Name: Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Leer differentiële beeldvorming met dubbel-resonante CARS-microscopie voor biologische structuren. Deze methode gebruikt drie gesynchroniseerde lasers om zwakke Raman-signalen te detecteren en chemisch specifieke cellulaire beelden te produceren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Iwan Schie en Sebastian Wachsmann-Hogiu bedanken voor hun bijdragen in de ontwikkeling van de DR-CARS-techniek. Tyler Weken erkent steun van de Lawrence Scholar Program van Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser is dankbaar voor de steun van de American Heart Association door de Grant-in-Aid programma. Dit werk werd ook ondersteund voor een deel door de financiering van de National Science Foundation. Het Centrum voor Biofotonica, een NSF Wetenschap en Technologie Centrum, wordt beheerd door de Universiteit van California, Davis, onder Cooperative arbeidsovereenkomst nr. PHY 0120999. Support is tevens erkend door de UCD Clinical Translationeel Science Center onder te verlenen nummer UL1 RR024146 van het National Center for Research Resources (NCRR).

1. Generatie van auto's en DR-CARS Signalen Met het oog op CARS genereren en DR-CARS-signalen tegelijk, drie afstembare en gesynchroniseerd korte gepulste laser bronnen nodig zijn. <ol><li> Voor het verkrijgen van drie gesynchroniseerde pulsen we beginnen met een 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.) Deze laser heeft een vaste golflengte van 1064 nm, een vaste puls lengte van 7 ps, en een vaste herhalingsfrequentie van 76 MHz. </li><li> Met behulp van een reeks van half-wave platen en polariserende bundelsplitser kubussen de bundel is opgedeeld in drie delen. Een half-wave plaat in combinatie met een polariserende beam splitter kubus laat ons toe om de hoeveelheid stroom te passen in elk onderdeel van de bundel, zonder het veranderen van de richting. Meestal worden twee balken aangepast aan ~ 4,5 W per stuk, en de derde bundel bevat de overige 1 W. </li><li> De twee hoge vermogen bundels worden vervolgens in twee onafhankelijke optische parametrische oscillator (OPO's, Avante, APE GmbH, Berlijn, Duitsland). OPO's gebruik verschil frequentie van generatie op een hogere energie-foton om te zetten in twee lagere energie fotonen met verschillende golflengtes. Door het regelen van de temperatuur van het kristal gebruikt om dit effect te bereiken, kan de golflengten van de resulterende fotonen worden gecontroleerd om binnen 0,1 nm. Door de frequentie-verdubbeling van deze signalen, een laser met een vaste golflengte van 1064 nm kan nu omgezet in een laserstraal die overal kan worden afgestemd tussen 780 nm tot 910 nm. Door het pompen twee aparte OPO's met dezelfde 1064 nm bron, krijgen we twee onafhankelijk van elkaar afstembare laser bronnen die automatisch worden gesynchroniseerd met onze oorspronkelijke pomp laser. </li><li> De derde (laagste vermogen) straal van de 1064 nm pomp laser is gericht rond de OPO's door een combinatie van dichroïsche spiegels, zodat alle drie bundels (2 van de OPO, een van de pomp laser) kan later worden gerecombineerd. Om efficiënt coherent Raman-signaal fotonen produceren de gerecombineerde pulsen moeten zowel tijdelijk en ruimtelijk worden overlapt. Omdat de OPO's ring holtes bevatten, zodat iedere laserpuls om door het kristal meerdere keren, de balken gestuurd door te reizen van de OPO's een extra afstand resulteert in een aanzienlijke vertraging ten opzichte van de originele pomp balk. Deze afstand moet worden gecompenseerd met de derde bundel door de invoering van extra spiegels die kracht deze balk om dezelfde afstand als de andere twee reizen voordat ze worden opnieuw gecombineerd met dichroïsche spiegels. </li><li> Om de fijnafstelling van de lengte van het pad elke balk reist instelbare vertraging stadia, met behulp van prisma RETROFLECTOREN, worden ingevoerd in elke bundel pad op te geven. </li><li> Een andere reeks half-wave platen en polariserende bundelsplitser blokjes worden toegevoegd aan elke balk om ons in staat om de kracht van elke balk aan te passen zonder dat onafhankelijk van de input van de OPO's. </li><li> Dichroïsche spiegels worden gebruikt om eerst de balken combineren van de twee OPO's en dan met de 1064 nm balk. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de balken precies overlappen elkaar (dat wil zeggen ze zijn collineair en hebben vergelijkbare divergentie). Dit kan worden gecontroleerd door het vergelijken van de overlapping van de balken dicht bij de (binnen een paar centimeter) en ver van de (~ 1 m) de dichroïsche spiegel. </li><li> Het voordeel van het gebruik van gepulste lasers is dat elke puls kan een hoge piek energie hebben op het monster, waardoor een efficiënte genereren van coherente Raman signalen, met behoud van een lage gemiddelde intensiteit. Een hoge gemiddelde intensiteit kan schade aan de steekproef. Dus om verder de gemiddelde intensiteit van controle zonder in te boeten piek energie, zijn de drie gecombineerde balken verstuurd via een elektro-optische modulator (Pockel de cel, ConOptics) functioneren als een puls picker, die ons in staat te stellen de herhalingsfrequentie van de pulsen die komen op onze steekproef en dus de gemiddelde intensiteit. </li><li> De gecombineerde laserstralen