Name: IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Leer de IP-FCM-methode voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties met behulp van immunoprecipitatie en flowcytometrie. Deze techniek werkt met kleine monsters zonder genetische modificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Eagles Innovation Award (Fraternal Orde van Eagles) en door de Mayo Foundation.

** Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 1: zeer gevoelig detectie en kwantitatieve analyse van natief eiwit-eiwit interacties en multiprotein complexen door flowcytometrie. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. Wetenschap STKE 2007 (389): pl2, 5 juni 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Klik hier om deze publicatie te zien</a> . Voorafgaand aan Starten, verzocht de volgende Waterige Stock Solutions: <table><tbody><tr><td> MES Koppeling Buffer: </td><td> Bewaren bij 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Afschrikken / blokkeren / Storage (QBS) Buffer: </td><td> Bewaren bij 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM Buffer: </td><td> Bewaren bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Voorafgaand onmiddellijk voor te bereiden op gebruik: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Los 50 mg / ml EDAC poeder in MES koppeling Buffer </td></tr><tr><td> Digitonine oplossing (2% w / v): </td><td> Los digitonine poeder in dH 2 O door verhitting tot 95 ° C voor 5min daarna afkoelen op ijs </td></tr><tr><td> Lysis Buffer: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 Mm </td></tr><tr><td> Digitonine oplossing </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Proteaseremmers </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Keep on ice </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Koppeling van mAb aan Beads <ol><li> Bepaal de concentratie van kralen uit de gekochte voorraad door het verdunnen in PBS en tellen met een hemacytometer. Begin met een verdunning van 1:10000 kralen voor het tellen. </li><li> Pipetteer 18 x 10 6 kralen in een 1.5-mL microcentrifugebuis. </li><li> Was de kralen 2 tot 3 keer in 0,5 tot 1,0 ml MES koppeling Buffer, centrifugeren bij 20.000 g gedurende 3 minuten bij 25 ° C na elke wasbeurt. </li><li> Resuspendeer de kralen in 50 uL MES Koppeling Buffer. </li><li> Activeer de carboxylgroepen op de kralen door de toevoeging van 20 ul van vers bereide EDAC-MES. </li><li> Mix zachtjes gedurende 15 min bij 25 ° C door met de hand en neer te pipetteren. </li><li> Was de geactiveerde kralen 2 tot 3 keer in 0,5 tot 1,0 ml PBS, centrifugeren bij 20.000 g gedurende 3 minuten bij 25 ° C na elke wasbeurt. </li><li> Resuspendeer de geactiveerde kralen in 50 ul PBS. </li><li> Voeg 50 ul van de IP-mAb (bij 0,2-1,0 mg / ml voorraad concentratie) aan de geactiveerde kraal oplossing. </li><li> Mix voor 3 tot 4 uur bij 25 ° C door het plaatsen van de buis op een trillend shaker. Schud voldoende om te voorkomen dat de afwikkeling van de kralen op de bodem van de buis. </li><li> Was mAb-gekoppelde beads 2 tot 3 keer in 0,5 tot 1,0 ml PBS, centrifugeren bij 20.000 g gedurende 3 minuten bij 25 ° C na elke wasbeurt. </li><li> Resuspendeer de kralen in 100 ul QBS Buffer. Deze kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Opschorting van de beads goed, verdunnen 1:200-1:10,000 in PBS en tellen met een hemacytometer. De concentratie moet worden gemeten voor elke voorbereidende partij, zodat het aantal kralen die in elk IP-of pull-down experiment kan nauwkeurig worden geregeld. </li></ol> 2. Post-nucleaire Lysate Voorbereiding en Ip De lysis methode en optimale lysis voorwaarden hangt af van het celtype en de eiwit-eiwit interacties onderzocht. Een aantal protocollen bestaan ​​en kan worden aangepast voor uw toepassing. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 'kleine' cellen, zoals lymfocyten, of 5 x 10 6 'grote' cellen, zoals macrofagen of tumorcellen, in 100 ui verse Lysis buffer in een 1.5-mL microcentrifugebuis voor 20min op het ijs. Schaal van de lysis volume als dat nodig is. </li><li> Voor het verwijderen van kernen en onoplosbare cellulaire puin, centrifuge het lysaat op 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Houd het supernatant af en gooi de pellet. </li><li> Voeg 0,5 x 10 5 tot 2,5 x 10 5 mAb-gekoppeld kralen aan de geklaarde lysaat, pipetteren voorzichtig te mengen. Het minimale volume die we gebruiken omhet uitvoeren van een enkele IP is 5 microliter. </li><li> Leg ze op een verticale draaiende wiel 4 uur tot 's nachts in een koude kamer. Ingesteld om voldoende snelheid om de kralen te voorkomen dat de afwikkeling. Het is aanvaardbaar voor de vloeistof van laag-volume IP's in de bodem van de buis te blijven tijdens het draaien. </li></ol> 3. Aftasten van Bead-gevangen eiwit met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen <ol><li> Was de IP-kralen twee keer bij 0,2 tot 1,0 ml ijskoude FCM Buffer, centrifugeren bij 20.000 g bij 4 ° C gedurende 3 minuten na elke wasbeurt. </li><li> Resuspendeer de kralen in 100 ul FCM Buffer en aliquot 20 pi in elk van de vijf of meer 1.5-mL microcentrifugebuizen of putten van een schoorsteen-bodemplaat. </li><li> Voeg fluorochroom-geconjugeerd mAbs om de monsters. Voer de FCM vlek volgens de leverancier de instructies of volgens het empirisch bepaalde concentraties. Als uitgangspunt, voeg 0,2 tot 1 ul van aandelen antilichaam-oplossing (bij 0.2-1.0 mg / ml) per tube of goed, en incubeer gedurende 40 minuten op het ijs. </li><li> Was peilden kralen in 1,5 ml buisjes twee keer in 1,0 ml ijskoude FCM Buffer, centrifugeren bij 20.000 g bij 4 ° C gedurende 3 minuten na elke wasbeurt. Verwijder voorzichtig het supernatant na elke wasbeurt, zorg ervoor dat u de kralen verstoren. Voor een schoorsteen-bodemplaat, was twee keer met 0,2 ml ijskoude FCM Buffer, centrifugeren bij 1000g gedurende 5 min bij 4 ° C na elke wasbeurt. Een multichannel pipet is handig voor deze stap. Om supernatant uit kralen in een schoorsteen-bodemplaat, 'flick' de plaat een keer, toen, terwijl nog upside-down, blot alle druppels van de randen van de putten. De resterende volume in elk putje, met de kralen, zal ongeveer 20 pi worden. </li><li> Resuspendeer de kralen in 200 pi FCM Buffer per monster. Transfer naar het label FACS buizen. Monsters zijn nu klaar voor FCM. </li></ol> 4. FCM Acquisitie De CML kralen beschreven in dit protocol zijn 3 tot 5 micrometer in diameter, ongeveer de helft van de diameter van een slapende muis lymfocyt. Daarom kan het nodig zijn om handmatig te verhogen Forward Scatter (FSC) versterker te krijgen en de Side Scatter (SSC) spanning, om voor de bevolking van de kraal gebeurtenissen te registreren op schaal. Individuele IP kralen moeten vormen een strak geclusterde bevolking. De instellingen en de gate moet worden aangepast tot hiel wambuizen en puin uit te sluiten. <ol><li> Voorafgaand aan de lopende kralen of kralen normen, verwijder dan de druppel insluiting huls dat de steekproef inlaat rond op sommige cytometers. Laat de schede vloeistof te druppelen tussen de samples, omdat dit de inlaat te wissen en te voorkomen dat kralen van worden overgeboekt van het ene monster naar het andere. </li><li> Gebruik ongelabelde kralen, een negatieve controle van de fluorescentie, en Rainbow Kalibratie Particles (RCPs), een positieve controle van fluorescentie, om de instellingen aan te passen, zodat zowel de negatieve en positieve fluorescentie uitersten tegelijkertijd op de log-schaal van de x-as. Dit zorgt ervoor dat de fluorescentie van de experimentele monsters ook zal zijn op schaal. Merk op dat RCPs kleiner zijn dan de CML kralen, zodat FSC en SSC parameters, evenals gate positie, kan het nodig zijn om tijdelijk worden aangepast voor dat monster. </li><li> Keer terug naar ongelabelde-bead instellingen een keer kalibratie met RCPs is voltooid. Als er slechts een fluorescente probe per monster wordt gebruikt, geen fluorescentie compensatie nodig is. In het algemeen, we probe multiprotein complexen met een fluorochroom-geconjugeerd mAb per FCM monster, en we meerdere interactie partners onderzoeken door kleuring parallel kraal monsters met mAbs specifiek voor de verschillende subeenheden. </li><li> Verwerven en op te slaan fluorescentie gegevensbestanden. Analyse