Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Deze video demonstreert een procedure voor het uitvoeren van differentiële beeldvorming van twee Raman-resonanties die geassocieerd zijn met biologische structuren met coherente Raman-verstrooiingssignalen. Allereerst worden drie gesynchroniseerde kortpulslasers in tijd en ruimte over elkaar heen gelegd. De overlappende pulsen worden vervolgens naar een standaard omgekeerde microscoop gestuurd, waardoor de generatie van coherente Raman-signalen vanuit microscopische objecten mogelijk wordt.

Signalen worden omgezet in beelden met behulp van commerciële software om de verschillende geproduceerde ramen-signalen te vergelijken. De resultaten geven aan dat het verschil tussen beelden verkregen uit dubbel- en enkel-resonante ramen-signalen zorgt voor een verhoogde gevoeligheid voor zwakke ramen-signalen. Hoi, ik ben Tyler Weeks van het Center for Bio Photonics aan de University of California Davis.

Ik ben Thomas ER van het Center for Bio Photonics en de afdeling Interne Geneeskunde aan de University of California Davis. Vandaag laten we u een procedure zien voor het gebruik van dubbel resonante coherente antis-Stokes Raman-verstrooiing voor het produceren van chemisch specifieke beelden van cellen. We gebruiken deze procedure om signalen te detecteren van moleculen die te zwak zijn om direct via coherente antis-Stokes Raman-spectroscopie alleen te worden gedetecteerd.

Laten we beginnen. Om CARS- en Dr-CARS-signalen gelijktijdig te genereren, zijn drie instelbare en gesynchroniseerde kortpulslaserbronnen vereist om deze gesynchroniseerde pulsen te verkrijgen. Begin met een enkele kortpulslaser met een uitgangsvermogen van 10 watts, een vaste golflengte van 1064 nanometers, een vaste pulslengte van zeven picoseconden en een vaste herhalingssnelheid van 76 megahertz.

Met behulp van een reeks halve-golfplaten en polariserende beamsplitterkubussen wordt de bundel in drie delen gesplitst. Een halve-golfplaat in combinatie met een polariserende beamsplitterkubus maakt het mogelijk om de hoeveelheid vermogen in elk onderdeel van de bundel aan te passen zonder de richting ervan te veranderen. Gewoonlijk worden twee bundels ingesteld op ongeveer 4,5 watt elk, en bevat de derde bundel het resterende ene watt.

De twee hoogvermogensstralen worden vervolgens geleid naar twee onafhankelijke optische parametrische oscillatoren of OPO's. OPO's maken gebruik van frequentiegeneratie om een foton met hoge energie om te zetten in twee fotonen met een lagere energie en verschillende golflengten. Door de temperatuur van het kristal dat voor dit effect wordt gebruikt te regelen, kunnen de golflengten van de resulterende fotonen met een nauwkeurigheid van 0,1 nanometer worden beheerst.

Door deze signalen in frequentie te verdubbelen, kan een laser met een vaste golflengte van 1064 nanometer nu worden omgevormd tot een laserstraal die overal tussen 780 nanometer en 910 nanometer kan worden afgestemd door twee afzonderlijke OPO's te pompen met dezelfde 1064 nanometer bron. Er worden twee onafhankelijk afstembare laserbronnen verkregen die automatisch gesynchroniseerd zijn met onze oorspronkelijke pomplaser. De derde straal van de 1064 nanometer pomplaser wordt door een combinatie van diëlektrische spiegels rond de OPO's geleid, zodat alle drie de stralen later kunnen worden gecombineerd.

Om efficiënt coherente ramen-signaalfotonen te produceren, moeten de gecombineerde pulsen zowel temporeel als ruimtelijk overlappen, omdat OPO's ringcaviteiten bevatten waardoor elke laserpuls meerdere keren door het kristal gaat; de bundel die door de OPO's wordt gestuurd, legt een extra afstand af, wat resulteert in een aanzienlijke vertraging ten opzichte van de oorspronkelijke pompbundel. Deze afstand moet worden gecompenseerd met een derde bundel door extra spiegels te introduceren die deze bundel dwingen dezelfde afstand af te leggen als de andere twee voordat ze met dichroïsche spiegels worden gecombineerd om een nauwkeurige afstelling van de weglengte mogelijk te maken. Elke bundel wordt door instelbare vertragingsstations gestuurd, waarmee de temporele overlap van de verschillende laserpulsen kan worden aangepast.

Een andere set halve-golfplaten en polariserende beamsplitterkubussen wordt aan elke straal toegevoegd om de laserintensiteit van elke straal onafhankelijk aan te passen. Dichroïsche spiegels worden gebruikt om eerst de stralen van de twee OPO's te combineren, en vervolgens de 1064 nanometer straal; er moet nauwkeurig worden toegezien op een exacte ruimtelijke overlap van de stralen. Dit kan worden geverifieerd door de overlap van de stralen op enkele centimeters afstand van de dichroïsche spiegel te vergelijken met de overlap op ongeveer één meter afstand van de dichroïsche spiegel.

