cocktail: anestheticum;&lt;br/&gt;IP-dosis: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Finale cocktailconc.: 1%</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol (Eindconcentratie: 0,775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin-cocktail: anestheticum;&lt;br/&gt;IP-dosis: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Finale cocktailconc.: 0,775%</td></tr><tr><td>TC-1000 temperatuurcontrolesysteem voor muizen</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Muis</td><td>Regulatie van de lichaamstemperatuur</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>In-house</td><td></td><td>Oogzalf</td></tr><tr><td>10% ijzer(III)chloride</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Thinned-skull preparatie</td></tr><tr><td>Microsurgisch mesje</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Thinned-skull preparatie</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaat 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Thinned-skull preparatie</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaat 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Thin-skull-preparatie</td></tr><tr><td>Zip Kicker Glue Accelerator</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Thinned-skull-preparatie</td></tr><tr><td>Micro-boorstalen frezen, 0,7 mm punt diameter</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Thinned-skull preparatie</td></tr><tr><td>Microtorque-besturingskast en Tech2000-handstuk</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000AAN/UIT</td><td>Thinned-skull preparatie</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 metric) zijden hechtdraad</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Taper C-1</td></tr><tr><td>Oogverbandpincet, 10 cm, tipbreedte 0,5 mm, gebogen</td><td>Chirurgische instrumenten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Extra fijne Bonn-schaar, 8,5 cm, rechte punt, snijkant 13 mm</td><td>Chirurgische instrumenten</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincet met patroon, recht, 2,5 mm x 1,35 mm punt, 12 cm</td><td>Chirurgisch instrumentarium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

chronische imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel voorbereiding

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo beeldvorming met behulp van twee-foton laser scanning microscopie (2PLSM) maakt de studie van levende cellen en neuronale processen in de intacte hersenen. De techniek hier gepresenteerde maakt de beeldvorming van hetzelfde gebied van de hersenen op verschillende tijdstippen (chronische imaging) met microscopische resolutie waardoor het volgen van dendritische spines die de kleine structuren die de meerderheid van de postsynaptische prikkelende locaties in het CZS te vertegenwoordigen. Het vermogen om helder fijne corticale structuren op te lossen via verschillende tijdstippen heeft vele voordelen, met name in de studie van de hersenen plasticiteit waarin morfologische veranderingen in synapsen en circuit remodelleren kan helpen verklaren onderliggende mechanismen. In deze video-en aanvullend materiaal, tonen we een protocol voor chronische in vivo beeldvorming van de intacte hersenen met behulp van een verdunde-schedel voorbereiding. De verdunde-schedel preparaat is een minimaal invasieve benadering, die potentiële schade aan de dura en / of cortex voorkomt, waardoor het begin van een ontstekingsreactie. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, is het mogelijk om duidelijk de evolutie in de dendritische wervelkolom kenmerken in de intacte hersenen gedurende een langere periode van tijd.

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor chronische<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van de intacte hersenen met behulp van een verdunde-schedel voorbereiding.

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

In vivo beeldvorming met behulp van tweefoton laser-scanning microscopie (2PLSM) maakt het mogelijk om levende cellen en neuronale processen in het intacte brein te bestuderen. De ...

