Name: In situ Protocol voor Butterfly Wings popstadium gebruik riboprobes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Leer een geoptimaliseerd in situ-hybridisatieprotocol met riboprobes voor genexpressieanalyse in popvleugels van Bicyclus anynana. Deze methode biedt richtlijnen voor aanpassing aan andere Lepidoptera-soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche technische ondersteuning voor hulp bij het oplossen van dit protocol. We danken ook William Piel voor advies over het bewerken van de film.

DAG 1 <ol><li> Bereid de volgende oplossingen: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> DDH 2 O <ul><li> Voeg DEPC voor 0,1% van het totaal volume en krachtig schudden oplossingen. </li><li> Autoclaaf. </li></ul></li><li> 4% Paraformaldehyde Fix - met behulp van PBS-DEPC </li><li> Proteinase K oplossing - als neerslag aanwezig is, vortex krachtig voordat u aliquot </li><li> Spijsvertering Stop Buffer </li><li> Prehybridisatie Buffer </li><li> 50:50 PBT: prehybridisatie Buffer </li><li> Hybridisatiebuffer <ul><li> Oplossingen moeten worden gehouden RNase-vrij. Gebruik een glas-ware dat is gebakken (4 uur bij 250 ° C) of wegwerp plastic. Serologisch pipetten zijn zeer nuttig voor het maken van up oplossingen </li></ul></li></ul></li><li> Ontleden vleugels van tijd-geënsceneerd poppen in PBS </li><li> Direct naar vleugels Buffer Fix in putjes van 24 en cultuur plaat bij kamertemperatuur </li><li> Fix schijven voor 2 uur </li><li> Was 5 x 5 minuten in PBT </li><li> Incubeer vleugels gedurende 3 minuten in proteïnase K-oplossing </li><li> Spoel 2 x in spijsvertering Stop Buffer </li><li> Was 5 x 5 minuten in PBT </li><li> Was 2 x 5 minuten in 50:50 PBT: PHB </li><li> Was 1 x 10 minuten in de PHB </li><li> Incubeer in PHB minstens 1 uur bij 55 ° C. </li><li> Warmte-denatureren RNA probe (20-50ng nodig per well) (80 ° C gedurende 5 minuten) en toe te voegen aan hybridisatiebuffer (100 ul nodig per well) </li><li> Voeg sonde naar putten en incubeer 48 uur bij 55 ° C </li></ol> DAG 3 <ol><li> Was 4 x 5 minuten in 55 ° C PHB </li><li> Incubeer overnacht in PHB bij 55 ° C </li></ol> DAG 4 <ol><li> Bereid de volgende oplossingen: <ul><li> Antilichaam Block Buffer </li></ul></li><li> Was een x 5 minuten in 50:50 PBT: PHB </li><li> Was 4 x 5 minuten in PBT </li><li> Incubeer vleugels voor een uur in Block buffer bij 4 ° C </li><li> Incubeer vleugels in een 1:2000 verdunning van anti-Dig antilichaam overnacht bij 4 ° C </li></ol> DAG 5 <ol><li> Bereid volgende oplossingen: <ul><li> Detectie Buffer </li></ul><ul><li> Het ontwikkelen van Solution - gevoelig voor licht (wikkel in folie) </li></ul></li><li> Was 3 x 5 minuten in PBT bij kamertemperatuur </li><li> Was 7 x 5 minuten in PBT </li><li> Spoel vleugels twee keer in Detection Buffer </li><li> De ontwikkeling van vleugels in 1 ml van de ontwikkelingslanden Oplossing - tijd van ontwikkeling moet worden gecontroleerd iedere keer - het ontwikkelen van tijden kan veranderen, zelfs bij gebruik van dezelfde sondes en het ontwikkelen van oplossingen - over het algemeen check na 5-10 minuten en vervolgens te verhogen intervallen tot &#39;s nachts. Plaat moet worden verpakt in folie aan het licht blootstelling te voorkomen wanneer het niet controleren van monsters. </li><li> Spoel vijf keer in ontwikkelingslanden Stop Buffer </li><li> Mount vleugels. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Optimalisatie van bestaande protocollen In situ hybridizaties op larvale vleugel schijven zijn met succes uitgevoerd met behulp van schijven van Precis coenia vlinders (Carroll et al., 1994;. Keys et al. 1999;. Weatherbee et al. 1999.). Het huidige protocol is een aangepaste versie van een schriftelijk en gedetailleerd protocol beschikbaar op verzoek van de Carroll Lab de larven vleugel kleuringen. De veranderingen die we dienen om de verschillen tussen larvale en popstadium vleugel weefsels tegemoet te komen. Tijdens pupal hindwing...