worden vervolgens gekoppeld in een omgekeerde microscoop met een hoge NA doelstelling. Het doel is typisch een 60 X water objectief met een numerieke apertuur (NA) van 1,2 dat is voor chromatische aberratie gecorrigeerd in het bereik van tunability van onze OPO's en de 1064 nm balk. Het strakke focus gegenereerd door de hoge NA objectief zorgt voor de meest efficiënte generatie van coherente Raman signalen op de micron schaal. </li><li> De gecombineerde bundels worden uitgebreid om de back-poort van de microscoop objectief overvulling. Door overvulling de achterkant van de microscoop doelstelling die we kunnen bereiken de beste omstandigheden voor het scherpstellen en daarom de beste ruimtelijke resolutie in onze microscoop systeem. </li><li> Het objectief in onze microscoop is gemonteerd op een XYZ piezo fase die ons in staat stelt om beelden te verkrijgen door raster-het scannen van de balken over het monster, vergelijkbaar met commerciële beam-scanning confocale microscopen. </li></ol> 2. Het gebruik van drie korte gepulste lasers Het gebruik van drie korte gepulste lasers resulteert in de productie van verschillende CARS signalen, uit de verschillende combinations van twee lasers, evenals drie-kleuren CARS-en DR-FWM signalen uit de combinatie van alle drie lasers. <ol><li> De golflengte van de signalen kan spectraal liggen dicht bij elkaar. Als de signalen worden dicht bij elkaar kan het moeilijk zijn om ze te scheiden voor analyse met behulp van vaste golflengte bandpass filters en dichroïde spiegels. Om deze reden onze signalen worden doorgegeven aan een imaging spectrometer (SpectraPro 2300i, Acton Research), dat tevens dienst doet als een efficiënte monochromator om ruimtelijk afzonderlijke signalen bij verschillende golflengten. </li><li> Een elektronisch bediende flip spiegel in de spectrometer in de laagste positie stuurt het signaal naar een back-verlichte deep-uitputting charge-coupled device (CCD) camera die spectroscopische informatie geeft over het gehele bereik en signaal stelt ons in staat te identificeren en optimaliseren van de verschillende samenhangende Raman signalen. </li><li> Het selecteren van de signaal waarmee we willen beeld dat wij gewoon draaien het rooster in de spectrometer, met behulp van de leverancier geleverde en data-acquisitie software (WinSpec, Princeton Instruments), naar het centrum van de piek van de rente op de CCD-camera en wijzig de positie van de flip spiegel om dit signaal te leiden naar een tweede uitgang poort waarop een single-photon tellen lawine foto-diode (APD) is bijgevoegd. </li><li> Het objectief is dan raster-gescand en de signalen die op de APD worden gebruikt om een ​​beeld te genereren door het weergeven van de foton count-tarief voor elke pixel via data-acquisitie software (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlijn, Duitsland). </li><li> We herhalen deze beeldvorming procedure voor elke gewenste samenhangende Raman signaal dat ons in staat stelt om de signalen te vergelijken tijdens post-processing. </li></ol> 3. Monstervoorbereiding Met het oog op heldere, reproduceerbare beelden te verkrijgen enige voorzichtigheid moeten worden genomen bij de voorbereiding van het monster. <ol><li> Monsters zijn meestal opgesteld op ~ 150 micron dik glas dekglaasjes. Deze coverslips zijn dun genoeg om voor hoge resolutie imaging met de 1.2 NA doelstellingen die doorgaans worden gebruikt. </li><li> Optische vangen van diëlektrische objecten kan optreden wanneer de laser licht wordt afgebogen door kleine transparante objecten. Het gebruik van strak gericht, hoog piekvermogen, kan korte gepulste laserstralen sleep kleine cellen of bacteriën mee, wat resulteert in onscherpe of uitgesmeerd beelden. Om dit te voorkomen kan het noodzakelijk zijn om het monster immobiliseren op het oppervlak van het glas dekglaasje door eerst het aanbrengen van een dunne laag van poly-L-lysine door spin-coating. </li><li> Voor de cellen in de cultuur met glazen bodem cultuur gerechten kunnen worden gebruikt die het mogelijk maken voor de beeldvorming zonder de noodzaak om de cellen uit hun celcultuur groei gerechten los te maken. </li><li> Voor de demonstratie in deze bijdrage hebben we de eerste storting een formaldehyde-vaste C. elegans nematode worm op een glazen deksel slip. </li><li> Voeg vervolgens een 20 pi druppel van 5 M gedeutereerde glucose-oplossing voor de worm. De gedeutereerde glucose-oplossing biedt een unieke en sterke Raman achtergrond handtekening. </li></ol> 4. Voorbeeld Analyse Om goed te profiteren van de dubbel-resonante enhancement effect van de Raman-spectra van zowel Raman-resonante stoffen moeten bekend zijn. <ol><li> Nadat het monster is voorbereid op het dekglaasje wordt geanalyseerd met behulp van een confocale Raman microscoop naar de relevante spontane Raman-spectrum te verkrijgen en geschikt zijn pieken te identificeren. </li><li> Voor het uitvoeren van DR-CARS identificeren we de spectrale locaties van de CH stretch mode, meestal geassocieerd met lipiden, en de cd-stretch mode, in verband met de gedeutereerd glucose, te 2845 cm -1 en 2121 cm -1 respectievelijk. </li><li> Coherente Raman scattering wordt bereikt wanneer de frequentie verschil tussen twee lasers overeenkomt met de frequentie van een moleculaire vibratie. Door het afstemmen