Dendritische spines zijn membraanuitstulpingen van de dendriet van een neuron die synaptische input ontvangen. Het verlengen, krimpen, verschijnen of verdwijnen van spines vindt plaats als reactie op veranderingen in de functie van het neurale netwerk die voortvloeien uit specifieke patronen van neurale activiteit. Dit fenomeen staat bekend als corticale plasticiteit om morfologische veranderingen in dendritische spines te observeren.Bij levende dieren wordt een beeldplaat op de schedel van een muis bevestigd. Een deel van de schedel wordt chirurgisch uitgedund en er zijn beelden vereist bij lage en hoge vergroting. De gebieden worden vervolgens op latere tijdstippen opnieuw in beeld gebracht.De verkregen resultaten laten zien dat de morfologie van dendritische stekels duidelijk gevisualiseerd kan worden met een dunne schedelpreparaat op meerdere tijdstippen. Daarnaast is gebleken dat de morfologie van de stekels zeer plastisch is, waarbij veranderingen in structuur en zowel het verschijnen als het verdwijnen van dendritische stekels waarneembaar zijn. Hallo, ik ben Emily Kelly uit het laboratorium van Anaya Maka van de afdeling Neurobiology and Anatomy aan de University of Rochester.Vandaag laten we u de procedure zien voor chronische beeldvorming van de visuele cortex van de muis na een zogenaamde 'fins'-preparatie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de omzetting van dendritische stekels te bestuderen. Laten we beginnen.Begin de procedure door de instrumenten voor aseptische chirurgie te steriliseren. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethanol en bedek het operatievlak met een schoon verband. Controleer de diepte van de anesthesie bij een muis die is geanestheseerd met een fentanylcocktail door de reactie op een kneepje in de teen te testen; de hier getoonde muis is een A-G-F-P-M transgene muis waarin GFP tot expressie komt.In laag vijf projecteren parametale cellen dendritische uitlopers naar de oppervlakkige lagen. Om een lichaamstemperatuur van 37.5 °C te handhaven, wordt het dier op een warmtemat geplaatst en gemonitord met een aangekoppelde rectale thermometer. Breng vervolgens met een schaar oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.Verwijder het haar van de achterkant van de kop van de muis, van achter de oren tot aan de ogen. Reinig vervolgens de bovenkant van de kop van het dier door 70% ethanol aan te brengen, gevolgd door Betadine scrub en Betadine oplossing. Maak een LCU-incisie achter de oren en omhoog langs respectievelijk de rechter- of linkerkant van de middellijn, afhankelijk van welk hersenhalve naar de ogen wordt afgebeeld; vouw de huid vervolgens over en weg van de operatielocatie.Verwijder de huid niet, aangezien deze later met een fijne pincet wordt gehecht. Trek de huid voorzichtig omhoog en weg van het betreffende gebied. Schraap met een schone pincet voorzichtig het periosteum van het blootgestelde gedeelte van de schedel.Breng een kleine hoeveelheid 10% fair chloride aan op de schedel om het periosteummembraan volledig uit te drogen en te bevestigen dat het volledig is verwijderd. Het is belangrijk dat de schedel volledig droog is. Om een goede hechting van de lijm te garanderen, schraapt u het uitgedroogde periosteummembraan voorzichtig weg met een microschirurgisch mesje.Breng vervolgens een dunne laag Sano acrylijm aan rond het beeldvenster van de roestvrijstalen kopplaat en bevestig de plaat aan de schedel. Breng met het houten uiteinde van een wattenstaafje lijm aan op de binnenste naden van het beeldvenster, waarbij u er op let dat alle openingen tussen de beeldplaat en de kromming van de schedel worden opgevuld. Plaats een druppel van de lijmversneller in het venster.Veeg vervolgens snel het teveel weg. Laat de lijm drogen. Gebruik een tandartsboor voorzien van een 0,7 millimeter roestvrijstalen boortje om de schedel in het beeldvenster dunner te maken.Wissel het boren af met incidentele toepassing van 0,9% steriele zoutoplossing om overmatige warmteontwikkeling op de schedel te voorkomen. Maak een venster van vier bij vier millimeter in de schedel door kleine bewegingen over het schedeloppervlak te maken.Gebruik de tandartsboor. Test de dikte van de schedel met stompe pincetten. Het schedeloppervlak zal bij lichte druk enigszins indeuken.De optimale schedeldikte voor beeldvorming ligt tussen 10 en 30 micron. Zodra de schedel is uitgedund, dient het venster te worden gereinigd van alle resten en moet er zoutoplossing op de schedel worden aangebracht. Fotografeer het beeldvormingsvenster met een digitale camera die is gemonteerd op een dissectiescoop.De hersenvasculatuur op deze foto helpt bij het bepalen van de positie voor het plaatsen van de beeldplaat voor volgende beeldsessies. Transporteer het dier naar de twee-fotonenopstelling. Het dier moet op de warmtedeken blijven en de lichaamstemperatuur dient gedurende de gehele beeldsessie continu te worden gemonitord.Een tweefotonmicroscoop met een Mi.Tai-laser. Er wordt gebruikgemaakt van een solid-state pomplaser van 10 watt voor maximaal vermogen en een aangepaste Olympus flow view confocale unit. Het systeem is geoptimaliseerd voor diepe weefselbeeldvorming en externe detectoren zijn zo dicht mogelijk bij het objectief geïnstalleerd om maximale detectie van fluorescentie uit de hersenen mogelijk te maken; voeg een druppel zoutoplossing toe aan het beeldvenster met een