Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Dendritische stekels zijn membraanuiteinden van een neuron dat synaptische input ontvangt. Het verlengen, verkleinen of verdwijnen van stekels gebeurt als reactie op veranderingen in de functie van het neurale netwerk die het gevolg zijn van specifieke patronen van neurale activiteit. Dit fenomeen staat bekend als corticale plasticiteit om morfologische veranderingen in dendritische stekels te observeren.

Bij levende dieren wordt een beeldvormingsplaat bevestigd aan de schedel van een muis. Een gebied van de schedel wordt chirurgisch verdund en er zijn beelden nodig met lage en hoge vergroting. De gebieden worden vervolgens op latere tijdstippen opnieuw gefotografeerd.

De verkregen resultaten laten zien dat de morfologie van dendritische stekels duidelijk kan worden gevisualiseerd met behulp van een dunne schedel voorbereiding op meerdere tijdstippen. En dat de morfologie van de stekels zeer plastisch is, met veranderingen in structuur en ook het verschijnen en verdwijnen van dendritische stekels. Hallo, ik ben Emily Kelly in het laboratorium van Anaya Maka in de afdeling Neurobiologie en Anatomie aan de Universiteit van Rochester.

Vandaag laten we u de procedure zien voor chronische beeldvorming van de visuele cortex van de muis volgens een bepaalde voorbereiding. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om dendritische stekelomwisseling te bestuderen. Dus laten we beginnen.

Begin de procedure door de gereedschappen te steriliseren voor aseptische chirurgie. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethanol en bedek het operatieoppervlak met een schone dressing. Monitor de diepte van de anesthesie in een muis die is verdoofd met een fentanylcocktail door de reactie op een teenprik te testen. De muis die hier wordt getoond is een A-G-F-P-M transgene muis waarin GFP wordt uitgedrukt.

In laag vijf projecteren parametale cellen dendritische processen naar de oppervlakkige lagen. Om een lichaamstemperatuur van 37,5 graden Celsius te handhaven, plaats de dieren op een verwarmingsdeken en bewaak deze met een aangesloten rectale thermometer. Breng vervolgens oogzalf aan in de ogen om te voorkomen dat deze uitdrogen met behulp van een schaar.

Verwijder het haar van de achterkant van het hoofd van de muis van achter de oren tot aan de ogen. Reinig vervolgens de bovenkant van het hoofd van het dier met een aanbrenging van 70% ethanol, gevolgd door Betadine scrub en Betadine oplossing. Maak een LCU-snede achter de oren en langs de rechter of linker kant van de middenlijn, afhankelijk van welk halfrond zal worden gefotografeerd tot aan de ogen, vouw de huid over en weg van de operatieplaats.

Verwijder de huid niet, omdat deze later zal worden genaaid met behulp van fijne pincetten. Trek voorzichtig de huid omhoog en weg van het gebied van belang. Gebruik schone pincetten om voorzichtig het periosteum van het blootgestelde gebied van de schedel te schrabben.

Breng een kleine hoeveelheid 10% fairchloride aan op de schedel om het periosteummembraan volledig te drogen en ervoor te zorgen dat het volledig is verwijderd. Het is belangrijk dat de schedel volledig droog is. Om een goede hechting van de lijm te garanderen, schraap voorzichtig het opgedroogde periosteummembraan weg met een microchirurgisch mes.

Breng vervolgens een dunne laag Sano acryllijm aan rond de beeldvormingsvenster van de roestvrijstalen kopplaat en bevestig de plaat aan de schedel. Gebruik het houten uiteinde van een wattenstaafje om lijm aan te brengen op de binnennaden van het beeldvormingsvenster, zorg ervoor dat alle openingen tussen de beeldvormingsplaat en de kromming van de schedel worden gevuld. Plaats een druppel van de lijmversneller in het venster.

Wis vervolgens snel het overtollige weg. Laat de lijm drogen zodra de lijm volledig is opgedroogd. Gebruik een tandheelkundige boor voorzien van een roestvrijstalen boor van 0,7 millimeter om de schedel in het beeldvormingsvenster te verdunnen.

Wissel het boren af met incidentele toepassing van 0,9% steriel zoutoplossing. Om te voorkomen dat er te veel hitte op de schedel wordt gegenereerd. Maak een venster van vier bij vier millimeter op de schedel met kleine slagen over het schedeloppervlak.

Met de tandheelkundige boor. Test de dunheid van de schedel met een pincet met stomp uiteinde. Het schedeloppervlak zal licht inzakken onder lichte druk.

De optimale schedeldikte voor beeldvorming is tussen de 10 en 30 micron. Zodra de schedel is verdund, maak het venster schoon van alle puin en breng zoutoplossing aan op de schedel. Fotografeer het beeldvormingsvenster met een digitale camera gemonteerd op een dissectiescoop.

De hersenvaten op deze foto helpen bij het lokaliseren van de positie om de beeldvormingsplaat te plaatsen voor de volgende beeldvormingssessies. Breng het dier naar de twee foton rig. Het dier moet op de verwarmingsdeken blijven en de lichaamstemperatuur moet gedurende de hele beeldvormingssessie continu worden gemonitord.

Een twee foton microscoop met een mi tai laser. Een 10 watt solid state pomp voor maximale kracht en een aangepaste Olympus flow view confocale eenheid worden gebruikt. Het systeem is geoptimaliseerd voor diep weefselbeeldvorming en externe detectoren zijn geïnstalleerd zo dicht mogelijk bij het objectief om maximale detectie van fluorescentie uit de hersenen mogelijk te maken, voeg een druppel zoutoplossing toe aan het beeldvormingsvenster met behulp van lage digitale zoom.

Identificeer een gebied met fel gelabelde neuronen met behulp van een digitale camera bevestigd aan de microscoop. Ips, maak een foto van het beeldvormingsgebied. Dit is noodzakelijk om op een later tijdstip terug te keren naar dezelfde beeldvormingslocatie.

Verkrijg een laagvergrotingsstapel door de hele zichtbare omvang van de hersenen te tonen die de omvang van dendritische vertakking toont. Dit zal worden gebruikt om het beeldvormingsgebied te lokaliseren op latere tijdstippen, zowel bloedvaten als dendrieten. Behoud hun structuur bij jonge en volwassen dieren met behulp van beeldvormingssoftware.

Vergroot de digitale vergroting acht