kan dan worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie software zoals CellQuest, FlowJo of cflow. </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. IP-FCM voor TCR/CD3 multiprotein complex. T-cellen van de muis stam BALB / c werden gelyseerd in 1% digitonine, en het lysaat werd onderworpen aan IP-FCM met behulp van anti-CD3ε kralen. De gevangen complexen die grote hoeveelheden van TCR-β (paars regio) en co-geassocieerde CD3-ε (groen), maar dicht bij achtergrond niveaus (gedefinieerd door de irrelevante immunoglobuline sonde, roze spoor) van andere eiwitten zoals Thy1.2, CD45, of H-2K (d) (bruin, oranje en blauw sporen, respectievelijk). Zie soortgelijke eerder gepubliceerde resultaten 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Informatie over eiwit-eiwit interacties is zeer relevant voor de analyse van een groot aantal cellulaire processen zoals signaaltransductie, geslacht rijping, cel-cyclus progressie, en apoptose watervallen. IP-FCM biedt een snelle, kwantitatieve, en gevoelige manier om de interactie van eiwitten te onderzoeken en bepalen de leden van multiprotein complexen in hun natieve conformatie. Kralen kunnen worden gekoppeld en geïncubeerd met cellysaten in een dag en kan worden gepeild en geanalyseerd de volgende dag. Een 96-well plaat formaat zorgt voor grote aantallen monsters te analyseren in een keer om een ​​efficiënte verzameling van gegevens voor statistische of screening doeleinden. Met behulp van fluorescerende kraal normen, kan het aantal eiwitten gevangen genomen door elke kraal worden geschat. Zeer weinig bronmateriaal nodig is voor het vastleggen en detectie, zo beperkt samples en schaarse analyten mogen alleen nog worden geanalyseerd voor meerdere interacties. Hoewel de IP-FCM vereist geen genetische manipulatie, epitoop-tagging, denaturatie, of in-vitro mengen van eiwitten in een niet-fysiologische omgeving, kan het gepaard gaan met deze en andere technieken, waardoor het een waardevol en toegankelijk hulpmiddel bij toepasselijkheid op vele biologische systemen. Problemen oplossen: Veel IP-FCM experimenten genereren bruikbaar proteïne interactie data van de eerste keer dat ze worden geprobeerd. Echter, het optimaliseren van IP-FCM kan antilichaam conjugatie te verbeteren kralen, eiwitcomplex te vangen, en fluorescerende probe bindend. De efficiëntie van IP-antilichaam conjugatie kan worden bepaald door sonderen gekoppeld kralen direct met een anti-immunoglobuline antilichaam. Als dit rendement laag is, kan het verhogen van de concentratie van antilichaam tijdens de koppelingsreactie kunnen meer IP-antistoffen te hechten aan elke kraal. Dit kan de bindingscapaciteit van de IP-kraal partij, wat resulteert in verbeterde vangen en opsporen van analyten. Andere primaire-amine bevattende moleculen (bijv. Tris, bovine serum albumine) mag niet aanwezig zijn tijdens de koppeling reactie, want deze kunnen met het mAb strijden om kraal hechting en resulteren in een lage mAb koppeling. Als vervoeging van mAb aan kralen blijkt problematisch om andere redenen, kunnen kralen in plaats daarvan worden gekoppeld aan avidine / streptavidine en gebiotinyleerde antilichamen kunnen vervolgens niet-covalent gebonden en gebruikt voor immunprecipitation. Ondanks de goede antilichaam conjugatie, kunnen de eerste detectie van kraal-geassocieerde fluorescentie laag zijn. De eerste, complexe capture zelf kan te laag zijn. Omdat de IP-FCM afhankelijk van de concentratie van analyten, het verhogen van het aantal cellen gelyseerd per eenheid lysis volume kan toenemen analyt vangen en detectie. Bovendien is het mogelijk vast te leggen worden vergroot door het verminderen van het aantal IP-kralen geïncubeerd met het lysaat, die gevangen complexen over minder kralen, en resulteert in een toename van de gemiddelde fluorescentie per kraal wanneer gepeild verdeelt. Ten tweede, is het mogelijk dat de toegang van de sonde antilichaam aan de gevangen complexen sterisch gehinderd wordt door de immunoprecipitating antilichaam. In dit geval kan het probleem worden aangepakt door het gebruik van verschillende antilichamen en / of sonde vast te leggen.

