Name: Het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Leer de dubbele labeltechniek voor immunohistochemie op Kaposi-sarcoomweefsel om virale en gastheercelleiwitten te visualiseren. Deze methode helpt bij het identificeren van ontregelde genen voor nieuwe therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken James EK Hildreth, Meharry Medical College, voor zijn advies en toetsing van dit manuscript. We danken ook Diana Marver voor het bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Meharry Vanderbilt Center for AIDS Research (NIH subsidie ​​P30 AI054999-05), het Centrum voor aids-Health Research verschillen, NIH subsidie ​​5U54 RR019192-05, de Meharry Centrum voor Klinisch Onderzoek, NIH Grant P20RR011792, en door de NIH subsidie ​​P01 CA113239. DJA werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de piloot Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) en de Meharry Center for Clinical Research (CRC).

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

De methodieken die in dit rapport kan worden uitgevoerd in een verscheidenheid van laboratorium-instellingen. Ze vereisen een speciale uitrusting of toegang tot de belangrijkste voorzieningen. De juiste voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het doen van experimenten met besmettelijke virale ziekteverwekkers zoals KSHV die het gebruik van een biosaftey niveau 3 (BSL-3) voorzieningen nodig hebben. Tissue acquisities moet ook worden goedgekeurd door de bevoegde institutionele herziening boards (IRB&#39;s). <p ...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 medium</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ bullet kits supplement </td></tr><tr><td>DMVEC-cellen (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal kalfsserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kamerslides</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>KSHV LANA Mab</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50 verdunning/IFA</td></tr><tr><td>Galectine-3 geit pAb</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>Ezel-anti-geit FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>Ezel-anti-geit Rho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100 verdunning/IFA</td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield met DAPI</td></tr><tr><td>BCA-eiwitassaykit</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose </td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>Ezel-anti-geit-conj. </td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Western-substraat</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-konijn-anti-geit</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>AP-Streptavidine conj.</td><td>Dako</td><td>K 0492 (kit)</td><td></td></tr><tr><td>RNase DNase Free Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>Bio-fotometer</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>RC 6 Plus centrifuge</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Optima L-90K ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>MYiQ iCycler Real Time PCR detectiesysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>TE 2000S fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (kshv)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Op dit moment KS is de meest overheersende hiv / aids gerelateerde maligniteit in Zuidelijk Afrika en vandaar de wereld. 1,2 wordt gekenmerkt als een angioproliferative tumor van de vasculaire endotheliale cellen en produceert zeldzame B-cel lymfoproliferatieve ziekten in de vorm van pleurale effusie lymfomen (PEL) en sommige vormen van de ziekte van multicentrische Castleman. 3-5 Slechts 1-5% van de cellen in de KS-laesies actief ondersteunen lytische replicatie van Kaposi-geassocieerde Kaposi&#39;s herpesvirus (KSHV), het etiologische agens geassocieerd met KS, en het is duidelijk dat de cellulaire factoren die moeten interactie met virale factoren in het proces van oncogenese en tumorprogressie. 6,7 identificeren van nieuwe host-factor determinanten die bijdragen tot KS pathologie is essentieel voor het ontwikkelen van prognostische markers voor tumorprogressie en metastase en voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van KS . 8 De bijbehorende video beschrijft de methoden die we gebruiken om de gastheercel genexpressie-programma&#39;s gewijzigd dermale microvasculaire endotheelcellen (DMVEC) na KSHV infectie en in KS tumorweefsel te identificeren. negen eenmaal ontregelde genen zijn geïdentificeerd door middel van microarray analyse, veranderingen in eiwitexpressie zijn bevestigd door immunoblot en dubbele gelabeld immunofluorescentie. Veranderingen in de transcriptionele expressie van ontregelde genen worden bevestigd in vitro met behulp van kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validatie van in vitro bevindingen met behulp van archiefmateriaal KS tumorweefsel wordt ook uitgevoerd door dubbele gelabeld immunochemie en weefsel microarrays. 8,10 Onze benadering van het identificeren van ontregelde genen in de KS tumorweefsel micro-omgeving zal de ontwikkeling van in vitro en vervolgens in vivo model voor ontdekking en de evaluatie van potentiële nieuwe therapeutische voor de behandeling van KS.

Gastheercel factoren spelen een cruciale rol in het opzetten en onderhouden van Kaposi-sarcoom (KS). Schetsen we methoden om de gastheercel factoren veranderd bij KSHV-geïnfecteerde cellen te identificeren DMVEC, en in de KS tumorweefsel. Cellulaire genen veranderd door virus zal dienen als potentieel doelwit (s) voor nieuwe therapieën.

