Name: Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer hoe je cystewandvorming in Toxoplasma gondii induceert en visualiseert met behulp van macrofagen en fibroblasten. Deze methode maakt immunofluorescentiemicroscopie van parasietreacties op stress mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship (CMT), NIH award AI072817 (AMP) en de American Heart Association Award 0840059N (LJK).

1. De voorbereiding van de menselijke voorhuid fibroblasten (HFF)-gecoate dekglaasjes <ol><li> Plaats een steriele ronde glazen dekglaasje op de bodem van de wells van een 24-well weefselkweek plaat. </li><li> Om de oogst HFFS van een confluente 150 cm 2 fles, twee keer spoel de kolf met 1X PBS en voeg 2,5 ml van 0,025% trypsine-EDTA. Incubeer kolf bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. </li><li> Door op de zijkant van de kolf tegen de palm van je hand kan helpen bij het verwijderen van de cellen van de kolf. Zodra cellen hebben vrijgelaten uit de fles, voeg 150 ml van HFF-medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, en 1% penicilline-streptomycine) en gebruik het medium om de af te spoelen en het verzamelen van de cellen. </li><li> Doseer 1 ml van cellen per putje met de dekglaasjes. </li><li> Laat cellen om samenvloeiende worden bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. Voorbereiden L929 geconditioneerd medium (CM) voor BMC ontwikkeling <ol><li> L929 is een murine aneuploïde fibrosarcoom cellijn die macrofaag kolonie stimulerende factor afscheidt na lange periodes van confluentie. Deze afscheiding kan de CM van L929 cellen die worden gebruikt om beenmergcellen van de muis te ontwikkelen tot macrofagen in celcultuur 1. </li><li> Zodra L929 cellen zijn confluent, laat ze uitbroeden voor een extra 7-9 dagen totdat ze lijken sferische en beginnen tillen uit de kolf. Verzamel supernatant en pellet eventuele vrijstaande cellen bij 425 xg gedurende 10 minuten. Dit supernatant is de CM. </li><li> Een 150 cm 2 fles van L929 cellen levert 30 ml van de CM, die 150 ml van BMC medium genereert. BMC medium is samengesteld uit 10% FBS, 20% CM, 1% penicilline-streptomycine, en 1% L-glutamine in DMEM. </li></ol> 3. Isolatie van beenmerg en celcultuur van BMCS <ol><li> Offer een C57BL / 6 muis door CO 2 stikken en het oppervlak steriliseren met 70% ethanol. </li><li> Expose het buikvlies door het optillen van de buikhuid in de buurt van het been en snijden met een schaar. Vermijd het aanprikken van de buikholte. Gekapt om het been naar het scheenbeen en het dijbeen bloot te leggen. Gesneden spierweefsel uit het been botten met een schaar. </li><li> Aan het dijbeen te verwijderen, snij een keer onder de knie en een keer in de buurt van de heup. Leg de botten in een bacteriologische petrischaal met koud 1X PBS. Gebruik geen tissue cultuur behandeld petrischalen voor deze stappen, omdat de BMCS permanent hechten. Gebruik een scalpel te schrapen eenmalige extra spierweefsel. Snijd het bot net boven de knie tot aan het merg bloot te leggen. </li><li> Herhaal de stappen (b) en (c) om beenmerg te verzamelen van de tweede dijbeen. </li><li> Gebruik een 10cc injectiespuit gevuld met koud 1X PBS en een 25 gauge naald om het beenmerg los in een 50 ml conische buis. Het bot zou moeten verschijnen zuiver wit zodra beenmerg wordt verwijderd. </li><li> Passeer de PBS / merg mengsel door een 22 gauge naald te breken elke beenmerg aggregaten. </li><li> Draai het mengsel bij 425 xg gedurende 10 minuten, en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in 8 ml van BMC medium. Voeg 1 ml celsuspensie en 9 ml BMC middellange tot 8 bacteriologische petrischalen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Op dag 5, voeg 10 ml BMC medium om elk bord. Op dag 7, zullen de cellen volledig ontwikkeld. BMCS kan worden gepasseerd voor 1-2 weken na de rijping. </li><li> Op te splitsen BMCS, verwijder het medium en voeg 5 ml koud 1X PBS aan elke petrischaal. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten, totdat de cellen beginnen op te tillen. Spoel de BMCS uit de plaat met een steriele pipet overdracht. </li><li> Het zwembad van het BMCS in een 50 ml conische buis en pellet bij 425 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml BMC medium en rekenen op een hemocytometer. Zaad 2x105 BMCS per putje in een 24-well plaat met ronde glazen dekglaasjes op de bodem. Laat de BMCS 's nachts hechten alvorens besmetten met T. gondii. Overtollige BMCS kan worden reseeded op petrischaaltjes voor later gebruik. </li></ol> 4. Infecteren cellen met T. gondii <ol><li> Infect 25 cm 2 fles die confluente HFFS met 2x10 6 T. gondii en groeien tot cellen beginnen te lyseren (ongeveer 2-3 dagen). </li><li> Gebruik een cel schraper om de geïnfecteerde gastheercel monolaag te verwijderen uit de weefselkweek fles en laat de parasieten van de host cellen door het passeren van de losgekomen monolaag door middel van een 27-gauge naald. </li><li> Gebruik een hemocytometer om het aantal parasieten te bepalen in het medium. </li><li> Infect 10 5 parasieten per goed met dekglas van HFF-monolagen van Protocol nr. 1, of BMCS van Protocol nr. 3. Laat de parasieten binnen te vallen gedurende 3 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 5. Initiëren T. gondii bradyzoite ontwikkeling door milieu-invloeden <ol><li> Bradyzoite ontwikkeling in HFFS met gemiddelde pH-waarde te verhogen en de CO 2 honger <ol class="lalpha"><li> Bereid ontwikkeling medium. Ontwikkeling medium bevat RPMIk heb 1640 zonder bicarbonaat, 1% FBS, 1% penicilline-streptomycine, en 42 mM HEPES. pH tot 8,0 en filter steriliseren. </li><li> Verwijderen van geïnfecteerde DMEM HFFS, spoelen met 1X PBS en voeg 1 ml van de ontwikkeling medium. </li><li> Incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C met de omgevingslucht. </li></ol></li><li> Activering van BMCS <ol class="lalpha"><li> Bereid medium tot BMCS te activeren. Activering medium is BMC medium aangevuld met IFN-γ 100U/ml en 100 ng / ml LPS. Sonificeer LPS in een waterbad gedurende 2 minuten voor gebruik om de aggregaten te verstoren. </li><li> Verwijder de BMC medium van putten en te vervangen door 1 ml van de activering medium. </li><li> Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 3 dagen. </li></ol></li></ol> 6. Immunofluorescentie detectie <ol><li> Spoel besmette putjes drie keer met 1X PBS. </li><li> Bevestig de monolaag met 200ul van 3% formaldehyde gedurende 20 minuten. </li><li> Verwijder fixatief en spoel putten met 1X PBS. </li><li> Voeg 200μl van 0,1 M glycine om putten en laat zitten voor 5 minuten. </li><li> Verwijder de glycine en spoel putten met 1X PBS. </li><li> Voeg 250 ul van 3% BSA/0.2% TritonX-100 in 1X PBS tot permeabilize en blokkeren de monolaag gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de blokkering oplossing en spoel putten met 1X PBS. </li><li> Voeg 50 ul van een 1:250 verdunning van rhodamine Dolichos biflorus agglutinine in 3% BSA/0.2% Triton X-100 in 1X PBS. </li><li> Afdekplaat en plaats op het platform van shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur </li><li> Was de dekglaasjes 3 keer met 0,2% Triton X-100 in 1X PBS gedurende 5 minuten op een platform shaker. </li><li> Mount coverslips gebruik VectaShield montage medium met 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li> Stained T. gondii kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een filter geschikt is voor rhodamine bij een vergroting van 100x. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Figuur 1 toont vertegenwoordiger DBA kleuring van T. gondii in geactiveerde BMMs en HFFS onder pH stress. Beide tonen DBA vlekken rond parasiet met vacuolen, wijst op de aanwezigheid van de cyste wand componenten. De geactiveerde BMM afbeelding toont DBA kleuring die in overeenstemming is met het oppervlak van de vacuole. De doorsnede van T. gondii in pH benadrukte HFFS toont de cyste wand met geen interne structuren gekleurd. <img src="/files/ftp_upload/2091/2091fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. DBA kleuring van benadrukte T. gondii. intracellulaire parasieten onder stress omstandigheden, geactiveerd BMMs of pH benadrukt HFFS, werden gekleurd met rhodamine geconjugeerde DBA (rood). Differentieel interferentie contrast (DIC) toont de contouren van de cyste en de zwarte schaalbalk is gelijk aan 2 uM. Experimenten op dieren Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving weer door de Universiteit van Wisconsin Animal Care en gebruik Comite.

