Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie
13 april 2011
Transplantatie van geïsoleerde eilandjes is voorgesteld om een potentiële behandeling voor diabetes type 1 zijn. Hier beschrijven we een methode om de eilandjes van de muis pancreata isoleren en transplantatie ze aan de subcapsulaire ruimte van de nier.
Oogjestransplantatie is voorgesteld als een potentiële behandeling voor type één diabetes. Echter, twee grote beperkingen verhinderen dat het een wijdverbreide klinische realiteit wordt. Ten eerste is een groot aantal oogjes nodig per ontvanger.
Aangezien oogjes worden verkregen van orgaandonoren, is het aantal potentiële ontvangers ernstig beperkt. Ten tweede vereist transplantatie levenslange behandeling met sterke immunosuppressiva, wat de patiënt, vooral de pediatrische populatie, in gevaar brengt voor maligniteit, infectie en nierfalen. Oogjestransplantatie onder de niercapsule van een muis wordt uitgevoerd om strategieën te onderzoeken voor het verbeteren van klinische transplantatieresultaten.
Oogjes geïsoleerd van gezonde donormuizen worden ingedeeld in groepen en voorbereid voor transplantatie. De oogjes worden vervolgens getransplanteerd in de subcapsulaire ruimte van de nier. Bij diabetische ontvangermuizen wordt de functie van het oogjestransplantaat beoordeeld door het bewaken van de bloedglucosespiegels, die aantonen dat ongeveer 250 tot 350 oogjes de glycemie bij een ontvangermuis van 20 gram binnen 24 uur na transplantatie herstellen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal voor de stappen voor canuleringen. De gemeenschappelijke galgang en overdracht van de oogjes naar de subcapsulaire ruimte van de nier zijn moeilijk te leren. Deze stappen vereisen een identificatie van weefselstructuren, vaste handen en het gebruik van een techniek die weefselschade minimaliseert.
Plaats een geëuthaniseerde muis in de rugligging op een papieren handdoek bij de dissectiemicroscoop en besproei de buik met 70% ethanol. Gebruik een schaar om de buik te openen met een V-snede van de schaamstreek tot beide voorpoten. De muis bevindt zich onder de dissectiemicroscoop.
Plaats het met het hoofd naar de waarnemer gericht. Lokaliseer de duodenale ingang van de gemeenschappelijke galgang met een hemostaatklem, de duodenale opening van de gemeenschappelijke galgang. De hemostaat moet zodanig worden gepositioneerd dat deze, wanneer gecomprimeerd, precies langs de pancreas-darmrand loopt.
Hier worden twee methoden om de galgang te canuleren gedemonstreerd. De vrijhandige methode en de pincet-assist-methode om de galgang te canuleren. Gebruik de vrijhandige methode, trek de met een hemostaat geklemde duodenum weg van het hoofd van de muis naar de staart, zodat de gemeenschappelijke galgang strak wordt.
Er is een samenvloeiing in de galgang dicht bij de lever waar gal die uit de galblaas komt en enzymen uit de lever samenkomen. Voordat ze in de darmen komen, trek de galgang strak om de binnenkant van de V-positie bloot te leggen. Een gebogen 27-gauge naald bevestigd aan een vijf milliliter spuit zodat de naald recht door de V glijdt en direct de onderste portie van de ductus canuleert. Schuif de naald enkele millimeters voorbij het einde van de snede om terugstroom in de lever en galblaas te voorkomen.
Zodra de canuleringen succesvol is, perfundeer de pancreas door twee milliliter liase uit de spuit te verstrekken. Let op de expansie van de pancreas over de maag als indicatie van optimale canuleringen. Als alternatief kan de galgang worden gecanuleerd.
Gebruik de pincet cyste methode. Trek de met een hemostaat geklemde C op het duodenum weg van het hoofd van de muis naar de staart, zodat de gemeenschappelijke galgang wordt tort. Gebruik vervolgens een gebogen 27-gauge naald bevestigd aan een vijf milliliter spuit om de fascia onder de gemeenschappelijke galgang dicht bij de lever te doorboren.
Gebruik de naald om de fascia van de ductus te zuiveren met de naald nog steeds op zijn plaats. Leg de hemostaat neer en pak een paar pincet. Gebruik een arm van de open pincet om de galgang te ondersteunen waar de naald de fascia heeft gezuiverd, terwijl de ductus en pincet naar voren worden getrokken.
Schuif de naald in de ductus met behulp van de pincet als tegenhouder. Een succesvolle canuleringen wordt aangegeven door een gelijkmatige expansie van de pancreasregio boven de maag. Zodra de pancreas is geperfundeerd, verwijder de hemostaat van de duodenum.
Gebruik vervolgens het pincet om het duodenum op te tillen en gebruik een tweede paar pincet om de pancreas van de darmen te scheiden. Trek vervolgens de pancreas vrij van de bovenkant van de maag en de milt. Til eindelijk de pancreas uit de buik en snijd deze los van de overgebleven fascia-verbindingen met de darm, maag en milt.
Plaats de pancreas in een 50 milliliter conische buis en plaats deze op ijs. Incubeer de pancreas bij 37 graden Celsius volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voeg na de incubatie 20 milliliter media toe aan de buizen en dissocieer het weefsel door de buizen krachtig 40 keer in 10 seconden te schudden.
Deze stap is cruciaal voor optimale herstel van violetten. Spin cellen zijn 800 rotaties per minuut. Resus spend in 15 milliliter media en condenseer de monsters.