lage digitale zoom.Identificeer een gebied met helder gelabelde neuronen met behulp van een digitale camera die op de microscoop is bevestigd. Maak vervolgens een foto van het beeldgebied. Dit is noodzakelijk om op een later tijdstip terug te keren naar dezelfde beeldlocatie.Verkrijg een stack met lage vergroting door de gehele zichtbare omvang van de hersenen om de mate van dendritische vertakking te tonen. Dit zal worden gebruikt om het beeldgevingsgebied op volgende tijdstippen te lokaliseren, aangezien zowel bloedvaten als dendrieten hun structuur behouden in jonge en volwassen dieren met behulp van beeldgevingssoftware.Verhoog de digitale vergroting met een factor acht, pas indien nodig de XY-coördinaten aan en verzamel een stack met hoge vergroting, die de gedetailleerde dendritische morfologie zal tonen, inclusief de locaties en structuur van dendritische spines. Maak gedetailleerde aantekeningen over elke stack-verzameling, inclusief de pan-coördinaten, het verzamelbereik, de Z-stapgrootte en het aantal stappen in de stack. Deze aantekeningen worden gebruikt bij het terugkeren naar deze dendriet of axon op een later tijdstip.Verwijder na de beeldvorming de hoofdplaat door deze voorzichtig van het schedeloppervlak te scheiden met een pincet. Verwijder alle lijmresten en veeg de schedel schoon met 0,9% steriele zoutoplossing.Hecht de huid over de schedel samen met hechtgaren nummer zes. Veeg het gebied na de beeldvormingsprocedure af met 70% ethanol. Plaats het dier in een schone kooi onder een warmtelamp totdat het wakker wordt en mobiel is.Plaats het dier vervolgens terug in de oorspronkelijke kooi om het dier op een later tijdstip opnieuw te beelden, variërend van twee dagen tot vele maanden later; verwijder de hechtingen en open de huid op de kop opnieuw. Gebruik met aseptische methoden de digitale afbeelding van de hersenvasculatuur die tijdens de eerste operatie is gemaakt om de oorspronkelijke beeldlocatie te bepalen. Fixeer vervolgens de kopplaat opnieuw zoals voorheen.Gebruik indien nodig een microsurgisch mesje om voorzichtig eventueel bot weg te schrapen dat tussen de beeldvormingsmomenten is teruggegroeid. Dun het bot verder uit met een tandheelkundige boor, maak het beeldvormingsvenster vrij van debris en breng een druppel 0,9% steriele zoutoplossing aan. Breng het dier naar een tweefotonenmicroscoop en lokaliseer het oorspronkelijke beeldvormingsgebied aan de hand van de digitale fluorescentieafbeelding die tijdens de vorige sessie is gemaakt.Start het programma voor de flowview. Open de oorspronkelijke afbeelding met lage vergroting, bevestig een transparante vel op het computerscherm en schets het patroon van de belangrijkste bloedvaten met een transparantpen. Open vervolgens het live-beeld en lijn de bloedvaten opnieuw uit met het geschetste patroon op de transparante folie.Verwijder de transparantie om de acht keer ingezoomde structuren opnieuw te beelden. Open de gewenste verzamelde stack uit de vorige beeldsessie. Schets de structuur op een transparantiefolie die op het computerscherm is bevestigd.Zoom acht x in op het live-beeld en lijn het beeld uit met de transparantie. Afhankelijk van de nauwkeurigheid van de uitlijning bij de lage vergroting, kan het nodig zijn om ook de hoek van het beeld enigszins aan te passen; stel de pan-coördinaten in op de beeldparameters van de eerste dag, inclusief de stapgrootte en het aantal te verzamelen beelden voor de z-stack. De herimaging kan tweemaal worden uitgevoerd. Het aantal keren dat de hoofdhuid wordt geopend, moet worden beperkt om te voorkomen dat de integriteit van de schedel wordt aangetast, wat zou leiden tot een slechte beeldresolutie bij GFP-expresserende muizen.Een subset van parametale cellen in laag vijf en de bijbehorende dendritische uitlopers werden hier gevisualiseerd met in vivo tweefoton laser-scanning microscopie; GFP-gelabelde dendrieten van de visuele cortex worden getoond. Deze afbeelding is een projectie van een enkele afbeelding die elke vijf micron werd genomen vanaf de PIA tot een uiteindelijke diepte van 175 micron. Het omkaderde gebied wordt hier op een hogere vergroting getoond op dag nul, en opnieuw op dag vier hier; een vergelijking van afbeeldingen met een hogere vergroting van een dendritische vertakking van dag nul en dag vier.Deze afbeeldingen tonen stabiele spines, aangegeven door de witte pijlpunten, verdwenen of terugtrekkende spines, gemarkeerd door de rode pijlpunten, en nieuwe spines, aangegeven door de groene pijlpunten. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u chronische tweefoton-imaging uitvoert in de visuele cortex van de muis met behulp van een dunne schedelpreparaat. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er tijdens het dunnen extra zorgvuldig te werk moet worden gegaan om schade aan de schedel en de onderliggende dura te voorkomen, aangezien dit zal leiden tot een slechte beeldresolutie, en dat gedetailleerde aantekeningen moeten worden gemaakt.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video en protocol laten zien hoe je een met glas overdekt craniale venster in knaagdieren implantaat. Deze preparaten kunnen worden gebruikt voor chronische in vivo twee-foton beeldvorming van de neocortex loop van de tijd schalen van maanden. Het kan ook worden gebruikt voor andere vormen van beeldvorming, met inbegrip van optische intrinsieke signaal beeldvorming.