Het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)

Momenteel is KS de meest voorkomende HIV/aids-gerelateerde maligniteit in Zuidelijk Afrika en daarmee in de wereld.1,2 Het wordt gekenmerkt als een angioproliferatieve ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de dubbele labeling van Kaposi-sarcoma tumorweefsel middels immunohistochemie voor virale en gastheercelproteïnen. Dit wordt bereikt door eerst antigenen bloot te leggen met behulp van hitte. De tweede stap van de procedure is de applicatie van een primair antilichaam geconjugeerd aan biotine.De derde stap van de procedure is de toevoeging van het strep din enzymconjugaat. De laatste stap van de procedure is de toevoeging van het enzymsubstraat aan het weefsel voor de kleurontwikkeling. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de lokalisatie van zowel virale als gastheercelproteïnen in het tumorweefsel aantonen via immunohistochemische kleuring.Deze methode kan belangrijke vragen in het veld van de pathologie beantwoorden, zoals het identificeren van infectieuze agentia evenals gedisreguleerde cellulaire genen in hetzelfde monster. Plaats onder een zuurkast tot acht coupes met 5 µm secties van gefixeerd in paraffine ingebed weefsel in een Coplan-pot met xyleen. Incubeer gedurende 10 minuten om te deparaffineren en de coupes voor dubbel gelabelde immunohistochemie voor te bereiden.Rehydrateer het weefsel in een oplopende reeks ethanoloplossingen van 100%, 95% en 70% gedurende elk vijf minuten. Plaats de objectglazen voor ten minste 10 minuten in water voorafgaand aan het ontmaskeren van antigenen, ook wel bekend als antigeenherstel. Dompel de objectglazen onder in een plastic bak met vers bereide oplossing van 95 °C.Verhit 50 millimolair citraatbuffer in een magnetron om het kookpunt van 95 °C gedurende 15 minuten te handhaven. Verplaats de coupes onmiddellijk naar een coplan-bak gevuld met gedestilleerd water op kamertemperatuur. Verplaats de coupes vervolgens naar een schone coplan-bak gevuld met vers bereide quenchingsoplossing.Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om de endogene peroxidase te blokkeren. Was drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met 1x PBS bij kamertemperatuur. Neem de coupes uit het PBS-bad en schud het teveel eraf; bedek het weefsel met 200 µL ijskoude blokkeringsoplossing en dek dit af met een strook paraffine om uitdroging te voorkomen.Plaats de coupes in een bevochtigingskamer en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder de paraffineband en schud overtollige blokkeeroplossing van de coupe. Voeg 50 tot 100 µL ijskoude primaire antilichaam tegen KSHV Lana, verdund in blokkeerbuffer, toe om het weefsel te bedekken. Dek het weefsel opnieuw af met een schone paraffineband en incubeer in de bevochtigingskamer gedurende één tot twee uur.Was de objectglazen drie keer gedurende vijf minuten in 1x PBS. Voeg bij elke wasbeurt 50 tot 100 µL biotinylated secundair antilichaam toe, verdund in 1x PBS, en incubeer dit in de bevochtigingskamer bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 45 minuten. Terwijl de objectglazen incuberen, wordt de peroxidase-geconjugeerde streptavidine voorbereid.Voeg met de daco animation duet kit 10 µL oplossing A toe aan 1 mL 1X PBS in een 1,5 mL Eppendorf-buis en vortexeer om te mengen. Voeg 10 µL oplossing B toe, vortexeer opnieuw en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de objectglazen 3 keer met 1X PBS, telkens gedurende vijf minuten per wasbeurt.Voeg, zoals voorheen, 100 tot 200 µL mierikswortelperoxidase-geconjugeerde streptavidine toe aan de objectglazen. Incubeer gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur in de bevochtigingskamer. Was de objectglazen vervolgens opnieuw drie keer met 1x PBS, vijf minuten per wasbeurt.Laat vijf minuten voor het einde van het wassen één DAB-tablet vallen in een conische buis van 50 milliliter met 20 milliliter 1x PBS en 25 microliters 3% waterstofperoxide. Filtreer de DAB-oplossing door een spuitfilter van 0,45 micrometer, waarbij per keer één objectglas wordt bewerkt. Bedek het weefsel met één milliliter DAB-oplossing onder brightfield-verlichting op een lichtmicroscoop.Monitor de kleurontwikkeling voor KSHV Lana in geïnfecteerde cellen tot de gewenste kleurintensiteit is bereikt. Dompel de objectglazen vijf minuten onder in gedestilleerd water om de reactie voor dubbele kleuring te stoppen. Begin opnieuw met het ontmaskeren van antigenen in citraatbuffer bij 95 °C, zoals beschreven in de begeleidende tekst, en kleur vervolgens.Gebruik dezelfde procedure om het weefsel te monteren met per mount monteermedium en dek dit af met een dekglas voor beeldvorming onder helderveldverlichting. Het is vaak wenselijk om veel individuele monsters, ingebed in paraffineblokken, te verzenden om deze uit te stansen en te rangschikken in een weefselmicroarray voor verdere statistische analyse. Bruine cellen die positief zijn voor het cellulaire eiwit pcam one CD 31, aangegeven met een grijze pijl, clusteren rond de bloedvaten.Rode cellen die positief zijn voor het virale eiwit. Lana, aangegeven met zwarte pijlen, duidt cellen aan die geïnfecteerd zijn met het herpesvirus geassocieerd met kaposisarcoma. Hier is een lagere vergroting van bruine cellen die positief zijn voor het cellulaire eiwit pcam.CD 31 wordt aangegeven met grijze pijlen in een gebied rond de bloedvaten. Rode cellen zijn positief voor het virale eiwit. Lana, gemarkeerd met een zwarte pijl, geeft cellen aan die geïnfecteerd zijn met het herpesvirus geassocieerd met het sarcoom van Kaposi.Hier is een KS-tumorgeweefselbiopsie op een tumorweefsel-microarray; bruine cellen zijn positief voor viraal eiwit. Lana wijst cellen aan die geïnfecteerd zijn met het Kaposi-sarcoma-geassocieerde herpesvirus en die enige spoelvormige celvorming vertonen. Hier is een andere KS-tumorgeweefselbiopsie op een tumorweefsel-microarray; bruine cellen zijn positief voor viraal eiwit.Lana duidt cellen aan die geïnfecteerd zijn met het kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus met een hoge mate van spoelvormige celvorming. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dubbele label immunohistochemie uitvoert op formaline-gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel. Tijdens het uitvoeren van dit experiment is het zeer belangrijk om de kleurontwikkeling onder de microscoop te volgen en de reactie te stoppen met water.