<table><tbody><tr><td>Fixatiebuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>4% paraformaldehyde in PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1% Tween 20 in PBS</td></tr><tr><td>Proteinase K-oplossing</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml Proteinase K in PBT</td></tr><tr><td>Digestie-stopbuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml glycine in PBT</td></tr><tr><td>Pre-hybridisatiebuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>Voor 50 ml PHB: 12 ml DEPC-behandeld water + 25 ml formamide + 12,5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml zalmsperm (Rnase-vrij, hitte-gedenatureerd vóór toevoeging aan de oplossing).</td></tr><tr><td>Hybridisatiebuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>Voeg 1 mg/ml glycogeen toe aan de pre-hybridisatiebuffer</td></tr><tr><td>Blokkeringsbuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>GECONJUGEERD aan alkalische fosfatase</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Monteermedium</td></tr></tbody></table>

in situ protocol voor butterfly wings popstadium gebruik riboprobes

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Hier presenteren wij, in video-formaat, een protocol voor het in situ hybridisaties in popstadium vleugels van de vlinder Bicyclus anynana met behulp van riboprobes. In situ hybridisaties, een steunpilaar van de ontwikkelingsbiologie, zijn nuttig om de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie studie in de ontwikkeling van weefsels op het niveau van transcriptie. Als antilichamen die het eiwit producten van gentranscriptie doelgroep zijn nog niet ontwikkeld en / of er meerdere genen exemplaren van een bepaald eiwit in het genoom die niet kan worden gedifferentieerd gebruik van beschikbare antilichamen, kan in situs plaats daarvan worden gebruikt. Terwijl de een in-situ techniek voor de larven vleugel disks beschikbaar is geweest voor de vlinder community voor meerdere jaren, heeft het huidige protocol is geoptimaliseerd voor de grotere en meer kwetsbare popstadium vleugels.

Om genexpressie te onderzoeken in het popstadium vleugel weefsel van Bicyclus anynana, presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor in-situ hybridisaties met behulp van riboprobes. We bieden ook richtlijnen voor de verdere optimalisatie van dit protocol voor het gebruik in popstadium vleugels van andere lepidoptera soorten.

In situ Protocol voor Butterfly Wings popstadium gebruik riboprobes

Hier presenteren wij, in videoformaat, een protocol voor in situ hybridisaties in popvleugels van de vlinder Bicyclus anynana met behulp van riboprobes. In situ ...