van een OPO tot 817 nm zal sonde de 2845 cm -1 CH-modus in combinatie met de 1064 nm laserstraal en door het afstemmen van de andere OPO tot 868 nm zal het de 2121 cm -1 piek sonde in combinatie met de 1064 nm straal . </li><li> Door raster-scanning van het monster op de auto's microscoop kunnen we nu waarnemen drie samenhangende Raman signalen van belang. Een CARS signaal sonderen van de CH rek vibratie, een CARS signaal sonderen van de cd-stretch mode en een DR-CARS signaal indringende beide. </li><li> Wij selecteren elke piek zoals beschreven in paragraaf 2.3 en maak een opname zoals hierboven beschreven. </li></ol> 5. Image Processing Extraheren van aanvullende informatie op basis van deze drie beelden nu vereist enige redelijk eenvoudig beeldverwerking. <ol><li> Eerst de beelden moeten worden genormaliseerd. In theorie normalisatie kan worden bereikt door goed voor de intensiteit van elke laser die betrokken zijn bij elk signaal generatie proces. In de praktijk blijkt dit niet altijd werken voornamelijk als gevolg van de niet-uniforme spectrale responsvan dichroïtische spiegels, detectoren, en roosters. </li><li> Een praktische methode voor normalisatie berust op het feit dat in regio's waar pure lipiden domineren het signaal, de cd-resonantie niet zou moeten bijdragen tot een van het signaal. Ook in gebieden van pure glucose-oplossing van de CH resonantie mag niet bij een van het signaal. Met dit in gedachten, hebben we normaliseren van de DR-CARS beeld en de CARS beeld verkregen op de cd resonantie van de gedeutereerde glucose-oplossing om een gebied ver buiten de C. elegans worm dat er geen CH resonantie te vertonen. </li><li> Vervolgens identificeren we een gebied binnen de worm in de CH-resonante CARS beeld dat rijk is aan lipiden en normaliseren aan de desbetreffende regio binnen de genormaliseerde DR-CARS beeld. Voor deze methode goed te laten werken we ervan uit dat diep van binnen dit gebied geen gedeutereerde glucose aanwezig is. Dit is een veilige aanname, omdat de lipiden zijn hydrofoob en zal niet mengen met de oplossing. </li><li> Nu, door het aftrekken van de genormaliseerde CH-resonante CARS afbeelding van de genormaliseerde DR-CARS beeld dat we blijven zitten met alleen de versterkte CD-resonantie-signaal. </li><li> Zo ook door het aftrekken van de genormaliseerde CD-resonante CARS afbeelding van de genormaliseerde DR-FWM beeld dat we blijven zitten met alleen de versterkte CH-resonantie signaal. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Diagram van de DR-CARS microscopie systeem zoals hierboven beschreven. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: Wit licht beeld van een C. elegans worm in gedeutereerd glucose-oplossing voorbereid op een glazen dekglaasje en klaar voor imaging. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3:. Raman spectrum van gemodificeerde oliezuur (een onverzadigd vetzuur) dat een alkyn modificatie (een koolstof-koolstof binding triple-groep) bestaat uit de sterke CH resonanties bij 2845 cm -1 en de alkyn resonantie bij 2100 cm -1 zijn beide goed geïsoleerd van de vingerafdruk regio (de regio van dicht op elkaar gepakte pieken), waardoor ze ideaal zijn markers voor een coherente Raman beeldvorming. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4:. Typische spectrum van samenhangende Raman signalen gegenereerd als drie korte-gepulste lasers met elkaar worden gecombineerd binnen de steekproef De pijlen wijzen naar de proces (sen) die verantwoordelijk is voor elk signaal zoals vertegenwoordigd door de energie-diagrammen. In de schema's hier getoonde gestippelde pijlen geven fotonen van de laser en de OPO's en solide pijlen geven de resulterende signaal. De solide horizontale lijnen geven de energie van de Raman trillingen en geven een visuele voorstelling dat in DR-CARS, het mengen van de drie dezelfde ingang fotonen tegelijk twee verschillende sondes Raman trillingen. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: Typische gevolgen van beeldvorming C. elegans wormen met behulp van de DR-auto's en auto. De bovenste rij gebruikte de drie signalen aangegeven in figuur 4 het imago van een worm in een oplossing van gedeutereerde glucose. In de tweede rij van de beelden waren voldoende genormaliseerd en in de derde rij het verschil beelden werden gemaakt door het aftrekken van elk van de CARS beelden uit de DR-CARS beeld.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
<li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+%28DR-FWM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li>
<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