Giet de resuspensie door een 0.419 millimeter draadgaas en leid het in een verse 50 milliliter conische buis. Spoel de eerste buis met een extra 10 milliliter media met 10% foetaal bovien serum en giet het door het draadgaas. Pellet de cellen door centrifugatie resus, buig de pellet in vijf milliliter kamertemperatuur his opaque 10 77. Beweeg vervolgens voorzichtig voor enkele seconden, voeg een extra vijf milliliter his opaque toe rond de binnenkant van de buis om de oogjes langzaam af te wassen van de wand van de buis en pipetteer langzaam om 10 milliliter serumvrij RPMI over de zijkant van de buis met een snelheid van één milliliter per 10 seconden.
Er zou een scherpe interface zichtbaar moeten zijn. Draai vervolgens de monsters in een schommelende emmercentrifuge bij 20 graden Celsius en 900 keer zwaartekracht gedurende 20 minuten met zeer langzame versnelling en geen remmen. Na de centrifugatie worden de eilandjes gescheiden van de exocriene cellen met behulp van een wegwerpbare 10 milliliter serologische pipet. Breng de oogjes over vanuit de histo Paque-media-interface naar een verse 50 milliliter conische buis.
Meerdere buizen kunnen op dit punt worden gecombineerd om de restanten van de oogjes te verwijderen, his opaque vul buizen met serum-bevattend media en pellet
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het isoleren van eilandjes uit muizenpancreas en deze te transplanteren in de subcapsulaire ruimte van de nier. De transplantatie is bedoeld om mogelijke behandelingen voor type 1 diabetes te onderzoeken.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Transplantatiebiologie
- Diabetesonderzoek
- Isolatie van eilandjescellen
Achtergrond
- Eilandjetransplantatie is een voorgestelde behandeling voor type 1 diabetes.
- Uitdagingen zijn onder meer de behoefte aan een groot aantal eilandjes en levenslange immunosuppressie.
- Het verbeteren van transplantatieresultaten is cruciaal voor klinische toepassing.
- Muismodellen worden gebruikt om transplantatietechnieken te bestuderen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren en transplanteren van eilandjes.
- Om de functie van getransplanteerde eilandjes bij diabetische muizen te beoordelen.
- Om de chirurgische technieken die bij de procedure betrokken zijn te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van eilandjes uit muizenpancreas met behulp van enzymatische vertering.
- Transplantatie van eilandjes in de subcapsulaire ruimte van de nier.
- Bewaking van de bloedglucosespiegels bij ontvangende muizen om de functie van het transplantaat te beoordelen.
- Gedetailleerde chirurgische technieken voor het canuleren van de galgang en het isoleren van de pancreas.
Belangrijkste resultaten
- Ongeveer 250 tot 350 eilandjes kunnen binnen 24 uur de normoglukemie herstellen bij een ontvangende muis van 20 gram.
- Succesvolle canuleringstechnieken werden aangetoond voor toegang tot de galgang.
- Optimale herstel van eilandjes werd bereikt door zorgvuldige isolatie- en verwerkingsmethoden.
- Visuele demonstraties van de chirurgische stappen werden gegeven voor duidelijkheid.
Conclusies
- De studie schetst een haalbare methode voor eilandje-isolatie en -transplantatie.
- Verbeterde technieken kunnen de succeskansen van eilandjetransplantatie in klinische omgevingen verhogen.
- Er is verder onderzoek nodig om de beperkingen van huidige transplantatiepraktijken aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Islet transplantation remains constrained by donor scarcity and immunosuppression burden, limiting therapeutic scalability in type 1 diabetes. This murine model enables preclinical evaluation of islet quality, dose-response relationships, and graft function under controlled conditions. By standardizing isolation and subcapsular transplantation, the method supports mechanistic de-risking of islet-based therapies prior to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of isolated islets by assessing normoglycemia restoration in diabetic recipients.
- Operational Value: Provides a reproducible system to interrogate therapeutic hypotheses related to islet survival and engraftment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative engraftment metrics via blood glucose normalization, supporting dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes islet preparation and transplantation for consistent readouts across experimental groups.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Mimics clinical transplantation site (kidney subcapsular space) to evaluate graft viability and immune interactions.
- Operational Value: Facilitates comparison of syngeneic vs. allogeneic grafts to inform immunosuppression strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from islet isolation (lead identification) to functional assessment in diabetic models (preclinical validation), enabling iterative optimization of isolation protocols and transplantation techniques.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on islet quality and viability through functional engraftment readouts.
- Screening: Ensures assay readiness via standardized islet yield, purity, and viability metrics.
- Analytics: Enables quantitative comparison of graft function using blood glucose levels as a pharmacodynamic endpoint.
- Translational Research: Connects isolation techniques to preclinical outcomes by correlating islet dose with glycemic correction.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating novel islet protection, encapsulation, or immunomodulation strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in islet potency by linking isolation quality to in vivo function.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized enzymatic digestion, purification, and transplantation steps.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by defining minimal effective islet dose (250–350) for normoglycemia.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of islet-based candidates based on engraftment efficiency and durability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, pancreatic dissection, and cannulation techniques.
- Dependent on specialized equipment including dissecting microscope, Hamilton syringes, and swinging bucket centrifuge.
- Necessitates standardized perfusion and digestion protocols to minimize exocrine contamination.
- Involves adaptation across mouse strains and age groups to ensure consistent islet yield and quality.
- Limited by technical variability in bile duct cannulation, which directly impacts islet recovery and purity.