<table><tbody><tr><td>carboxylaat-gemodificeerde polystyreen latex (CML) beads (5mm surfactant-vrij)</td><td>Reagens</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Bewaren bij 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Rainbow Calibration Particles</td><td>Reagens</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Bewaren bij 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>2-[N-Morpholino]ethaansulfonzuur (MES)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiïmide HCl (EDAC)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Bewaren bij -20&amp;#x00B0;C onder desiccante omstandigheden.</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor General Use Cocktail, bevattend AEBSF, Bestatine, Aprotinine, EDTA, E-64 en Leupeptine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>Bereid 100x voorraadoplossing in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Aliquoteer en bewaar bij -20&amp;#x00B0;C. Hanteer met handschoenen.</td></tr><tr><td>PCR-platen, 96-well 0,2mL, natuurlijk, hoge schoorsteen</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>Voor gebruik in plaats van microcentrifugebuizen tijdens FCM-kleuring</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitatie gedetecteerd door flowcytometrie (IP-FCM) is een efficiënte methode voor het detecteren en kwantificeren van eiwit-eiwit interacties. Het basisprincipe breidt dat van de sandwich ELISA, waarin de gevangen primaire analyt samen kunnen worden gedetecteerd met andere moleculen fysiek verbonden binnen multiprotein complexen. De procedure heeft betrekking op covalente koppeling van polystyreen latex microkorrels met immunoprecipitating monoklonale antilichamen (mAb) die specifiek zijn voor een eiwit van interesse, incuberen deze kralen met cellysaten, indringende gevangen eiwit-complexen met fluorochroom-geconjugeerde probes, en het analyseren van kraal-geassocieerde fluorescentie door flowcytometrie. IP-FCM is uiterst gevoelig, laat de analyse van eiwitten in hun eigen (niet-gedenatureerde) staat, en vatbaar is voor een semi-kwantitatieve of kwantitatieve analyse. Als extra voordelen, IP-FCM vereist geen genetische manipulatie of gespecialiseerde apparatuur, anders dan een flowcytometer, en het gemakkelijk kan worden aangepast voor high-throughput toepassingen.

