Name: Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van muiseilandjes en subcapsulaire niertransplantatie. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van behandelingsstrategieën voor type 1 diabetes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door RO1 DK064938 (TH).

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Optom+Assoc%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li>
<li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes%3A+the+UIC+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li>
<li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+ATF3%2C+an+adaptive-response+gene%2C+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li>
<li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li>
<li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cyclosporin-A%2C+low-temperature+culture%2C+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
<li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li>
<li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li>
<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
<li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

In de paragrafen hierboven hebben we gedetailleerde stappen beschreven voor het isoleren en het transplanteren van de muis pancreaseilandjes. Hier hebben we even wijzen op de stappen die essentieel zijn voor het succes van de procedures. 1. Islet isolatie De belangrijkste stappen zijn het identificeren van een optimale enzymatische vertering tijd (1,4), het positioneren van de hemostaat klem over de twaalfvingerige darm opening van de ductus choledochus (2.2.3), cannulating de galbuis (2.3), heftig schudden van de alvleesklier na de 37 ° C verteren (3.2), en het verwijderen van exocriene cellen verontreiniging (3.3.7 en 3.3.16). Deze stappen hebben een dramatische invloed op de kwaliteit, opbrengst en zuiverheid van de eilandjes. Misschien wel de meest technisch uitdagende stap is het canulatie van de galbuis. In veel muizen, kan de galbuis moeilijk te visualiseren als gevolg van omringend weefsel. Daarom is het gebruikelijk dat de pogingen om canule de galbuis resulteren in de penetratie van de fascia weefsel alleen. In deze gevallen, de Liberase begint te vullen het omringende bindweefsel en niet perfuseren de alvleesklier. Indien dit zich voordoet, stop de stroom van Liberase en plaats de naald, zodat het doordringt in het lumen van de galwegen. Met de praktijk, is het mogelijk om snel de optimale positie voor de naald plaatsing en de canulatie compleet zonder beschadiging van de broze kanaal. 2. Eilandjestransplantatie De kritische stappen zijn de STZ inductie van diabetes (5,1) en de efficiënte levering van eilandjes aan de subcapsulaire zakje (5.3.14-5.3.16). STZ is een natuurlijk voorkomende glucose-analoog dat is selectief toxisch voor de insuline-afscheidende cellen β-cellen van de eilandjes 9. Echter, deze selectieve toxiciteit optreedt in een relatief smalle concentratiebereik. Dit blijkt uit het feit dat hoge doses van de STZ kan in snel (2-3 dagen) letaliteit leiden tot de afwezigheid van hyperglycemie. Daarom moet zorg worden genomen om de optimale dosis van de STZ te identificeren voor de stam en de leeftijd van muizen wordt gebruikt voor een grootschalige experimenten worden geïnitieerd. De fysieke levering van de eilandjes aan de subcapsulaire zakje is ook een belangrijke stap. Om consistente resultaten, is het noodzakelijk te beperken het verlies van eilandjes tijdens hun bevalling. Dit kan gebeuren als er defecten of scheuren in de nier capsule met betrekking tot het zakje, of als het geïnjecteerde volume is te groot. Schade aan de capsule kan worden vermeden door zachte en zorgvuldige manipulatie, en met behulp van gladde glazen sonde naar de subcapsulaire zakje voor te bereiden. Bovendien kan de injectie volume geminimaliseerd worden met een zorgvuldige verwijdering van het supernatant in stap 5.3.6.3. Als de supernatant wordt verwijderd tot op het niveau van de gesedimenteerd eilandjes, er is meestal meer dan genoeg ruimte in de subcapsulaire zakje 400 à 500 eilandjes plaatsen. Echter, als de injectie volume is te groot, de eilandjes hebben meer kans op lekken van het zakje tijdens de transplantatie proces, afbreuk te doen aan de reproduceerbaarheid van het experiment. Binnen dit protocol, is het mogelijk om een ​​aantal van de stappen te wijzigen en behaalt nog steeds bevredigende resultaten. Deze omvatten het volgende: (a) het gebruik van een ander enzym aan de alvleesklier verteren, (b) een andere methode voor het leveren van het enzym aan de alvleesklier, (c) het gebruik van een continue Ficoll-natrium-diatrizoate (FSD) gradiënt in plaats van de enkele dichtheid Histopaque1077 stap, en (d) eilandjestransplantatie naar andere plaatsen dan de nier subcapsule. <ol class="lalpha"><li> In dit protocol wordt Liberase gebruikt om de cel-cel contacten binnen de pancreas te verzwakken. Liberase is in wezen een mengsel van zeer zuivere collagenasen die nuttig is gebleken in het vrijgeven van eilandjes uit de alvleesklier. Echter, minder gezuiverd collagenasen in staat zijn om de totstandbrenging van een vergelijkbaar resultaat. Daarom is