Omdat blootstelling aan laserstralen met een hoog gemiddeld vermogen het monster kan beschadigen, worden de drie gecombineerde stralen door een elektro-optische modulator gestuurd die fungeert als een pulse picker. Hiermee kan de herhalingssnelheid van de pulsen die het monster bereiken, en daarmee het gemiddelde vermogen, worden aangepast. De gecombineerde laserstralen worden vervolgens gekoppeld aan een omgekeerde microscoop met een objectief met een hoge numerieke apertuur of na. De sterke focussering die wordt gegenereerd door het objectief met hoge NA maakt de meest efficiënte generatie van coherente ramen-signalen op microscopische lengteschalen mogelijk.

Het objectief van de microscoop is gemonteerd op een X, Y, Z piëzo-traverse, waardoor beelden kunnen worden verkregen door de stralen via rasterscanning over het monster te bewegen, vergelijkbaar met commerciële beamscanning confocale microscopen. Laten we nu bekijken hoe CARS- en DRFM-signalen worden gegenereerd; de interactie van drie kortgepulseerde laserstralen in het monster resulteert in de generatie van verschillende four-wave mixing-signalen, zoals CARS uit diverse combinaties van twee lasers, evenals driekleurige CARS- en DR-CARS-signalen uit de combinatie van alle drie de lasers. Wanneer signalen relatief dicht bij elkaar liggen in golflengte, kan het moeilijk zijn om ze voor analyse te scheiden.

Om deze reden worden signalen doorgegeven aan een beeldspectrometer die tevens dient als monochromator of banddoorlaatfilter om signalen op verschillende golflengten ruimtelijk te scheiden. Een elektronisch aangestuurde kantelspiegel in de spectrometer stuurt het signaal in de verlaagde positie naar een back-illuminated deep depletion charge coupled device of CCD-camera, die spectroscopische informatie over het gehele signaalbereik verschaft en ons in staat stelt om de verschillende coherente robin-signalen te identificeren en te optimaliseren om het te beelden signaal te selecteren. Roteer simpelweg het rooster in de spectrometer met behulp van de door de leverancier meegeleverde besturings- en data-acquisitiesoftware om de piek van belang in het midden van de CCD-camera te centreren.

Wijzig vervolgens de positie van de kantelspiegel om het signaal om te leiden naar een tweede uitgangspoort waaraan een single photon counting avalanche photo DDE of een PD is bevestigd. Scan de objectieflens en gebruik vervolgens de op de A PD geregistreerde signalen om een beeld te genereren door de foton-teltelling voor elke pixel weer te geven met de software voor gegevensverwerving. Herhaal deze beeldgevingsprocedure voor elk gewenst coherent ramen-signaal, zodat signalen tijdens de nabewerking kunnen worden vergeleken.

Laten we nu bekijken hoe een monster correct wordt voorbereid om heldere, reproduceerbare beelden te verkrijgen. Bij de monstervoorbereiding moet zorgvuldig te werk worden gegaan. Monsters worden doorgaans voorbereid op glazen dekglasplaatjes met een dikte van ongeveer 150 micron.

Deze dekglasjes zijn dun genoeg om beeldvorming met een hoge resolutie mogelijk te maken met de water- of olie-immersie-objectieven met een hoge NA die in deze experimenten worden gebruikt. Om de bereiding van een typisch monster te demonstreren, bereiden we coupes van muisspierweefsel met een dikte van ongeveer 20 micron die op een microscoopglas zijn gefixeerd. Een druppel van 20 microliter van een vijf molar gedeutereerde glucoseloplossing wordt aan het monster toegevoegd.

De gedeutereerde glucose-oplossing zorgt voor een unieke en sterke Raman-achtergrondsignatuur. Een glazen dekglas wordt bovenop het monster geplaatst en met nagellak vastgezet voor cellen en culturen. Er kunnen kweekschalen met een glazen bodem worden gebruikt, waardoor beeldvorming mogelijk is zonder dat de cellen van hun kweekschalen hoeven te worden losgemaakt.

Laten we nu bekijken hoe de juiste Raman-pieken voor Dr cars bepaald kunnen worden. Om optimaal gebruik te maken van het dubbel resonante versterkingseffect, moeten de Raman-spectra van beide Raman-resonante stoffen bekend zijn. Typisch zijn dit 2845 cm⁻¹ geassocieerd met lipiden en 2121 cm⁻¹ voor de CD-strekmodus geassocieerd met de gedeutereerde glucose.