Een craniotomie chirurgische ingreep voor chronische Brain Imaging

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Door het combineren van een gepolijste en versterkte dunne-schedel (poorten) craniale venster en glioblastoma (GBM) cel injectie, kunnen we zien glioom initiatie en groei van geïnjecteerd GBM cellen in de hersenen van een levende muis lengterichting.

Imaging glioom Initiatie<em&gt; In Vivo</em&gt; Door middel van een gepolijst en versterkte Thin-schedel Schedel Window

Presenteren we een methode om een ​​uitgedunde schedel corticale venster (TSCW) in een muizenmodel...

Verdund-schedel Corticale Venster Techniek voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Dit manuscript beschrijft een procedure om de herinrichting van de cerebrovasculature volgen tijdens amyloïde plaque accumulatie in vivo met behulp van longitudinale twee-foton microscopie. Een uitgedunde schedel bereiden voor de visualisatie van fluorescente kleurstoffen om de progressie van cerebrovasculaire schade te beoordelen in een muizenmodel van de ziekte van Alzheimer.

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

Leer chronische in vivo beeldvorming van de visuele cortex bij muizen met een verdunde-schedel voorbereiding. Deze methode maakt observatie van dendritische spine-dynamica mogelijk voor onderzoek naar corticale plasticiteit.

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Meer video's verkennen