Raman spectroscopie en Raman-based imaging zijn krachtige nieuwe tools in de bio-wetenschappen. Op dit moment, dit geldt met name voor de in vivo en in vitro onderzoek van cellulaire metabolisme en metabole stoornissen in de verwerking en opslag van lipiden. De meeste bio-macromoleculen bevatten een groot aantal vergelijkbare, meestal op koolstof gebaseerde moleculaire bindingen, zodat de Raman-spectra verkregen uit cellen en organismen meestal een convolutie van de bijdragen van lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, suikers, etc. Lipiden zijn relatief eenvoudig te isoleren van deze complexe spectra, vanwege hun neiging om dichte druppels of dubbellagen vorm en omdat ze bevatten uitgebreid ketens met een groot aantal alifatische CH bindingen. Ons vermogen om specifieke eiwitten, aminozuren, RNA of DNA te isoleren binnen de complexe cellulaire omgeving is echter zeer beperkt. Dit geldt met name als deze moleculen van belang zijn alleen aanwezig in uM concentraties en hieronder. Hier is de mogelijkheid om zwakke Raman resonanties gebruik te maken van onze nieuw geïntroduceerde DR-CARS verschil beeldvormende techniek sonde biedt een potentieel krachtige aanpak voor hun chemische microanalyse en beeldvorming. Toegegeven, de meest ingewikkelde deel van dit protocol is de afstemming en synchronisatie van het lasersysteem. Bij het starten vanaf nul, de synchronisatie van de pulsen, dat wil zeggen ervoor te zorgen dat de pulsen overlappen in de tijd, ondanks de verschillende wegen die zij nemen kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van een puls autocorrelator. Zodra ruimtelijke en temporele overlap wordt bereikt, auto&#39;s en DR-CARS-signalen moet gemakkelijk detecteerbaar. Echter, de eerste uitlijning is vaak ruw, wat resulteert in zwakke signalen. De best practice voor het uitlijnen van dit systeem goed is om in eerste instantie het genereren van zwakke signalen en vervolgens aan de signaalsterkte te verbeteren door voorzichtig tweaken de spiegels langs elke weg en het aanpassen van de temporele overlap met behulp van de vertraging fasen. Hoewel de spectrometer / monochromator fungeert als een zeer efficiënte klankbord voor de kamer het licht van de schoonste resultaten kunnen worden bereikt door gebruik van het systeem met verlichting in de kamer uitgeschakeld en gordijnen of lens buis op de achtergrond die door de verschillende andere lichtbronnen (bijv. computer beeldschermen te minimaliseren, indicator licht, LED&#39;s, etc.). Onze specifieke setup maakt gebruik van single-photon tellen lawine foto-diode (APD) detectoren en time-gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) hardware voor detectie 5. Dit stelt ons in staat om uiterst zwakke signalen te detecteren met een relatief laag geluidsniveau, maar veel groepen hebben gevonden photo-multiplier buizen (PMT&#39;s) met een variabele gain voordeel bij het maken van vergelijkbare metingen. Het voordeel van de PMT&#39;s is dat ze een variabele gain bieden en hebben een veel groter detectiebereik die uitlijning van de detector kan vereenvoudigen. Bovendien, onze setup maakt gebruik van piëzo-etappes aan de doelstelling te vertalen om scanning te bereiken. Het voordeel hiervan is dat we de mogelijkheid om op een plek terug te keren binnen de eerder gescande beeld met een hoge graad van nauwkeurigheid en aanvullende metingen met inbegrip van spontane Raman-spectra hebben. Andere groepen waren succesvol gebruik te maken van scanning spiegel vergaderingen, of zelfs hele confocale scanning-eenheden zoals de Olympus FluoView systeem, dat veel sneller beeldvorming biedt, maar is beperkt in zijn vermogen om nauwkeurig naar willekeurige locaties terug te keren binnen een afbeelding. Afstemmen van de lasers overeenkomen met de resonantie Raman is ook een kritische stap die sommige optimalisatie nodig heeft. Hoewel de Raman pieken kunnen worden gekend de maximale spectrale piek intensiteit verkregen van DR-auto&#39;s en auto niet noodzakelijk overeen met het maximum van de spontane Raman piek. Dit is te wijten aan de intrinsieke interferentie van signalen gegenereerd door vier-wave mixing leidt tot een niet-resonante achtergrond signaal en auto&#39;s, welke auto&#39;s spectra ten opzichte van spontane Raman-spectra vervormt. De spectrale plaats van de piek van de CARS-signaal kan worden berekend, maar een meer praktische aanpak is om het OPO af te stemmen op verschillende, kleine spectrale stappen over de verwachte locatie van de Raman resonantie. Dit proces moet opleveren een duidelijk maximum. In feite, voor de grootste gevoeligheid van de DR-FWM beide resonanties moet worden afgestemd op dit maximum. Een laatste potentieel probleem van de DR-CARS aanpak moet ook worden besproken, dat wil zeggen de DR-CARS-signaal is afhankelijk van een homogene verdeling van de Raman-actieve versterken molecuul. Voor de meeste biologische objecten, zou dit wel eens de brede OH resonantie van water, dat is overvloedig en bijna alomtegenwoordig. Water is echter uitgesloten van hydrofobe regio&#39;s met een cel, zoals lipide druppels, waardoor een verstoring van de signalen verkregen wanneer gebruik te maken van het water resonantie aan lipide modi versterken. In ons voorbeeld hebben we gebruik gemaakt van een oplossing van gedeutereerde glucose naar een gemakkelijk te detecteren en overvloedige signaal voor onze biologisch monster te genereren. Ook gedeutereerde water of gedeutereerde biologische Buffers, zoals d-HEPES kunnen worden gebruikt. In ons voorbeeld, de lipide druppels in de C. elegans worm waren klein genoeg om zowel de gedeutereerde glucose-oplossing en lipiden bevatten altijd binnen de laser-plek van ons systeem. Dit is echter niet altijd waar. Een bijzonder voorbeeld hiervan is adipocyten, wat vrij groot lipide druppels te genereren in hun cytoplasma. Dit betekent een experiment uitgevoerd met de DR-CARS-techniek vereist een zorgvuldige voorbereiding en controle-experimenten om de resultaten te verifiëren.

