Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Onze visuele ervaring begint wanneer het visuele pigment in onze retinale fotoreceptoren fotonen van lichtenergie absorbeert, wat uiteindelijk leidt tot het sluiten van cyclische nucleotide-gereguleerde kanalen in het celmembraan. Dit onderdrukt de afgifte van de neurotransmitter glutamaat uit zowel staven als kegeltjes. Het vrijgekomen glutamaat wordt gevoeld door downstream retinale cellen om de downstream signalen te bestuderen.

De ogen worden verwijderd van een geëuthanaseerd muis. De S worden geïsoleerd, ingebed in een agarblok en gesneden met behulp van een vibrerend microtoom. Vervolgens worden de retinale plakken onder een microscoop geplaatst en gestimuleerd met LED-verlichting.

Terwijl patch clamp-opnamen worden gemaakt om de synaptische stromen of potentialen te meten die worden gegenereerd. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de toegevoegde complexiteit van het werken in het donker. Dus in staat zijn om het hele proces te visualiseren, zal een gevoel bieden dat anders moeilijk te beschrijven is.

Begin deze procedure door de opname- en referentiedraadelektroden die zullen worden gebruikt, te coaten met een laag zilverchloride. Dompel de elektroden in één molaire natriumchloride. Gebruik vervolgens een 15 volt voedingsbron met een één hertz sinusgolfaandrijving van 15 volt tussen hen gedurende ongeveer 20 seconden.

Gebruik een micro pipet puller om patch pipetten te bereiden van met vuur gepolijst BO silicaglas, kies een pipettipweerstand op basis van de grootte van de doelcellen voor cellichamen van ongeveer 20 micron in diameter. Gebruik een pijp PET met een tipweerstand van vijf tot 10 mega ohms voor cellichamen. Na ongeveer vijf micron in diameter, gebruik een tipweerstand van 12 tot 15 mega ohms.

Gebruik een spuit om polyethyleen buisjes te vullen met een 3,5% agar-oplossing bereid in één millimolair natriumchloride om de grondreferentie-elektroden voor te bereiden. Bereid vervolgens de volgende oplossingen volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke protocol voor. Externe badoplossing snijoplossing, kalium aspartaat pipet interne oplossing en de agar tegenhouder.

Bewaar alle oplossingen bij vier graden Celsius totdat ze nodig zijn. Op de dag van het experiment, giet Thor ongeveer 1,5 milliliter kalium aspartaat interne oplossing. Voeg vervolgens verdund Fluor toe.

Giet ongeveer 50 milliliter van aims media met natriumbicarbonaat in de lichtdichte opslagcontainer. Verbind de plastic slang met een gastank met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof om de aims media met het gas in evenwicht te brengen, en plaats vervolgens de container in een 30 tot 32 graden Celsius waterbad. Vul vervolgens een fles met 110 milliliter aims medium dat de erwten bevat en plaats deze op ijs.

Breng het medium in evenwicht door de oplossing te bebellen met 100% zuurstofgas. Plaats de resterende aimes medium met natriumbicarbonaat in een verwarmd reservoir bovenop de Faraday-kooi. Wikkel paraform rond de buis en flesdeksel om gas in de ruimte boven de oplossing te vangen en in evenwicht te brengen met 5% koolstofdioxide, 95% zuurstofgas.

Gebruik een glazen luchtdispersiebuis om 3% laag smelttemperatuur aros voor te bereiden door 0,75 gram toe te voegen aan 25 milliliter aims medium met hoop hitte. De oplossing is ongeveer 115 graden Celsius tijdens het roeren. Wanneer de oplossing helder wordt zonder bubbels, plaats de gesmolten agaroplossing in een waterbad van 42 graden Celsius.

Stel de opnamekamer in op de omgekeerde microscoop. Schuif een vijf centimeter agarbrug over de zilveren, zilverchloride referentie-elektrode en plaats deze in de opnamekamer. De weerstand van de pipettip kan worden gemeten door een pipet te vullen met interne oplossing, deze op de pipethouder te plaatsen, de pipethouder in de versterker hoofdfase te plaatsen en de pipet in oplossing te laten zakken om het visuele pigment te behouden voor fysiologische opnamen, alle procedures moeten worden uitgevoerd onder infraroodlicht met behulp van infraroodbrillen, maar alle procedures zullen hier in kamerlicht worden getoond.

Nadat de muis is geëuthanaseerd, gebruik gebogen schaar om snel de ogen te verwijderen. Plaats de ogen op een stuk filterpapier om te voorkomen dat ze rollen. Houd vervolgens een oog op zijn plaats met een pincet en gebruik een dunne dubbelzijdige kling om een snede in het hoornvlies te maken.

Zodra het oogbol is doorboord. Breng het oog over in een 60 millimeter petrischaal gevuld met aims medium. Gebruik de snede in het hoornvlies als toegangspunt, gebruik kleine schaar om de resterende delen van het hoornvlies weg te snijden.

Verwijder vervolgens de lens en het glasvocht, zorg ervoor dat het netvlies aan de oogbeker blijft vastzitten. Plaats het in een lichtdichte container gevuld met aims. Medium geëgaliseerd met 5% koolstofdioxide in 95% zuurstof bij 32 graden Celsius.

Volgende hemis sec. Een van de oogbekers met behulp van een nummer 10 scalpelmes. Scheid het netvlies van het retinale pigmentepitheel.

Verwijder de randen van het netvlies om het weefsel plat te laten liggen. Gebruik kleine glazen pastapipetten met een latex bulb om een 35 millimeter petrischaal te vullen met gesmolten lage gele temperatuur agar en sleep de pincet door de agar om de consistentie te testen. Zodra de agar begint te stollen, breng het netvlies over naar de bovenkant van de agar.

Gebruik vervolgens zonder het netvlies aan te raken, een verdraaid stuk Kim-doek om de overtollige oplossing eromheen te absorberen. Plaats nog twee tot drie druppels agar rechtstreeks op het netvlies en plaats snel een plastic cilinder om een muur eromheen te vormen terwijl de retina nabij het midden van de cilinder wordt gehouden. Druppel extra gesmolten agar in, breng de petrischaal over in een ijswaterbad om af te koelen. Verwijder na 30 seconden het weefsel en gebruik een plunjer om de agarblok te extruderen, vanaf de kant die het verst van het netvlies verwijderd is.

Gebruik een eenzijdige scheermes om een klein blokje agar uit te sn