het mogelijk om verschillende commercieel beschikbare enzym-preparaten te gebruiken voor de vertering van de alvleesklier, zolang de spijsvertering voorwaarde is geoptimaliseerd voor een hoge kwaliteit te bereiken eilandje, opbrengst en zuiverheid. </li><li> Het is ook mogelijk om de alvleesklier verteren zonder ductaal perfusie van enzym. Levering van Liberase via de galbuis zorgt voor maximale blootstelling van de pancreas oppervlakte aan het enzym. Dit resulteert in een meer gelijkmatige vertering van de alvleesklier en een grotere afgifte van intact eilandjes. Echter, andere maatregelen om de oppervlakte van de alvleesklier te verhogen aan het enzym worden gebruikt. Bijvoorbeeld, kan hakken de alvleesklier alvorens incuberen in Liberase of direct injecteren Liberase door de pancreas capsule worden gebruikt om de eilandjes te isoleren. Echter, geen enkele andere methode van Liberase aflevering even effectief is als perfusie via de galbuis. Daarom moet hakken of directe inspuiting worden gereserveerd als een laatste redmiddel, als de grote galweg is beschadigd en niet perfusable. </li><li> Een alternatieve methode voor het scheiden van de eilandjes van de exocriene cellen heeft betrekking op degebruiken in plaats van een FSD helling van Histopaque1077 10. De efficiënte scheiding van eilandjes van exocriene cellen in dit protocol is gedeeltelijk te wijten aan een dichtheid verschil tussen de twee celtypen. Histopaque1077 heeft een dichtheid van 1,0771 g / ml bij 25 ° C. Bij deze temperatuur, Histopaque is dichter dan de eilandjes, maar minder dicht dan de exocriene cellen. Daarom is onder de kracht van centrifugeren, Histopaque1077 pellets de exocriene cellen, terwijl het opheffen van de eilandjes aan de oppervlakte. In principe kan elke andere stof met een dichtheid die dat kan eilandjes los van exocriene cellen die worden gebruikt in deze stap en de FSD gradiënt is een van die stof. </li><li> Met betrekking tot de locatie voor eilandjes transplantatie van de nier capsule die in dit protocol is een van de weinige mogelijke locaties. Terwijl de nier subcapsule is de meest voorkomende plaats van transplantatie in muizen, hebben andere transplantatie websites bleek te zijn effectief en zij omvatten de lever poortader, subretinale ruimte, testis, epididymale dikke pad, milt, alvleesklier en zelfs 11-14. Elk van deze locaties heeft zijn eigen voordelen en uitdagingen. Daarom moet de selectie van een site voor eilandjestransplantatie worden bepaald door de orde van de vragen en de specifieke omstandigheden van de experimenten. </li></ol> Er wordt aangenomen dat strategieën die kunnen overwinnen van de beperkingen op eilandjestransplantatie dramatisch zal het therapeutisch potentieel te verbeteren. Daarom is het gebruik van een muis model, zoals uitgeschreven door dit protocol biedt een aantrekkelijke benadering voor het identificeren van dergelijke strategieën.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Reagens</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Reagens</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillaire buisjes</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>Insulinespuit</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Naald voor spuit, 27 Gauge</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-spuit #1702</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen van 10 cm</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen van 6 cm</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad 6-0</td><td>Apparatuur</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 flexibele buisjes</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerpspuit van 5 ml</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis van 50 ml</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis van 15 ml</td><td>Apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Nylon gaas van 0,1 mm</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Draadgaas van 0,419 mm</td><td>Apparatuur</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad-incubator</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Apparatuur</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Apparatuur</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweek-incubator</td><td>Apparatuur</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>Dissectieschaar</td><td>Apparatuur</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas-schaar</td><td>Apparatuur</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>Apparatuur</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatisch pincet</td><td>Apparatuur</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan-vernevelaar</td><td>Apparatuur</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>Swing-bucket centrifuge</td><td>Apparatuur</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>Swing-bucket rotor</td><td>Apparatuur</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Apparatuur</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>Gel-laadpunten</td><td>Apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>p200 tips</td><td>Apparatuur</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