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Immunoprecipitatie gedetecteerd door flowcytometrie (IP-FCM) is een efficiënte methode voor het detecteren en kwantificeren van eiwit-eiwitinteracties. De basis ...

In de IP FCM-experimenten worden eiwitcomplexen op kralen gevangen om de verschillende interagerende eiwitten te identificeren en te bestuderen. Eerst wordt een immunoprecipitatie-antilichaam, specifiek voor het eiwit van belang, covalent gekoppeld aan polystyreenlatex-kralen. Als tweede stap worden deze kralen geïncubeerd met cellysaten, waardoor het specifieke eiwit en de interagerende eiwitten aan de kralen kunnen binden.De kraaltjes samen met de gevangen eiwitten werden gewassen en vervolgens gesondeerd met fluorescentie-gelabelde antilichamen die specifiek zijn voor verschillende moleculen die geassocieerd kunnen zijn met het immunoprecipitatie-eiwit. Ten slotte worden de fluorescentie-gelabelde kraaltjes geanalyseerd via flowcytometrie om te bepalen welke eiwitten aanwezig zijn of juist ontbreken in de gevangen complexen. De voordelen van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals immunoprecipitatie gevolgd door western blotting, is dat I-P-F-C-M de beoordeling van natuurlijke eiwit-eiwitinteracties mogelijk maakt zonder dat genetische modificatie of grote monstergroottes vereist zijn.I-P-F-C-M kan een hoge signaal-ruisverhouding opleveren, zelfs wanneer er zeer weinig biomateriaal beschikbaar is voor analyse, aangezien het kan worden uitgevoerd met kleine volumes en lage concentraties analyten. Om deze procedure te starten, bereid de volgende buffers voor: MES-koppelingsbuffer, quenching-blocking-opslagbuffer (afgekort QBS) en flowcytometrie- of FCM-buffer. Bepaal de concentratie van de carboxylaat-gemodificeerde polystyreen latex-beads of CML-beads door deze te verdunnen in PBS en te tellen met een hemocytometer.Zodra de concentratie van de beads is bepaald, pipetteer 18 × 10⁶ beads in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Was de beads twee tot drie keer in 0,5 tot 1 milliliter MES-koppelingsbuffer door te centrifugeren bij 20.000 ×g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na elke wasbeurt terwijl de beads centrifugeren.Bereid verse e dac MES-buffer voor voor het activeren van de beads. Zodra de wasstappen zijn voltooid, dient de buffer op kamertemperatuur of op ijs te worden bewaard. Resuspendeer de beads na de laatste wasstap in 50 microliters van de MES-koppelingsbuffer.Voeg vervolgens 20 µL EEC MES toe aan de kralensuspensie. Om de carboxylgroepen op de kralen te activeren, wordt het mengsel voorzichtig bij kamertemperatuur gemengd door gedurende 15 minuten continu handmatig met de pipet op en neer te zuigen. Hoewel deze stap arbeidsintensief is, levert deze mengmethode na het mengen de beste resultaten op.Was de geactiveerde beads twee tot drie keer in 0,5 tot 1 milliliter PBS Centrifusion bij 20.000 ×g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na elke wasbeurt en na de laatste wasbeurt, resuspendeer de geactiveerde beads in 50 µL PBS om het IP-antilichaam aan de beads te koppelen. Voeg 50 µL van het IP-monoklonale antilichaam toe vanuit een voorraadconcentratie tussen 0,2 tot 1 mg/mL.Zorg ervoor dat er geen andere moleculen met primaire aminen aanwezig zijn dan het antilichaam. Deze aminehoudende moleculen, zoals tris of runder-serumalbumine, concurreren met het antilichaam bij de koppeling aan de beads. Meng de suspensie van beads en antilichamen drie tot vier uur op een trilshaker bij kamertemperatuur.Schud voldoende om te voorkomen dat de kraaltjes naar de bodem van de buis zakken. Na binding worden de antilichaam-gecodeerde kraaltjes twee tot drie keer gewassen in 0,5 tot 1 ml PBS door te centrifugeren bij 20.000 ×g.Laat het drie minuten bezinken bij kamertemperatuur na elke wasbeurt. Resuspendeer de beads tenslotte in 100 microliter QBS-buffer. De koppeling van monoklonale antilichamen aan CML-beads kan worden gecontroleerd door de beads te kleuren met fluorogeconjugeerde antilichamen tegen IgG.Na de FCM-analyse kunnen de met het monoklonale