identifying-dysregulated-genes-induced-kaposi-s-sarcoma-associated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Werkwijze voor het observeren individuele DNA-moleculen in levende cellen beschreven. De techniek is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lac repressor eiwit bindingsplaatsen ontworpen in het DNA van belang. Deze methode kan worden aangepast aan vele recombinant DNA volgen in levende cellen in de tijd.

Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in...

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Kaposi sarcoom (KS) is een tumor die is veroorzaakt door infectie met de oncogene virus Humaan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). De endothelial cell cultuur model hier beschreven is uniek geschikt voor de studie van de mechanismen waarmee KSHV gastheer cellen transformeert.

Een In Vitro Model voor het bestuderen van cellulaire transformatie door Kaposi sarcoom Herpesvirus

Virale transcriptionele fabrieken zijn discrete structuren die zijn verrijkt met cellulaire RNA polymerase II te verhogen van virale gen transcriptie tijdens reactivering. Hier, wordt een methode om te vinden sites van actief het transcriberen van virale chromatine in 3D-nucleaire ruimte door een combinatie van immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie van RNA beschreven.

Functionele beeldvorming van virale transcriptie fabrieken met behulp van 3D fluorescentie microscopie

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

We beschrijven een protocol met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) om meerdere herpes virale Rna's binnen lytisch geïnfecteerde menselijke cellen te visualiseren, hetzij in suspensie of aanhanger. Dit protocol omvat de kwantificering van fluorescentie die een nucleocytoplasmische verhouding produceert en kan worden uitgebreid voor gelijktijdige visualisatie van gastheer en virale eiwitten met immunofluorescentie (IF).

Kwantitatieve fluorescentie in situ-hybridisatie (vis) en immunofluorescentie (indien) van specifieke genproducten in KSHV-geïnfecteerde cellen

Dit protocol beschrijft een in vitro systeem om de novo lytische infectie van Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus te modelleren met behulp van BAC16-afgeleide virionen. De methode maakt onderzoek mogelijk naar vroege virale replicatie en verspreiding. De productie van infectieuze virussen wordt gekwantificeerd door op GFP gebaseerde tests van infectieuze eenheden en real-time PCR van ingekapselde virale genomen.

Vaststelling en kwantificering van de novo lytische infectie door celvrij Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus

Leer de dubbele labeltechniek voor immunohistochemie op Kaposi-sarcoomweefsel om virale en gastheercelleiwitten te visualiseren. Deze methode helpt bij het identificeren van ontregelde genen voor nieuwe therapeutische strategieën.

Het identificeren van ontregelde genen geïnduceerd door Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)

Meer video's verkennen