een methode voor murine islet isolatie en subcapsulaire niertransplantatie

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Sinds het begin van pionierswerk van Ballinger en Reckard waaruit blijkt dat transplantatie van eilandjes van Langerhans in de diabetische knaagdieren kunnen normaliseren van hun bloedsuikerspiegel, is eilandjestransplantatie is voorgesteld om een potentiële behandeling voor diabetes type 1 1,2 te zijn. Meer recent hebben vooruitgang in de menselijke eilandjestransplantatie verder versterkt deze visie 1,3. Echter twee belangrijke beperkingen te voorkomen dat eilandjestransplantatie dat het een wijdverbreid klinisch werkelijkheid: (a) de eis voor een groot aantal eilandjes per patiënt, die ernstig vermindert het aantal potentiële ontvangers, en (b) de noodzaak voor zware immunosuppressie, die aanzienlijk van invloed op de pediatrische populatie van patiënten als gevolg van hun kwetsbaarheid op lange termijn immunosuppressie. Strategieën die kunnen overwinnen van deze beperkingen hebben het potentieel om de therapeutische nut van eilandjestransplantatie te verbeteren. Eilandjestransplantatie onder de muis nier capsule is een algemeen aanvaard model om verschillende strategieën te onderzoeken om eilandjestransplantatie te verbeteren. Dit experiment moet de isolatie van hoge kwaliteit eilandjes en de implantatie van eilandjes aan de diabetische ontvangers. Beide procedures vereisen chirurgische stappen die beter kan worden aangetoond door de video dan door tekst. Hier hebben we het document van de gedetailleerde stappen voor deze procedures door zowel video-en geschreven protocol. We hebben ook kort ingaan op de verschillende transplantatie modellen: syngene, allogeen, syngene auto-immuunziekten, en allogene auto.

Transplantatie van geïsoleerde eilandjes is voorgesteld om een ​​potentiële behandeling voor diabetes type 1 zijn. Hier beschrijven we een methode om de eilandjes van de muis pancreata isoleren en transplantatie ze aan de subcapsulaire ruimte van de nier.

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Sinds het vroege baanbrekende werk van Ballinger en Reckard, waarin werd aangetoond dat transplantatie van langerstereilanden in diabetische knaagdieren de ... kon normaliseren,