antilichaam gecoate beads worden bewaard bij vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor gebruik in een IP-experiment. Suspendeer eerst de beads goed, verdun deze 1:200 tot 1:10.000 in PBS en tel ze met een hemocytometer. De concentratie moet voor elke preparatieve batch worden gemeten, zodat het aantal beads dat in elk IP-experiment wordt gebruikt, nauwkeurig kan worden gecontroleerd.Bereid vervolgens een verse dig-oplossing in water met een concentratie van 2% gewicht per volume. Verhit dit vijf minuten lang tot 95 graden Celsius. Koel het daarna af op ijs.Verdun, lossen op in vers bereide lysisbuffer (1% w/v) en op ijs bewaren. Bepaal het aantal te lyseren cellen aan de hand van de getoonde tabel als richtlijn. Het benodigde aantal cellen is echter afhankelijk van het eiwit van belang en moet empirisch worden bepaald.Hier worden 30 × 10⁶ cellen van een kleine lymfatische tumorcellijn gebruikt. Breng het benodigde volume van de celсусpensie over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Pelleteer de cellen bij 20.000 ×g.Laat het mengsel 30 seconden bezinken bij vier graden Celsius en zuig het medium af. Voeg de juiste hoeveelheid vers bereide digelysebuffer toe aan het pellet en meng dit voorzichtig door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen.Laat de cellen vervolgens 20 minuten op ijs lyseren. Let op dat de lysecondities kunnen variëren afhankelijk van het celtype en de bestudeerde eiwit-eiwitinteracties, en dat empirisch moet worden bepaald wanneer de lyse voltooid is. Verwijder de kernen en onoplosbaar cellulair debris door het lysaat te centrifugeren bij 20, 000 ×g.Centrifugeer 10 minuten bij vier graden Celsius. Behoud de supernatant en verwijder het pellet om het doeleiwit aan de met antilichamen gecoate kraaltjes te binden. Voeg voorzichtig via pipetteren 50.000 tot 250.000 met monoklonaal antilichaam gekoppelde kraaltjes toe aan het geklaarde lysaat.Om het minimale volume lysaat te mengen dat wordt gebruikt voor een enkele IP, zijn vijf microliters nodig. Plaats het geklaarde lysaat en het kraalmengsel gedurende vier uur tot overnacht op een draaiend verticaal wiel in een koelruimte, ingesteld op een voldoende snelheid om te voorkomen dat de kralen naar beneden zakken onder het volume ips; de vloeistof kan tijdens het draaien onderin de buis blijven. Na de binding van het doeleiwit aan het IP-antilichaam.Ga verder met het fluorescent labelen van het immunocomplex. Was de IP-beads twee keer in één milliliter ijskoud FCM-buffer door drie minuten te centrifugeren bij 20 000 ×g bij vier graden Celsius. Resuspendeer de beads na elke wasbeurt in 100 µL FCM-buffer en verdeel aliquoten van 20 µL over vijf of meer buisjes.Microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter of wells van een plaat met kegelvormige bodem. Beiden worden hier getoond. Voeg fluorochroom-geconjugeerde monoclonale antilichamen toe aan de monsters.Voer de FCM-kleuring uit volgens de instructies van de leverancier of gebruik empirisch bepaalde concentraties als startpunt. Voeg 0,2 tot 1 µL stock-antilichaamoplossing van ten minste 0,1 mg/mL per buis of well toe en incubeer 40 minuten op ijs. Was de gemerkte beads in 1,5 mL buizen twee keer met 1 mL ijskoud.FCM-buffer, centrifugeren bij 20 000 ×g bij vier graden Celsius gedurende drie minuten. Verwijder na elke wasbeurt voorzichtig het supernatant, waarbij u er op let de beads niet te verstoren.Alternatief wordt voor een chimney-bottom plate twee keer gewassen met 0,2 milliliters ijskoud FCM-buffer door te centrifugeren bij 1000 times gravity gedurende vijf minuten bij vier degrees Celsius. Na elke wasbeurt, na elke wasbeurt. Om het supernatant van de beads te verwijderen, wordt de plaat eenmaal kort geschud en vervolgens, terwijl deze nog ondersteboven is, worden eventuele druppels van de randen van de wells weggeblot.Het residuvolume in elke well met de beads zal ongeveer 20 µL zijn. Suspendeer de beads in 200 µL FCM-buffer per monster en breng deze over naar gelabelde fax-buisjes. De monsters zijn nu klaar voor flowcytometrie of FCM op Becton