Dit is een ceto-protocol voor vlindervleugels in het pupestadium. We beginnen met het verzamelen van prepupa's uit de kooi, plaatsen deze op een plateau en fotograferen vervolgens hun exacte PPU-patiënttijden met behulp van time-lapsefotografie. Hierdoor kunnen we de kleuringen op precieze tijdstippen na de verpopping uitvoeren.Dit is belangrijk omdat verschillende mRNA's voor verschillende eiwitten op verschillende tijdstippen na de bevruchting tot expressie komen. Hier ontleden we de vleugels van de pop in een Petrischaal met een siliconen basis, en het cruciale onderdeel is om de vleugels te verwijderen en in de fixeeroplossing te plaatsen zodat ze zeer vlak liggen. Als ze in dit stadium niet vlak liggen, zullen ze nooit meer vlak worden.Na de juiste fixatietijd verwijderen we de fixatiebuffer en wassen we vijf keer. Bij PBT is de stap met proteinase K vrij kritisch en wordt deze gebruikt om de weefsels te permeabiliseren zodat de probe kan binnendringen; dit moet op het juiste moment worden gestopt met deze spoelingen en wassingen. Het zalmsperma dient als een goedkope DNA-bron om te voorkomen dat de probe overal bindt.Sperma is een van de componenten van de prehybridisatiebuffer. Hier voegen we het sperma toe aan de prehybridisatiebuffer, waardoor een oplossing ontstaat die bestaat uit 50% PBT en 50% prehybridisatiebuffer. Deze oplossing wordt gebruikt als tussenoplossing om de vleugels voorzichtig over te brengen van de PBT-oplossing, waarin ze zijn geweekt, naar de prehybridisatie-oplossing.Er is dus een tussenstap waarbij de vleugels in eerste instantie in deze 50 50-oplossing worden geplaatst. Hier worden de vleugels gedurende 10 minuten geïncubeerd in PHP, en vervolgens opnieuw gedurende één uur bij 55 °C in PHP. Ondertussen bereiden we de hybridisatiebuffer, wat simpelweg pre-hybridisatiebuffer is gemengd met glycogeen.Hier voegen we glycogen toe aan PHV om een kleine hoeveelheid hybridisatiebuffer te maken. Aan deze buffer gaan we de gedenatureerde probe toevoegen. We warmen een warmteblok op en centrifugeren de probe die bij -20 °C is bewaard, waarna we precies de juiste hoeveelheid probe overbrengen naar een Eppendorfbuisje om deze ongeveer vijf minuten lang bij 80 °C te denatureren. In dit geval denatureren we twee probes gelijktijdig; we voegen hybridisatiebuffer toe aan de probe en voegen vervolgens 100 µL van het probemengsel toe aan elke well.Om deze stap af te ronden, dekken we alle putjes af met Parafilm, omdat de vleugels de komende twee dagen bij 55 °C worden geïncubeerd en de Parafilm verdamping voorkomt. Na twee dagen incubatie wordt de probe verwijderd door de vleugels te wassen met PBS, waarbij de laatste wasbeurt nog 12 tot 24 uur op de vleugels blijft. Ten slotte worden de vleugels via een reeks stappen gewassen om ze terug te brengen naar de PBT-oplossing, waarbij opnieuw tussentijds de 50:50 mengoplossing wordt gebruikt.In deze fase wordt de antilichaam-blokkeringsoplossing aan de vleugels toegevoegd en wordt het anti-dig-antilichaam, geconjugeerd aan alkalische fosfatase, toegevoegd aan PBT om een concentratie van ongeveer 1:2000 te verkrijgen. Ongeveer 300 µL van deze antilichaamoplossing wordt aan elke put toegevoegd, waarna de vleugels in de koelkast worden geplaatst voor incubatie in het antilichaam gedurende de nacht. De volgende dag wordt het antilichaam verwijderd door een reeks wasstappen met PBT, waarna de vleugels twee keer worden gespoeld in de detectiebuffer bij kamertemperatuur.Ten slotte wordt één ml ontwikkelingsoplossing aan elke put toegevoegd en worden de vleugels snel afgedekt met aluminiumfolie. Na ongeveer 10 minuten controleren we de vleugels; deze beginnen paars te kleuren, maar zijn nog wat licht. Daarom worden ze opnieuw afgedekt, en enkele minuten later controleren we opnieuw en zijn ze iets donkerder geworden.Merk op dat vleugels die in verschillende probes zijn geïncubeerd, met enigszins verschillende snelheden leken te verdonkeren, dus besluiten we ze opnieuw te bedekken en uiteindelijk, 20 minuten later, besluiten we de reactie te stoppen met de development stop buffer. De vleugels zijn nu klaar om op een objectglas te worden gemonteerd, dus we voegen een klein druppeltje monteermedium toe aan een gelabeld objectglas en verplaatsen de vleugels naar het glas door ze simpelweg met een pincet op te pakken en op de druppel te plaatsen. Verwijder eventuele luchtbellen, strijk de vleugel voorzichtig glad en dek deze af met een dekglas.In dit experiment gebruiken we de probe die zich richt op grail-gentranscripten, en we zien dat deze gelokaliseerd zijn in het centrum van het toekomstige IPO-patroon van de vlinder Bicyclus anynana tijdens de vroege stadia van de vleugelontwikkeling van de pop.

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

We beschrijven hier een efficiënte high...

Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Door het combineren van methoden voor RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

Het Xenopus laevis-embryo blijft uiterst nuttig in de studie van vroege ontwikkeling vanwege zijn grote omvang en gemakkelijke manipulatie.   Er wordt een vereenvoudigd protocol voor volledige montage in situ hybridisatie gegeven dat kan worden gebruikt bij de identificatie van specifieke organen in dit modelsysteem.

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).

Een snelle en doeltreffende methode om te ontleden pop vleugels van Drosophila geschikt voor Immunodetections of PCR-testen

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Dit protocol beschrijft een effectieve in situ hybridisatie benadering om de mRNA expressie niveaus en ruimtelijke patronen van doelgenen in Sipunculus nudus coelomic vloeistof te detecteren.

In situ Hybridisatie voor Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Leer een geoptimaliseerd in situ-hybridisatieprotocol met riboprobes voor genexpressieanalyse in popvleugels van Bicyclus anynana. Deze methode biedt richtlijnen voor aanpassing aan andere Lepidoptera-soorten.

In situ Protocol voor Butterfly Wings popstadium gebruik riboprobes

Meer video's verkennen