<table><tbody><tr><td>60X waterimmersie-objectief</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>Inverteerde microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>Pockels-cel</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>Picotrain pomplasers</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>Optische parametrische oscillator</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1,5 glasdekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Halfgolfplaten</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>Polariserende bundelsplitsercubes</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 of PBS053</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer/monochromator</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche-fotodiode</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>XYZ-piezo-tafel</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>Dit is een combinatie van een XY-tafel en een Z-objectiefhouder</td></tr><tr><td>Dichroïsche spiegels</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>Deze specifieke dichroïsche spiegels zijn niet kritisch; elke set met de juiste transmissie-/reflectiekenmerken is voldoende.</td></tr><tr><td>Dichroïsche spiegel</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>Om de verschillende nabij-infrarode laserbundels te combineren</td></tr><tr><td>TCSPC-board</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Symphotime Imaging-software</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante coherent anti-stokes raman scattering (cars)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherente Raman beeldvormende technieken hebben gezien een dramatische toename van de activiteit de afgelopen tien jaar als gevolg van hun belofte om label-free optische beeldvorming mogelijk is met een hoog moleculair specificiteit 1. De gevoeligheid van deze technieken is echter vele ordes van grootte zwakker dan fluorescentie, die milli-molaire moleculaire concentraties 1,2. Hier beschrijven we een techniek die de detectie van zwakke of lage concentraties van de Raman-actieve moleculen kunnen inschakelen door hun signaal versterken met die verkregen uit sterk of overvloedige Raman scatterers. De interactie van korte gepulste lasers in een biologisch monster genereert een scala aan samenhangende Raman scattering signalen, elk van die zich bezighouden met unieke chemische informatie over het monster. Typisch, is slechts een van deze signalen, bijv. Coherent Anti-Stokes Raman scattering (CARS), gebruikt om een ​​beeld te genereren, terwijl de anderen worden verwijderd. Echter, wanneer deze andere signalen, waaronder drie-kleuren CARS en vier-wave mixing (FWM), worden verzameld en vergeleken met de CARS-signaal, kan anders moeilijk om informatie te sporen worden geëxtraheerd 3. Bijvoorbeeld, dubbel-resonante CARS (DR-CARS) is het resultaat van de constructieve interferentie tussen twee resonantie signalen 4. We zien hoe afstemming van de drie lasers nodig zijn om DR-CARS-signalen te produceren om de 2845 cm -1 CH strekvibratie in lipiden en de 2120 cm -1 CD rekken trilling van een gedeutereerde molecuul (bijvoorbeeld gedeutereerde suikers, vetzuren, enz.) kan worden gebruikt om tegelijkertijd probe beide Raman resonanties. Onder deze omstandigheden, in aanvulling op CARS signalen van iedere resonantie, een gecombineerde DR-CARS signaal probing beiden is ook gegenereerd. We zien hoe het detecteren van het verschil tussen de DR-CARS-signaal en het versterken van het signaal van trillingen een overvloedige molecuul kan worden gebruikt om de gevoeligheid voor de zwakkere signaal te verbeteren. We verder laten zien dat deze aanpak ook geldt voor toepassingen waar de beide signalen worden gegenereerd uit verschillende moleculen, zoals dat bijvoorbeeld het gebruik van de sterke Raman signaal van een oplosmiddel kan de zwakke Raman-signaal van een verdunde opgeloste stof te verbeteren.

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto&#39;s) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Technieken voor coherente Raman-beeldvorming hebben het afgelopen decennium een dramatische toename in activiteit gekend vanwege hun potentieel om labelvrije optische beeldvorming mogelijk te maken ...