Eilandjetransplantatie is voorgesteld als een potentiële behandeling voor diabetes type 1. Er zijn echter twee grote beperkingen die voorkomen dat dit een wijdverbreide klinische realiteit wordt. Ten eerste is er een groot aantal eilandjes per ontvanger nodig.Aangezien eilandjes van pancreasdonoren worden verkregen, is het aantal potentiële ontvangers ernstig beperkt. Een tweede transplantatie vereist een levenslange behandeling met sterke immunosuppressiva, waardoor de patiënt, en met name de pediatrische populatie, een risico loopt op maligniteiten, infecties en nierfalen. Transplantatie van eilandjes onder het nierscapsel van de muis wordt uitgevoerd om strategieën te onderzoeken voor het verbeteren van de klinische transplantatieresultaten.Eilandjes van Langerhansaanvullend geïsoleerd uit gezonde donormuizen, verdeeld in groepen en voorbereid voor transplantatie. De eilandjes worden vervolgens getransplanteerd in de subcapsulaire ruimte van de nier. Bij diabetische recipiëntmuizen wordt de functie van het eilandjegraft beoordeeld door de bloedglucosewaarden te bewaken, waaruit blijkt dat ongeveer 250 tot 350 eilandjes de glycemie herstellen in een recipiëntmuis van 20 gram binnen 24 uur na transplantatie.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel voor de stappen bij het canuleren. De ductus choledochus en de overdracht van de oogjes naar de subcapsulaire ruimte van de nier zijn moeilijk aan te leren. Deze stappen vereisen een identificatie van weefselstructuren, vaste handen en het gebruik van een techniek die weefselschade minimaliseert.Plaats een geëuthanaseerde muis in rugligging op een papieren handdoek onder de dissectiescoop en besproei de buik met 70% ethanol. Gebruik een schaar om de buikholte te openen met een V-vormige incisie vanaf de schaamstreek naar beide voorpoten. De muis bevindt zich onder de dissectiescoop.Positioneer het zodanig dat de kop naar de waarnemer is gericht. Lokaliseer de duodenale ingang van de gemeenschappelijke galgang met een hemostatische klem, de duodenale opening van de gemeenschappelijke galgang. De hemostat moet zo worden geplaatst dat deze bij compressie exact langs de grens tussen de pancreas en de darm loopt.Hier worden twee methoden voor het canuleren van de galgang gedemonstreerd: de methode met de vrije hand en de methode met ondersteuning van een pincet om de galgang te canuleren. Trek bij de methode met de vrije hand de hemostat, die op het duodenum is geklemd, weg van de kop van de muis richting de staart, zodat de gemeenschappelijke galgang strak komt te staan.Er bevindt zich een samenvloeiing in de galgang nabij de lever, waar de gal uit de galblaas en de enzymen uit de lever samenkomen. Trek de galgang strak voordat deze de darmen binnengaat, om de binnenkant van de V-positie bloot te leggen. Gebruik een gebogen 27 gauge naald bevestigd aan een spuit van 5 mL, zodat de naald recht door de V glijdt om het onderste gedeelte van de gang direct te canuleren. Schuif de naald enkele millimeters voorbij het uiteinde van de schuin geslepen punt om terugstroom naar de lever en galblaas te voorkomen.Zodra de canulatie is geslaagd, wordt de pancreas geperfuseerd door twee milliliters liase uit de spuit toe te dienen. Let op de uitzetting van de pancreas over de maag als indicatie van een optimale canulatie. Alternatief kan de galgang worden gecanuleerd.Gebruik de forceps cyst-methode. Trek de hemostat C die op het duodenum is geklemd, weg van de kop van de muis richting de staart, zodat de ductus choledochus strak komt te staan. Punctureer vervolgens, met behulp van een gebogen 27 gauge naald bevestigd aan een spuit van vijf milliliter, de fascia onder de ductus choledochus dicht bij de lever.Gebruik de naald om de fascia rond de duct vrij te maken terwijl de naald op zijn plaats blijft. Leg de hemostat neer en pak een pincet. Gebruik één arm van het open pincet om de galgang te ondersteunen op de plek waar de naald de fascia heeft vrijgemaakt, terwijl u de galgang en het pincet naar voren trekt.Schuif de naald in het kanaal met de pincet als steunpunt. Een succesvolle canulatie wordt aangegeven door een gelijkmatige uitzetting van het pancreasgebied bovenop de maag. Zodra de pancreas is geperfuseerd, verwijdert u de hemostat uit het duodenum.Gebruik vervolgens de pincet om het duodenum op te tillen en gebruik een tweede pincet om de pancreas van de darmen te scheiden. Trek daarna de pancreas los van de bovenkant van de maag en de milt. Til tot slot de pancreas uit de buikholte en snijd deze los van de resterende fasciaverbindingen met de darm, maag en milt.Plaats de pancreas in een conische buis van 50 milliliter en zet deze op ijs. Incubeer de pancreas bij 37 degrees Celsius volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voeg na incubatie 20 