<ol><li>Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+factor+inducing+differentiation+of+mouse+myeloid+leukemic+M1+cells+from+conditioned+medium+of+mouse+fibroblast+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells.</a> J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).</li>
<li>Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+differentiation+mutants+in+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>J, P., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Toxoplasma+gondii+development+mutants+identifies+a+potential+proteophosphogylcan+that+enhances+cyst+wall+formation.+Molecular+and+Biochemical+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology.</a> 169 (2), 120-123 (2010).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Bradyzoite-Specific+Toxoplasma+gondii+Antigens+in+Gamma+Interferon-Treated+Mouse+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages.</a> Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).</li>
<li>Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Cyclophilin+18-Mediated+Production+of+Nitric+Oxide+Induces+Bradyzoite+Conversion+in+a+CCR5-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).</li>
<li>Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+tachyzoite-bradyzoite+interconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion.</a> Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).</li>
<li>Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors+2%2C+3%2C+and+4%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).</li>
<li>Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patatin-like+protein+protects+Toxoplasma+gondii+from+degradation+in+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages.</a> Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+of+Toxoplasma+gondii+is+necessary+for+induction+of+bradyzoite-specific+antigens%3A+a+possible+role+for+nitric+oxide+in+triggering+stage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion.</a> Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).</li>
</ol>

Hoewel het mechanisme van bradyzoite ontwikkeling is niet volledig begrepen, moleculair genetische analyses van T. gondii stadium conversie in weefselkweek heeft geleid tot de ontdekking van genen die betrokken zijn bij bradyzoite cyste vorming van 2,3,4. De analyses ook geleid tot de observatie dat sommige bradyzoite markers zijn uitgedrukt in andere langdurige stress voorwaarden, waaronder de groei van geactiveerde macrofagen 5,6. De bovenstaande methoden wordt beschreven hoe T....

<table><tbody><tr><td>Runder-serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>hitte-inactiveren</td></tr><tr><td>Rhodamine &lt;em&gt;Dolichos biflorus&lt;/em&gt; agglutinine</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (16%)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&amp;#947;</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-05</td><td>Bewaren in aliquots voor eenmalig gebruik</td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>Bewaren in aliquots voor eenmalig gebruik</td></tr><tr><td>Microscoopdekglaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-medium 1640 poeder (met L-glutamine, zonder bicarbonaat)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield montage medium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

toxoplasma gondii cyste muur vorming in actieve beenmerg afgeleide macrofagen en bradyzoite voorwaarden