Deze video demonstreert een procedure voor het uitvoeren van differentiële beeldvorming van twee ramen-resonanties die geassocieerd zijn met biologische structuren met coherente ramen-verstrooiingssignalen. Eerst worden drie gesynchroniseerde kortpuls lasers in tijd en ruimte overlapt. De overlappende pulsen worden vervolgens naar een standaard omgekeerde microscoop gestuurd, waardoor de generatie van coherente ramen-signalen uit microscopische objecten mogelijk wordt.Signalen worden met behulp van commerciële software omgezet in beelden om de verschillende geproduceerde Raman-signalen te vergelijken. De resultaten geven aan dat het verschil tussen beelden verkregen uit dubbel- en enkel-resonante Raman-signalen zorgt voor een verhoogde gevoeligheid voor zwakke Raman-signalen. Hallo, ik ben Tyler Weeks van het Center for Bio Photonics aan de University of California Davis.Ik ben Thomas ER van het Center for Bio Photonics en de afdeling Interne Geneeskunde van de University of California Davis. Vandaag tonen we u een procedure voor het gebruik van dubbel-resonante coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing voor het produceren van chemisch specifieke beelden van cellen. We gebruiken deze procedure om signalen te detecteren van moleculen die te zwak zijn om direct door coherente anti-Stokes Raman-spectroscopie alleen te worden gedetecteerd.Laten we beginnen. Om gelijktijdig CARS- en DrCARS-signalen te genereren, zijn drie instelbare en gesynchroniseerde kortpulslaserbronnen nodig. Om deze gesynchroniseerde pulsen te verkrijgen, wordt gestart met een enkele kortpulslaser met een uitgangsvermogen van 10 watt, een vaste golflengte van 1064 nanometer, een vaste impulslengte van zeven picoseconden en een vaste herhalingssnelheid van 76 megahertz.Met behulp van een reeks halve-golfplaten en polariserende beamsplitterkubussen wordt de straal in drie delen gesplitst. Een halve-golfplaat in combinatie met een polariserende beamsplitterkubus maakt het mogelijk om het vermogen in elk onderdeel van de straal aan te passen zonder de richting ervan te veranderen. Gewoonlijk worden twee stralen ingesteld op ongeveer 4,5 watt elk, en bevat de derde straal het resterende ene watt.De twee krachtige stralen worden vervolgens gericht op twee onafhankelijke optische parametrische oscillatoren of OPO's. OPO's maken gebruik van frequentiegeneratie om een foton met hoge energie om te zetten in twee fotonen met een lagere energie en verschillende golflengten. Door de temperatuur van het kristal dat voor dit effect wordt gebruikt te regelen, kunnen de golflengten van de resulterende fotonen met een nauwkeurigheid van 0,1 nanometer worden beheerst.Door deze signalen in frequentie te verdubbelen, kan een laser met een vaste golflengte van 1064 nanometers nu worden omgevormd tot een laserstraal die overal tussen 780 nanometers en 910 nanometers kan worden afgestemd door twee afzonderlijke OPO's te pompen met dezelfde 1064 nanometer bron. Er worden twee onafhankelijk afstembare laserbronnen verkregen die automatisch gesynchroniseerd zijn met onze oorspronkelijke pomplaser. De derde straal van de 1064 nanometer pomplaser wordt door een combinatie van diëlektrische spiegels rond de OPO's geleid, zodat alle drie de stralen later kunnen worden gecombineerd.Om op efficiënte wijze coherente ramen-signaalfotonen te produceren, moeten de gecombineerde pulsen zowel temporeel als ruimtelijk overlappen. Omdat OPO's ringcaviteiten bevatten waardoor elke laserpuls meerdere keren door het kristal gaat, legt de bundel die door de OPO's wordt gestuurd een extra afstand af, wat resulteert in een aanzienlijke vertraging ten opzichte van de oorspronkelijke pompbundel. Deze afstand moet worden gecompenseerd met een derde bundel door extra spiegels te plaatsen die deze bundel dwingen dezelfde afstand af te leggen als de andere twee voordat ze met behulp van dichroïsche spiegels worden gecombineerd, zodat een nauwkeurige afstelling van de weglengte mogelijk is. Elke bundel wordt door verstelbare vertragingsstations gestuurd, waarmee de temporele overlap van de verschillende laserpulsen kan worden aangepast.Een weitere set halve-golfplaten en polariserende beamsplitterkubussen wordt aan elke bundel toegevoegd om de laserintensiteit van elke bundel onafhankelijk te kunnen aanpassen. Dichroïsche spiegels worden gebruikt om eerst de bundels van de twee OPO's te combineren en vervolgens de 1064 nanometer bundel; er moet nauwkeurig worden toegezien op een precieze ruimtelijke overlap van de bundels. Dit kan worden geverifieerd door de overlap van de bundels op enkele centimeters afstand van de dichroïsche spiegel te vergelijken met de overlap op ongeveer één meter afstand van de dichroïsche spiegel.Omdat blootstelling aan laserstralen met een hoog gemiddeld vermogen het monster kan beschadigen, worden de drie gecombineerde stralen door een elektrische optische modulator gestuurd die fungeert als pulse