Dickinson-flowcytometers.Verwijder de beschermhuls voor druppels die mogelijk rond de monsterinlaat of sip zit. Laat de sip tussen monsters door druppelen, omdat dit voorkomt dat kraaltjes van het ene monster naar het andere worden overgedragen. De hier gebruikte CML-kraaltjes hebben een diameter van drie tot vijf µm, ongeveer de helft van de diameter van een rustende muislymfocyt.Daarom kan het nodig zijn om de forward scatter amp gain en de side scatter voltage handmatig te verhogen, zodat de populatie kraal-events geregistreerd wordt op de cytometer; dit gebeurt hier met ongelabelde of blanco kralen. De instellingen in de gate worden aangepast om kralen, doubletten en debris uit te sluiten vóór de uitlezing.Experimentele monsters waarborgen dat de fluorescentie binnen de schaal valt. De ongelabelde kraaltjes dienen als negatieve controle voor fluorescentie en rainbow calibration particles of RCP's kunnen worden gebruikt als positieve controle voor fluorescentie. Omdat RCP's kleiner zijn dan de CML-kraaltjes, moeten de parameters voor forward scatter en side scatter, alsof mogelijke gate-posities, tijdelijk worden aangepast voor dat monster.Na deze kalibraties worden de negatieve en positieve fluorescentie-extremen gevisualiseerd op een logaritmische as. Zodra de kalibratie met RCP's is voltooid, keert u terug naar de instellingen voor niet-gelabelde beads voor forward scatter en side scatter. Zolang er slechts één fluorescent probe per monster wordt gebruikt, zoals in het hier getoonde experiment, is er geen fluorescentiecompensatie nodig.Verkrijg en sla nu de fluorescentiedata-bestanden op; de analyse wordt vervolgens uitgevoerd met flowcytometrie-software zoals CellQuest of FlowJo. Hier is het resultaat van een IP FCM-analyse van muis T-cel LY in 1% digitonin. Het TCR CD3-niet-eiwitcomplex is neergeslagen met anti-CD3-epsilonbeads.De gevangen complexen bevatten aanzienlijke hoeveelheden TCR bèta en geassocieerde CD3 epsilon. Er werden niveaus van andere eiwitten gedetecteerd die dicht bij de achtergrondwaarden lagen, bepaald met behulp van een irrelevante immunoglobuline-probe of antilichamen tegen de eiwitten TH 1.2, CD 45 of H2-KD. De voordelen van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals immunoprecipitatie gevolgd door western blotting, is dat I-P-F-C-M het mogelijk maakt om native eiwit-eiwitinteracties te beoordelen zonder dat genetische modificatie of grote monstergroottes nodig zijn. I-P-F-C-M kan hoge signaal-ruisverhoudingen opleveren, zelfs wanneer er zeer weinig biomateriaal beschikbaar is voor analyse, aangezien het kan worden uitgevoerd met kleine volumes en lage concentraties analyten.

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate a flow cytometry-based technique to determine the proportion of cytokine-induced killer T-cells, CIK cells, expanded from a peripheral blood mononuclear cell culture.

CD Marker Recognition of Human Cytokine-Induced Killer Cells by Flow Cytometry

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.

Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic

Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.

Een op flowcytometrie gebaseerde high-throughput techniek voor het screenen van integrineremmende geneesmiddelen

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Het identificeren van microglia (MG) en perifere infiltrerende macrofagen (Mø) in beschadigde ruggenmerg is moeilijk. In dit protocol werd flowcytometrie (FCM) gebruikt om respectievelijk M1-achtige MG, M2-achtige MG, M1-achtige Mø en M2-achtige Mø te identificeren. Deze technologie kan ook worden toegepast op andere ziekten van het centrale zenuwstelsel om de rol van MG en Mø te begrijpen.

Identificatie van microglia en perifere infiltrerende macrofagen in het beschadigde ruggenmerg met behulp van flowcytometrie

Leer de IP-FCM-methode voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties met behulp van immunoprecipitatie en flowcytometrie. Deze techniek werkt met kleine monsters zonder genetische modificatie.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Meer video's verkennen