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet dat elke kern cel van warmbloedige dieren kunnen binnenvallen. Tijdens de infectie, T. gondii verspreidt als een snel repliceren vorm genaamd de tachyzoite. Tachyzoites om te zetten in een langzaam groeiende ingekapseld vorm genaamd de bradyzoite door een signalering proces dat niet goed is gekarakteriseerd. Binnen de dieren, zijn bradyzoite cysten gevonden in het centrale zenuwstelsel en spierweefsel en vormen de chronische fase van de infectie. Conversie naar bradyzoites gesimuleerd kan worden in weefselkweek door CO 2 verhongering, met behulp van een medium met een hoge pH-waarde, of de toevoeging van interferon-gamma (IFNy). Bradyzoites worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een cyste wand, waarop de lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA) bindt. Fluorescent gelabelde DBA wordt gebruikt om de cyste muur in parasieten gekweekt in menselijke voorhuid fibroblasten (HFFS) die zijn blootgesteld aan lage CO 2 en een hoge pH medium te visualiseren. Ook parasieten die in muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs) display een cyste wand detecteerbaar door DBA na de BMMs worden geactiveerd met IFNy en lipopolysaccharide (LPS). Dit protocol zal aantonen hoe de conversie van T. te induceren gondii naar bradyzoites met behulp van een hoge pH groeimedium met een lage CO 2 en activering van BMMs. Gastheercellen worden gekweekt op dekglaasjes, besmet zijn met tachyzoites en ofwel geactiveerd met toevoeging van IFNy en LPS (BMMs) of blootgesteld aan een hoge pH groeimedium (HFFS) voor drie dagen. Na voltooiing van infecties, zal gastheercellen worden vastgesteld, gepermeabiliseerde, en geblokkeerd. Cyste wanden zullen worden gevisualiseerd met behulp van rhodamine DBA met fluorescentie microscopie.

Toxoplasma gondii wordt omgezet in een cyste formulier in reactie op belasting van het milieu, die kunnen worden nagebootst in weefselkweek modellen. Deze video demonstreert technieken om cyste wand vorming van onderzoeken door het activeren van beenmerg afgeleide macrofagen of het wijzigen van groeimedium pH in fibroblast cellen.

Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet die elke gekerneerde cel van warmbloedige dieren kan binnendringen. Tijdens een infectie ...