picker; hiermee kan de herhalingssnelheid van de pulsen die het monster bereiken, en daarmee het gemiddelde vermogen, worden aangepast. De gecombineerde laserstralen worden vervolgens gekoppeld aan een geïnverteerde microscoop met een objectieflens met een hoge numerieke apertuur of na. De sterke focussering die wordt gegenereerd door de objectieflens met hoge NA maakt de meest efficiënte generatie van coherente ramen-signalen op microscopische lengteschalen mogelijk.De objectieflens van de microscoop is gemonteerd op een X, Y, Z piëzotabel, waardoor beelden kunnen worden verkregen door de stralen over het monster te rasterscannen, vergelijkbaar met commerciële beamscanning confocale microscopen. Laten we nu kijken hoe CARS- en DR-FWM-signalen worden gegenereerd; de interactie van drie kortgepulste laserstralen in het monster resulteert in de generatie van verschillende four-wave mixing signalen, zoals CARS uit diverse combinaties van twee lasers, evenals driekleurige CARS- en DR-CARS-signalen uit de combinatie van alle drie de lasers. Wanneer signalen relatief dicht bij elkaar liggen in golflengte, kan het moeilijk zijn om ze voor analyse te scheiden.Om deze reden worden signalen doorgegeven aan een imaging spectrometer die tevens dient als monochromator of banddoorlaatfilter om signalen bij verschillende golflengten ruimtelijk te scheiden. Een elektronisch aangestuurde kantelspiegel in de spectrometer stuurt in de verlaagde positie het signaal naar een back-illuminated deep depletion charge coupled device of CCD-camera; deze levert spectroscopische informatie over het volledige signaalbereik en stelt ons in staat de verschillende coherente robin-signalen te identificeren en te optimaliseren om het signaal voor beeldvorming te selecteren. Draai eenvoudig het rooster binnen de spectrometer door middel van de door de leverancier meegeleverde besturings- en data-acquisitiesoftware om de piek van belang op de CCD-camera te centreren.Verander vervolgens de positie van de kantelspiegel om het signaal om te leiden naar een tweede uitgangspoort waaraan een single photon counting avalanche photo DDE of een PD is gekoppeld. Scan de objectieflens in een rasterpatroon en gebruik vervolgens de op de A PD geregistreerde signalen om een afbeelding te genereren door de fotontellingssnelheid per pixel weer te geven met de data-acquisitiesoftware. Herhaal deze beeldvormingsprocedure voor elk gewenst coherent ramen-signaal, zodat de signalen tijdens de nabewerking kunnen worden vergeleken.Laten we nu bekijken hoe een monster correct wordt geprepareerd om heldere, reproduceerbare beelden te verkrijgen. Bij de preparatie van de monsters is zorgvuldigheid geboden. Monsters worden doorgaans geprepareerd op glazen dekglasplaatjes met een dikte van ongeveer 150 micron.Deze dekglasjes zijn dun genoeg om beeldvorming met een hoge resolutie mogelijk te maken met de water- of olie-immersieobjectieven met een hoge NA die in deze experimenten worden gebruikt. Om de preparatie van een typisch monster te demonstreren, bereiden we coupes van muisspierweefsel met een dikte van ongeveer 20 micron voor, die op een microscopische objectglas worden gefixeerd. Een druppel van 20 µL van een vijf molar gedeutereerde glucoselaag wordt aan het monster toegevoegd.De gedeuteerde glucoseloplossing zorgt voor een unieke en sterke Raman-achtergrondsignatuur. Een glazen dekglas wordt bovenop het monster geplaatst en met nagellak vastgezet voor cellen en culturen. Er kunnen kweekschaaltjes met een glazen bodem worden gebruikt, waardoor beeldvorming mogelijk is zonder dat de cellen van hun kweekschalen hoeven te worden losgemaakt.Laten we nu bekijken hoe de juiste Raman-pieken voor Dr. cars worden bepaald. Om optimaal gebruik te maken van het dubbel resonantie-versterkingseffect, moeten de Ramanspectra van beide Raman-resonante stoffen bekend zijn. Meestal zijn dit 2845 cm⁻¹ geassocieerd met lipiden en 2121 cm⁻¹ voor de CD-strekmodus geassocieerd met de gedeutereerde glucose.Coherente Raman-verstrooiing wordt bereikt wanneer het frequentieverschil tussen twee lasers overeenkomt met de frequentie van een moleculaire vibratie. Door één OPO af te stemmen op 817 nanometer, zal deze de C-modus van 2.845 inverse centimeter sonderen in combinatie met de 1064 nanometer laserstraal, en door de andere OPO af te stemmen op 868 nanometer, zal deze de 2.121 inverse centimeter sonderen in combinatie met de 1064 nanometer straal. In de spectroscopische modus stelt de CARS-microscoop ons in staat om drie coherente Raman-signalen van belang te observeren: een CARS-signaal dat de CH-strekvibratie sondeert, een CARS-signaal dat de CD-strekmodus sondeert, en een DR-CARS-signaal dat beide sondeert. In het hier getoonde diagram geven de gestreepte pijlen fotonen van de laser in de OPO's aan en geven de ononderbroken pijlen het resulterende signaal aan.De doorlopende horizontale lijnen geven de energie van de Raman-vibratie aan en bieden