milliliters medium toe aan de buizen en dissocieer het weefsel door de buizen gedurende 10 seconden 40 keer krachtig te schudden.Deze stap is cruciaal voor een optimale recovery van violets. Centrifugeer de cellen bij 800 toeren per minuut. Resuspendeer het pellet in 15 milliliters medium en concentreer de monsters.Giet het resuspenderde mengsel door een draadgaas van 0,419 millimeter en vang dit op in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Spoel de eerste buis met nog eens 10 milliliter medium dat 10% foetaal runderserum bevat en giet dit door het draadgaas. Pelleteer de cellen door centrifugatie, resuspendeer het pellet in vijf milliliter Isotonic OptiPrep 10% bij kamertemperatuur. Vortex vervolgens voorzichtig gedurende enkele seconden en voeg nog eens vijf milliliter Isotonic OptiPrep toe; spoel de binnenkant van de buis om de cellen van de wand te wassen. Pipetteer langzaam 10 milliliter serumvrij RPMI langs de wand van de buis met een snelheid van één milliliter per 10 seconden om een laag aan te brengen.Er moet een scherpe interface zichtbaar zijn. Centrifugeer de monsters vervolgens in een centrifuge met zwaaibekers bij 20 °C en 900 ×g gedurende 20 minuten met een zeer trage versnelling en zonder afremming na de centrifugatie; de eilandjes worden vervolgens gescheiden van de exocriene cellen met een wegwerpbare serologische pipette van 10 mL. Breng de eilandjes van de HistoPaque-mediuminterface over naar een nieuwe conische buis van 50 mL.Verschillende buisjes kunnen op dit punt worden samengevoegd om de resterende eyelets te verwijderen, vul de ondoorzichtige buisjes met serumhoudend medium en pellet de eilandjes door de buisjes twee minuten te centrifugeren bij 800 toeren per minuut. Resuspendeer de eilandjes vervolgens in vers medium. Herhaal deze stap ten minste twee keer.Resuspendeer het pellet in vijf milliliter medium. Plaats een nylon celzeef van 0,1 millimeter ondersteboven op een conische buis van 15 milliliter. Pipetteer de geresuspendeerde celsuspensie hierdoorheen om de eyelets te verzamelen.Spoel de buis van 50 milliliter vervolgens met nog eens zes milliliter medium en laat dit door de zeef lopen. Plaats een druppel van drie milliliter medium in een Petri-schaal van 10 centimeter. Keer de celzeef om en dip deze in de druppel medium om de oogjes op te vangen; pipetteer vervolgens nog eens vijf tot zeven milliliter kweekmedium door de zeef in de Petri-schaal.Om eventuele resterende oogbekers uit de zeef te verzamelen onder een 4× objectief, worden de oogbekers individueel opgepikt met een P 200 pipette en overgebracht naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Deze afbeeldingen tonen oogbekers geïsoleerd van 12 weken oude C 57 black six muizen. De zuiverheid en kwaliteit van de oogbekers kunnen microscopisch worden geschat na voltooiing van de isolatieprocedure.De twee hier getoonde afbeeldingen laten bijvoorbeeld een representatief gezichtsveld zien waarin debris en contaminatie door exocriene cellen aanwezig zijn. Vermijd bij het selecteren van oogjes voor een experiment het kiezen van contaminerende exocriene cellen of oogjes die ongezond lijken. Oogjes met necrotische centra zijn ongezond, zoals te zien is in deze figuur die 24 uur na isolatie is genomen; necrotische centra zijn onmiddellijk na isolatie niet zichtbaar.Eilandjes die cellen afstoten zijn onvermijdelijk en kunnen worden gebruikt bij eilandjes transplantatie in deze time-lapse video van 24 uur van eilandjes. Direct na isolatie ontwikkelen zich necrotische centra in veel van de eilandjes. Deze necrotische centra lijken aan het einde van de opname uit het eilandje te worden uitgestoten tijdens het selecteren van de eilandjes.Groepeer ze zodanig dat elke buis een gelijkmatige verdeling van de kwaliteit en grootte van de oogjes heeft. Bijvoorbeeld, elke groep van 15 oogjes kan vier grote oogjes, zes middelgrote oogjes en vijf kleine oogjes bevatten. Plaats de buis op ijs; de oogjes kunnen onmiddellijk voor transplantatie worden gebruikt of verder worden bewerkt.Voor gebruik: Plaats een steriele gel-laadpunt in de opening van een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje, zodanig dat er een lichte buiging ontstaat die een U-vorm vormt in het smalle uiteinde van de punt. Beide openingen van de punt moeten recht omhoog wijzen, uit het microcentrifugebuisje.Haal voorzichtig een buisje met eyelets uit het ijs. Controleer of alle eyelets naar de bodem van het buisje zijn gezakt. Verzamel de eyelets voorzichtig in een minimaal volume vanaf de bodem van het buisje met een P 200 pipet en breng ze over naar de voorbereide gebogen tip.Nadat de eilandjes zijn bezonken, verwijdert u zoveel mogelijk medium uit de tip door het medium te aspireren via de grote opening van de gel-laadtip die de eilandjes