Coherente Ramanverstrooiing wordt bereikt wanneer het frequentieverschil tussen twee lasers overeenkomt met de frequentie van een moleculaire vibratie. Door één OPO af te stemmen op 817 nanometer, zal deze de C-modus van 2.845 inverse centimeter sonderen in combinatie met de 1064 nanometer laserstraal, en door de andere OPO af te stemmen op 868 nanometer, zal deze de 2.121 inverse centimeter sonderen in combinatie met de 1064 nanometer straal. In de spectroscopische modus stelt de CARS-microscoop ons in staat om drie coherente Raman-signalen van belang te observeren: een CARS-signaal dat de CH-strekvibratie sondeert, een CARS-signaal dat de CD-strekmodus sondeert, en een DR-CARS-signaal dat beide sondeert. In het hier getoonde diagram geven de gestreepte pijlen de fotonen van de laser in de OPO's aan en de ononderbroken pijlen het resulterende signaal.

De doorlopende horizontale lijnen geven de energie van de Raman-vibratie aan en bieden een visuele weergave dat in DR-experimenten het gelijktijdig mengen van dezelfde drie inputfotonen twee verschillende Raman-vibraties aanboort. De signaalsterkte voor elke piek moet worden geoptimaliseerd door in kleine stappen rond deze pieklocaties af te stemmen. Hier selecteren we elke piek en maken we beelden van sea elgan-wormen in een oplossing van gedegradeerde glucose; het extraheren van aanvullende informatie op basis van deze drie individueel verkregen beelden vereist een vrij eenvoudige beeldverwerking.

Ten eerste moeten de beelden worden genormaliseerd. Een praktische methode voor normalisatie is gebaseerd op het feit dat lipiden hydrofoob zijn. Dit betekent dat in regio's met een hoge lipidedichtheid de CD-resonantie van de glucose nauwelijks zou moeten bijdragen aan het dubbele resonantiesignaal.

Omgekeerd zouden in regio's met een pure glucoseoplossing de CH-resonanties van de lipiden eveneens zeer weinig moeten bijdragen. Met dit in gedachten normaliseert u de DR-curve-afbeelding en de curve-afbeelding verkregen op de CD-resonantie van de gedeutereerde glucoseoplossing naar een regio ver buiten de C. elegans-worm die geen CH-resonantie zou moeten vertonen. Identificeer vervolgens in de CH-resonante curve-afbeelding een regio binnen de worm die rijk is aan lipiden en normaliseer deze naar de overeenkomstige regio binnen de genormaliseerde DR-curve-afbeelding.

Om deze methode correct te laten werken, wordt ervan uitgegaan dat er diep in dit gebied geen gedeutereerd glucose aanwezig is. Dit is een veilige aanname, aangezien de lipiden hydrofoob zijn en niet zullen mengen met de oplossing. Door nu het genormaliseerde CH-resonante car-beeld af te trekken van het genormaliseerde DR-car-beeld, blijft alleen het versterkte CD-resonante signaal over; op soortgelijke wijze blijft het signaal over door het genormaliseerde CD-resonante car-beeld af te trekken van het genormaliseerde Dr.FWM-beeld.

Alleen het versterkte CH-resonantiesignaal blijft over; hier wordt het Raman-spectrum getoond voor een gemodificeerd oliezuur dat een alkynmodificatie bevat. De sterke CH-resonanties bij 2.845 cm⁻¹ en de alkynresonantie bij 2.121 cm⁻¹ zijn beide goed geïsoleerd van de vingerafdrukkegioen, de regio met dicht opeengepakte pieken, waardoor ze ideale markers zijn voor coherente Raman-imaging. Dit is een typisch spectrum van coherente Raman-signalen die worden gegenereerd wanneer drie kortpulslasers elkaar overlappen in het monster. De pijlen wijzen naar de processen die verantwoordelijk zijn voor elk signaal, zoals weergegeven in de energiediagrammen.

Dit zijn typische resultaten van beeldvorming van C Elgin's wormen met behulp van DR CARS en CARS. In de bovenste rij werden de drie zojuist getoonde signalen gebruikt om een worm in een oplossing van gedegradeerde glucose in beeld te brengen. In de tweede rij zijn de beelden op passende wijze genormaliseerd en in de derde rij zijn de differentiebeelden gegenereerd door elk van de CARS-beelden af te trekken van het DR CARS-beeld. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe Raman-differentiebeeldvorming kan worden uitgevoerd op basis van dubbel resonante coherente anti-Stokes Raman microscopie.

Houd bij het uitvoeren van deze procedure rekening met het volgende: het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de stralen correct overlappen en gesynchroniseerd zijn. Let er daarnaast op dat u het monster niet stoot of verplaatst bij het schakelen tussen verschillende coherente signalen, omdat dit de analyse zal beïnvloeden. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.