een visuele weergave dat bij DR-cars het gelijktijdig mengen van dezelfde drie inputfotonen twee verschillende Raman-vibraties aanstuurt. De signaalsterkte voor elke piek zal geoptimaliseerd moeten worden door in kleine stappen rond deze pieklocaties af te stemmen. Hier selecteren we elke piek en maken we beelden van sea elgan-wormen in een oplossing van gedegradeerde glucose; het extraheren van aanvullende informatie op basis van deze drie afzonderlijk verkregen beelden vereist enkele vrij eenvoudige beeldbewerkingen.Eerst moeten de beelden worden genormaliseerd. Een praktische methode voor normalisatie berust op het feit dat lipiden hydrofoob zijn. Dit betekent dat in regio's met een hoge lipidendichtheid de CD-resonantie van de glucose nauwelijks zou moeten bijdragen aan het dubbelresonantiesignaal.Omgekeerd zouden in gebieden met een pure glucoseloplossing de CH-resonanties van de lipiden eveneens zeer weinig moeten bijdragen. Met dit in gedachten normaliseert u de DR-car afbeelding en de car-afbeelding verkregen op de CD-resonantie van de gedeuteerde glucoseloplossing naar een gebied ver buiten de CL egan's worm dat geen CH-resonantie zou moeten vertonen. Identificeer vervolgens in de CH-resonante car-afbeelding een gebied binnen de worm dat rijk is aan lipiden en normaliseer dit naar het overeenkomstige gebied binnen de genormaliseerde DR-car afbeelding.Om deze methode correct te laten werken, wordt ervan uitgegaan dat er diep in deze regio geen gedeutereerde glucose aanwezig is. Dit is een veilige aanname, aangezien de lipiden hydrofoob zijn en niet met de oplossing zullen mengen. Door nu het genormaliseerde CH-resonante CAR-beeld af te trekken van het genormaliseerde DR-CAR-beeld, blijft alleen het versterkte CD-resonante signaal over; op soortgelijke wijze kan dit worden gedaan door het genormaliseerde CD-resonante CAR-beeld af te trekken van het genormaliseerde Dr.FWM-beeld.Alleen het versterkte CH-resonantiesignaal blijft over; hier wordt het ramanspectrum getoond voor een gemodificeerd oliezuur dat een alkynmodificatie bevat. De sterke CH-resonanties bij 2.845 cm⁻¹ en de alkynresonantie bij 2.121 cm⁻¹ zijn beide goed geïsoleerd van de vingerafdrukregio, de regio met dicht opeengepakte pieken, waardoor ze ideale markers zijn voor coherente raman-imaging. Dit is een typisch spectrum van coherente ramansignalen die worden gegenereerd wanneer drie kortpuls-lasers elkaar overlappen in het monster. De pijlen wijzen naar de processen die verantwoordelijk zijn voor elk signaal, zoals weergegeven in de energiediagrammen.Dit zijn typische resultaten van de beeldvorming van de wormen van C Elgin met behulp van DR CARS en CARS. In de bovenste rij werden de drie zojuist getoonde signalen gebruikt om een worm in een oplossing van gedegradeerde glucose te beelden. In de tweede rij zijn de beelden op passende wijze genormaliseerd en in de derde rij werden de differentiebeelden gegenereerd door elk van de CARS-beelden af te trekken van het DR CARS-beeld. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe Raman-differentiebeeldvorming kan worden uitgevoerd op basis van dubbel resonante coherente antis Raman-microscopie.Houd bij het uitvoeren van deze procedure rekening met het volgende: het is essentieel om te controleren of de stralen correct overlappen en gesynchroniseerd zijn. Let er daarnaast op dat u het monster niet stoot of verplaatst bij het schakelen tussen verschillende coherente signalen, aangezien dit de analyse zal beïnvloeden. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: McCullagh, E. A., et al. Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates fluorescence and Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) imaging to visualize neuronal architecture in rodent brain tissue. Nissl staining labels cell bodies by binding to ribosomal RNA, while CARS imaging targets lipid-rich myelin through laser-induced signals. Overlaying the fluorescence and CARS images provides a...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy to Visualize Myelinated Neurons in Mouse Brain Tissue

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gecombineerd met een intrinsieke doorstroom ontbinding opstart om in situ en real-time visualisatie van het oppervlak van farmaceutische tabletten ondergaan oplossen. Met behulp van deze custom-built setup, is het mogelijk om auto's te correleren met drugs oplosprofielen opgenomen met inline UV-absorptie spectroscopie.

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Microscopie Visualiseert Farmaceutische Tabletten tijdens het oplossen

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Leer differentiële beeldvorming met dubbel-resonante CARS-microscopie voor biologische structuren. Deze methode gebruikt drie gesynchroniseerde lasers om zwakke Raman-signalen te detecteren en chemisch specifieke cellulaire beelden te produceren.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Meer video's verkennen