bevat met een nieuwe gel-laadtip bevestigd aan een P 200 pipette. Bevestig het niet-afgeschuinde uiteinde van de slang aan de smalle opening van de gel-laadtip met de eilandjes. Bevestig vervolgens de tip aan een P 200 pipette en duw de eilandjes voorzichtig in de slang.Sluit vervolgens de niet-afgeschuinde zijde van de PE 50-buis aan op de naald van een Hamilton-spuit van 25 µL. Trek de zuiger naar buiten en druk vervolgens op de zuiger van de spuit totdat de oogjes zich op ongeveer 0,5 cm van de afgeschuinde opening bevinden. Zet de spuit opzij zodat de oogjes kunnen samensmelten tot één massa nabij de afgeschuinde opening van de buis, terwijl de nier wordt voorbereid op de ontvangst van de oogjes.Bereid de operatielocatie voor door het haar weg te knippen en de huid drie keer afwisselend te scrubben met Betadine en 70% isopropyl alcohol. Begin de oogjes-transplantatieprocedure door een knijptest bij de teen uit te voeren om de anesthesie bij de recipiënte muis te bevestigen. Plaats de schacht van een glazen staafje direct onder de muis en onder de nier, loodrecht op het ruggenmerg.Lokaliseer vervolgens de nier door de huid en breng een steriel chirurgisch afdekdoek aan. Zodra de nier is gelokaliseerd, gebruik je McFerson-banis-scharen om een incisie van twee centimeter door de dermis te maken, direct boven de nier en loodrecht op het ruggenmerg. Met de schaar wordt door deze incisie de peritoneale wand blootgelegd.Maak een incisie van één centimeter door de peritoneale wand in dezelfde richting als de snede door de dermale laag, waarbij de schacht van de glazen staaf als steun wordt gebruikt; duw de nier door de peritoneale opening door op het aangrenzende oppervlak te drukken. Bevochtig het oppervlak van de blootgelegde nier met ijskoud, steriel PBS met behulp van een gedrenkte wattenstaaf. Herhaal deze stap elke paar minuten indien nodig om te voorkomen dat het nierkapsel uitdroogt.Maak met een naald van 27 gauge een incisie van 0,2 centimeter door het niersuccapsel over het anterieure oppervlak van de nier. Voer een vlamgetrokken glazen capillaire buis in, waarbij u zich van de linkerlaterale zijde naar de rechterlaterale zijde beweegt. Sondeer door de eerder gemaakte incisie en beweeg de buis in posteriore richting langs het dorsolaterale oppervlak van de nier.Om een zakje tussen het nierscapsule en het nierparenchym te creëren, verschuift u de oogjes in de voorbereide 25 milliliter Hamilton-spuit naar de uiterste rand van de schuine opening van de flexibele buis. Voer vervolgens de schuine rand met de opening naar boven in het subcapsulaire zakje in. De lange rand is in contact met het nierparenchym.Verplaats de tube naar het meest posterieure uiteinde van het kapsel. Breng vervolgens de oogjes langzaam van de PE 50 tube over naar de subcapsulaire pouch door de plunjer van de spuit in te drukken. Terwijl de oogjes de pouch vullen, trekt u de flexibele tube langzaam terug om meer ruimte te maken.Nadat de buis uit het zakje is verwijderd, schuift u de glazen probe langs het buitenoppervlak van de nier van anterieur naar posterieur om de oogjes voorzichtig in het proximale uiteinde van het zakje te duwen. Til met een gebogen pincet het peritoneale voering op naast de opening die voor de nier is gemaakt. Gebruik vervolgens een met PBS gedrenkte wattenstaaf om de nier voorzichtig terug in de peritoneale holte te duwen.Sluit de muis door hechtingen aan te brengen in de peritoneale wand en wondclips in de dermale laag. Plaats de muis terug in de kooi en monitor deze. Voor het herstel moet aceto-meine water worden aangeboden voor de darmen van de muis.Geïsoleerde oogleden van C-muizen. Met behulp van de in deze video beschreven methoden werd een curatieve dosis getransplanteerd in allogene C 57 black six-muizen. De nuchtere bloedglucosewaarden werden gemonitord vanaf de eerste postoperatieve dag.Afstoting is waarneembaar rond dag 17 bij recipientmuizen van 20 gram die 300 eilandjes ontvingen van een allogene donor Hier. Het herstel werd gemonitord bij muizen die ofwel 150 eilandjes ofwel 300 eilandjes ontvingen van syngene donors. Bij deze transplantaties wordt geen afstoting waargenomen, aangezien de eilandjes afkomstig zijn van syngene donors.De toegediende dosis eilandjes meet de primaire functie van de eilandjes direct na transplantatie. Hoewel bij 150 eilandjes een marginaal herstel werd waargenomen, trad een volledig herstel op wanneer 300 eilandjes werden getransplanteerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van de kritieke stappen die nodig zijn om muiseilandjes te isoleren en deze eilandjes onder de subcapsulaire ruimte van de nier te transplanteren.Met oefening zult u het vermogen ontwikkelen om de ductus choledochus snel te canuleren, wat de moeilijkste stap van dit protocol is.