Het algemene doel van deze procedure is om de vorming van de cystewand bij Toxoplasma Gandhi in vitro te induceren en te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst macrofagen en fibroblasten te kweken.Vervolgens kunnen stressresponsen in de gastheercellen worden geïnduceerd door deze te infecteren met de parasiet; dit gebeurt door fibroblasten te shockeren met pH of door de macrofagen te activeren, wat beide zal leiden tot de vorming van de cystewand. Ten slotte wordt fluorescent lectine aan de culturen toegevoegd dat zich bindt aan de cystewand, waardoor de cyste gevisualiseerd kan worden met immunofluorescentiemicroscopie. Hallo, ik ben Crystal Tobin van het laboratorium van Dr. Laura Noel van de afdeling Medische Microbiologie en Immunologie aan de University of Wisconsin Madison.Ik ben Angela Pollard, ook van het No Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor de in vitro vorming van de cystewand van Toxoplasma gondii. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de reacties van parasieten op stressomstandigheden te bestuderen.Laten we beginnen. Begin met het plaatsen van een steriel rond glazen dekglas op de bodem van elke put van een 24-well tissue culture plaat om de conversie van Toxoplasma gondii naar bradyzoïten in humane foreskin-fibroblasten te induceren onder condities van een hoge pH en koolstofdioxidegebrek. Start met een confluente fles van 150 vierkante centimeter met humane foreskin-fibroblasten onder een tissue culture hood.Spoel de confluente kolf met menselijke voorhuidfibroblasten twee keer met XPBS en voeg vervolgens 2,5 milliliters 0,025%tripsin EDTA toe. Incubeer de kolf bij 37 degrees Celsius gedurende vijf tot 10 minuten. Tik na de incubatie van vijf tot 10 minuten meerdere keren tegen de kolf om de cellen van het plastic oppervlak los te maken.Voeg vervolgens 150 milliliter HFF-medium of aangevuld delcos gemodificeerd eagles-medium toe. Gebruik het medium om de fles te spoelen en de cellen te verzamelen. Verdeel één milliliter cellen over elke put van de 24-well plaat met dekglasplaatjes en laat de cellen confluency bereiken bij 37 °C in 5% CO2.De cellen zijn vervolgens klaar voor infectie met de Toxoplasma Gandhi-parasiet. Infecteer onder de steriele zuurkast een kolf van 25 vierkante centimeter met confluente menselijke voorhuidfibroblasten met 2 × 10⁶ parasieten en incubeer deze bij 37 °C tot de cellen beginnen te lyseren. Gebruik na ongeveer twee tot drie dagen een celscraper om de geïnfecteerde monolaag voorhuidfibroblasten uit de kweekkolf te verwijderen.Zet vervolgens de parasieten vrij uit de gastheercellen door de losgekomen monolaag door een naald van 27 gauge te leiden. Gebruik een hemocytometer om het aantal parasieten in het medium te bepalen en infecteer vervolgens elk van de 24 wells met de confluentie menselijke voorhuidfibroblasten (vooraf geprepareerd) met 10^5 parasieten.Incubeer de cellen gedurende drie uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide om de parasieten de gastheercellen te laten binnendringen. Ga vervolgens over tot het induceren van de conversie van parasieten naar het Brady Zeolite-stadium. Verwijder het DMEM uit de geïnfecteerde menselijke voorhuidfibroblasten.Spoel ze af met XPBS en voeg vervolgens één milliliter ontwikkelingsmedium toe. Een medium op basis van RPMI zonder bicarbonaat, ingesteld op pH 8. Incubeer de cellen gedurende drie dagen bij 37 °C in omgevingslucht.De cellen zijn nu klaar om geanalyseerd te worden op de aanwezigheid van bradyzoïten. De aanwezigheid van bradyzoïten wordt bepaald met behulp van het fluorescent gelabelde lectine DBA, dat bindt aan de cystewand van Toxoplasma gondii. Spoel de putjes drie keer met 1x PBS om de geïnfecteerde cellen voor te bereiden op fluorescentebeelding.Fixeer vervolgens de cellagen met 200 µL 3% formaldehyde gedurende 20 minuten. Verwijder het fixatief en spoel de wells met één keer XPBS. Voeg 200 µL 0,1 M glycine toe aan de wells en laat deze vijf minuten inwerken.Verwijder de glycine en spoel de wells met één keer XPBS om de cellen te blokkeren en te permeabiliseren. Voeg 250 microliters blokkeringsoplossing toe. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten.Verwijder de blokkeeroplossing en spoel de wells met één keer XPBS. Voeg 50 µL van een 1:250 verdunning van DBA, geconjugeerd aan rumine, toe aan de wells. Dek de plaat af en schud deze gedurende één uur bij kamertemperatuur op een platformschudder.Verwijder na de incubatie de fluorescentie-gelabelde DBA door de dekglasjes drie keer gedurende vijf minuten te wassen met 0,2% Triton X 100 in 1x PBS op een platformschudder; monteer de dekglasjes vervolgens met beta shield monteermedium dat dpi bevat. De kleuring kan worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop met een filter dat geschikt is voor rhodamine bij een 100x vergroting. Als alternatieve methode voor het induceren van Bradyzoötenvorming kunnen geïnfecteerde macrofagen afkomstig uit het beenmerg worden geactiveerd met interferon gamma en lipopolysaccharide of LPS. Bereid voor dit proces eerst L 929 geconditioneerd medium.L 9 29 is een gemodificeerde, toegepaste fibrosarcoom-cellijn die macrophage colony stimulating factor secreteert na langere perioden van confluentie. Dit geconditioneerde medium kan worden gebruikt om muizenbeenmergcellen in celkweek te differentiëren tot macrofagen. Om geconditioneerd medium te bereiden, laat men één fles van 150 vierkante centimeter met L 9 2 9-cellen tot confluentie groeien bij 37 °C. Incubeer ze vervolgens nog zeven tot negen dagen, totdat ze er sferisch uitzien en beginnen los te komen van het oppervlak van de fles.Verzamel het medium en alle losgekoppelde cellen in een buis van 50 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 420 5G. Het resulterende supernatant is het geconditioneerde medium. Eén 150 square centimeter fles met L 9 29-cellen levert 30 milliliter geconditioneerd medium op, wat het volume is dat nodig is om 150 milliliter BMC-medium te bereiden. Vergeet niet DMEM voor BMC te bereiden met de L 9 29 cm die gebruikt zullen worden voor de BMC-ontwikkeling.Bekijk de gedetailleerde videoprotocollen voor de methode om beenmergcellen te isoleren. Voor het muisdijbeen kunt u de volgende videoprotocollen bekijken nadat de geoogste BMC's vijf dagen zijn geïncubeerd. Voeg in bacteriologische petrischalen 10 milliliters BMC-medium, dat geconditioneerd medium van L 9 2 9-cellen bevat, toe aan elke schaal en incubeer dit nog twee dagen, waarna de cellen volledig ontwikkeld zullen zijn.Rijpe uit het beenmerg afgeleide macrofagen of BMS kunnen een tot twee weken na rijping worden gepassaged. Om de BMS te splitsen, wordt het medium verwijderd en worden vijf milliliter koude one XPBS toegevoegd, geïncubeerd bij 4 °C gedurende 30 minuten totdat de cellen beginnen los te laten. Spoel de cellen met een steriele transferpipet van de plaat af. Breng de BMS over in een conische buis van 50 milliliter en pelletteer de cellen bij 420 ×g gedurende 10 minuten.Resuspendeer de pellet in 10 milliliters BMC-medium en gebruik vervolgens een hemocytometer om de celdichtheid te bepalen. Zaai 2 × 10⁵ cellen per well. Laat de cellen in een 24-wells plaat met ronde dekglasjes op de bodem een nacht hechten voordat ze worden geïnfecteerd met T. gondii.Overtollige cellen kunnen op petrischalen worden bewaard voor later gebruik. Om de BMD's te activeren, bereid het activatiemedium door LPS gedurende twee minuten in een waterbad te sonceren om eventuele aggregaten te verbreken. Voeg vervolgens 100 ng/mL LPS en 100 U/mL IFN-gamma toe aan het BMD-medium.Verwijder ten slotte het BMC-medium uit de wells en vervang dit door activatiemedium. Incubeer drie dagen bij 37 °C en 5% CO₂. BMC's kunnen worden gekleurd zoals eerder is aangetoond bij foreskin-fibroblasten.In deze voorbeelden zijn toxoplasma Gandhi I Bradys gelabeld met fluorescent DBA in menselijke voorhuidfibroblasten onder pH-stress. De cystewand is fluorescent gelabeld, zoals getoond in deze dwarsdoorsnede van een in vitro cyste in dms die zijn geactiveerd met IFN Gamma en L-P-S-D-V-A.Kleuring is ook aanwezig, zoals hier te zien is op het oppervlak van de vacuole. We hebben zojuist laten zien hoe u in vitro Toxoplasma gondii-cysten in fibroblasten en geactiveerde macrofagen kleurt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat de parasieten en gastheercellen op dezelfde dag gereed moeten zijn.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

toxoplasma-gondii-cyst-wall-formation-activated-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een aangepaste CsCl methode die gemakkelijk T. gondii oöcysten zuivert van uitwerpselen van geïnfecteerde katten die geschikt zijn voor moleculair-biologische en weefselkweek...

Het verkrijgen van zeer zuivere Toxoplasma gondii Oöcysten door een discontinue Cesium Chloride Gradient

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Het algemene doel van dit protocol is om te instrueren hoe te extraheren, te onderhouden, en scheiden murine astrocyt en microglia cellen uit het centrale zenuwstelsel, gevolgd door infectie met protozoa parasieten.

Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Leer hoe je cystewandvorming in Toxoplasma gondii induceert en visualiseert met behulp van macrofagen en fibroblasten. Deze methode maakt immunofluorescentiemicroscopie van parasietreacties op stress mogelijk.

Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden

Meer video's verkennen