a-method-for-murine-islet-isolation-subcapsular-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van muizen. Cellen zijn geconcentreerd in pellets in de finale slangen worden gebruikt voor het transplanteren van de cellen onder de nier capsule. Het gemak van deze techniek vermindert de belasting van de cellen en de muis.

Transplantatie van pancreaseilandjes Into the Kidney Capsule van diabetische muizen

Niertransplantatie bij muizen is een technisch uitdagend procedure die een zorgvuldige postoperatieve zorg en behandeling voor succes vereist.

Murine niertransplantatie Procedure

In this video, we describe a procedure to infuse pancreatic islet cells into the hepatic portal vein, followed by application of gel foam to successfully prevent bleeding. Postoperative bleeding is a common cause of high mortality during islet transplantation.

Murine Model of Islet Transplantation: A Surgical Method to Infuse Pancreatic Islets in Portal Vein and Prevention of Postoperative Bleeding

Een nieuwe benadering van het combineren van de intra-oculaire transplantatie en confocale microscopie maakt longitudinale, niet-invasieve real-time beeldvorming met single-cell resolutie binnen geënt...

Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming met Single-cell resolutie in real-time

Het doel van dit manuscript is om de stappen te beschrijven die nodig zijn om een niertransplantatie uit te voeren bij een muis, met bijzondere aandacht voor de details van de arteriële anastomose.

Muizen Niertransplantatie Techniek

Dit protocol demonstreert het isoleren van muizen eiland en zaait op een decellularized steiger. Steigergesteunde eilandjes werden getransplanteerd in het epididymale vetpaneel van streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische muizen. Islets overleefden op de transplantatieplaats en reverseerde de hyperglycemische conditie.

Steiger-gesteunde transplantatie van eilanden in het epididymale vetpaneel van diabetische muizen

Een methode voor de omental transplantatie van de eilandjes in een muis is ingevoerd. De geïsoleerde eilandjes met hydrogel zijn gemengd en het mengsel wordt geplaatst in de omental etui van een diabetische muis. Vervolgens de bloedglucose wordt gecontroleerd en immuno-histochemische analyse wordt uitgevoerd.

Een methode voor Islet transplantatie aan de majus in muis

Alvleesklier islet transplantatie is een manier om normoglycemia bij type 1 diabetes. Dit artikel richt zich op de transplantatie-techniek via de intraportal route om normale glucoseniveaus in diabetesmuizen te handhaven.

Intraportal transplantatie van de alvleesklier eilandjes in Mouse Model

Wij bieden een eenvoudige en efficiënte methode voor het transplantatie van 2 '-deoxyguanosine behandeld E 18.5 Thymus in de niercapsule van een naakt muis. Deze methode moet worden assistent in de studie van zowel Thymus epitheliale cellen functie en T-cellen rijping.

Renale Subcapsulaire transplantatie van 2 '-Deoxyguanosine-behandelde Muriene embryonale Thymus in naakt muizen

In dit protocol wordt een methode van murineeilandisolatie en transplantatie in het inguinal onderhuids wit vetweefsel beschreven. Geïsoleerde synogenische murine eilandjes worden getransplanteerd in een murine ontvanger met behulp van een kelder membraan hydrogel. De bloedsuikerspiegel van de ontvangers wordt gecontroleerd en de histologieanalyse van de levensperie-transplantaties wordt uitgevoerd.

Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van muiseilandjes en subcapsulaire niertransplantatie. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van behandelingsstrategieën voor type 1 diabetes.

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Meer video's verkennen