Name: Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer patch clamp-opnamen van donker aangepaste muizenretina's met deze gedetailleerde methode. Isolatie, agar-inbedding en vibratiemicrotomie maken elektrofysiologische metingen van lichtgeëvoceerde synaptische stromen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY17606 (APS).

1. Voorbereiden Elektroden <ol><li> Bereid de opname-en referentie-elektroden door dompelen ze beide in 1 M NaCl en het rijden 15V tussen ze met behulp van een 1 Hz sinusgolf voor ~ 20 s. </li><li> Maak de registrerende elektroden met behulp van een micropipet trekker (Sutter Instrumenten P-97). Voor de patch-pipetten gebruiken een borosilicaatglas met een buitendiameter van 1,2 mm en een inwendige diameter van 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Meet de serie weerstand via de punt van de elektrode. Op basis van de grootte van de doelcellen kies een pipet tip diameter, voor de cellichamen ~ 20 micrometer in diameter gebruik ~ 5 MΩ voor cellichamen ~ 5 micrometer in diameter gebruik ~ 12 MΩ. </li><li> Bereid de grond / referentie-elektroden. Behulp van een injectiespuit te vullen een klein gedeelte polyethyleen buis (Intramedic, PE205) met 1 mM NaCl, dat 3,5% Agar bevat (Sigma, Cat # A7002) in 1 M NaCl. Plaats deze agar brug over de Ag / AgCl referentie-elektrode. </li></ol> 2. Voorbereiden Solutions <ol><li> Externe bad oplossing, Ames 'media die Bicarbonaat (1 L): 1 fles van Ames' Medium (Sigma, Cat # A1420), 1,9 g NaHCO 3, 7 ml penicilline-streptomycine (Sigma, Cat # P0781) om te voorkomen dat bacteriën groei. Stel osmolariteit tot ~ 280 mOsm. </li><li> Snijden oplossing, Ames 'media die de pH buffer HEPES (1 L): 1 fles van Ames' Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 ml penicilline-streptomycine. Breng de pH op 7,4 met behulp van ~ 1M NaOH en / of 1M HCl. Stel osmolariteit tot ~ 280 mOsm. </li><li> Kalium-aspartaat (K-Asp) pipet interne oplossing (in mm): 125 K-aspartaat, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl 2, een ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH wordt aangepast aan ~ 7.3 met NMG-OH, en de osmolariteit wordt aangepast aan ~ 280 mOsm. </li><li> Agar backstop voor het stabiliseren van een lage temperatuur gelering agarose met het netvlies (5% van het gewicht), 7,5 g agar (Sigma, Cat # A7002), gesmolten in 150 ml dH 2 O. </li></ol> 3. Dag van Experiment <ol><li> Dooi ~ 1,5 ml K-Asp interne oplossing en de fluorofoor van uw keuze uit de vriezer. Verdun de fluorofoor naar de juiste concentratie, die empirisch moeten worden bepaald. </li><li> Giet Ames 'media met NaHCO 3 (~ 200 ml) in de lichtdichte opslagcontainer en plaats in het waterbad (30-32 ° C) en evenwicht met 5% CO 2 / 95% O 2 gas </li><li> Vul de fles met ca. 110 ml van Ames 'media met HEPES, plaats op ijs en evenwicht met 100% O 2. </li><li> Leg de rest van Ames 'media met NaHCO 3 in een verwarmde reservoir boven op de kooi van Faraday, en evenwicht met 5% CO 2 / 95% O 2 gas. Parafilm kan worden gebruikt om het gas val in de ruimte boven de oplossing. </li><li> Bereid de lage temperatuur geleermiddel agarose (3%) door de toevoeging van 0,75 g (Sigma, Cat # A0701) tot 25 ml van Ames 'media met HEPES en warmte van de oplossing bij ~ 115 ° C om de agarose smelten. Roer tot de oplossing helder, zonder bubbels, en op te slaan in een waterbad (~ 42 ° C). </li><li> Vul een opname pipet met de K-Asp interne oplossing en controleer de tip weerstand. </li></ol> 4. Begin Experiment <ol><li> Euthanaseren de muis en snel te verwijderen van de ogen met behulp van gebogen schaar. Infrarood bril moet worden gebruikt voor alle procedures om te voorkomen dat bleken van de visuele pigment. </li><li> Zet de ogen op een stuk filtreerpapier om te voorkomen dat rollen, en het gebruik van een dunne dubbelzijdige mes, maak een spleet in het hoornvlies terwijl het oog met de tang. </li><li> Zodra de oogbol is geperforeerd, transfer ze oog in een schaal gevuld met Ames 'media. </li><li> Met behulp van de spleet in het hoornvlies als een entry point, zijn kleine schaar gebruikt om weggesneden de overige delen van het hoornvlies, waarna de lens en het glasvocht verwijderd kan worden. Zorg ervoor dat het netvlies blijft verbonden aan de oogklep, en bewaar de oogschelp in het donker bij 32 ° C in Ames 'media in evenwicht gebracht met 5% CO 2 / 95% O 2. </li></ol> 5. Snijden <ol><li> Hemisect een van de oogschelpen en dissocieren het netvlies van de retina pigment epitheel. Verwijder de randen van het netvlies, zodat het weefsel om plat te liggen. </li><li> Gebruik een kleine glazen Pasteur pipet met een latex lamp aan een 35 mm petrischaal met gesmolten agar te vullen, en sleep de tang dwars door het agar om de consistentie te testen. </li><li> Wanneer je kunt beginnen te zien van de agar stollen: <ol class="lalpha"><li> Overdracht van het netvlies naar de top van de agar. </li><li> Gebruik een verdraaid stuk Kimwipe om de overtollige oplossing te absorberen rond het netvlies. </li><li> Plaats 2-3 druppels van Agar direct op het netvlies en snel een plastic cilinder plaats over het netvlies een muur omheen te vormen. Dan druppelen extra gesmolten agar aan de zijkanten van de kunststof cilinder, terwijl het centreren van het netvlies in het agar. </li><li> Breng de petrischaal to een ijswaterbad om af te koelen. </li></ol></li><li> Na ~ 45 seconden verwijdert het weefsel van het ijs waterbad en gebruik een zuiger voor de extrusie van de agar uit blok van de kunststof cilinder, duwen van de kant die het verst van het netvlies. </li><li> Gebruik de eenzijdige scheermesje te snijden een kleine blok van agar met het netvlies en het blok secondelijm op zijn plaats tegen de agar terugloopblokkering op het monster disc. </li><li> Het analysemonster disc naar de vibrerende microtoom lade en giet ijskoud Ames HEPES in de lade zodat het blok met netvlies volledig worden ondergedompeld. </li><li> Netvlies plakken met een dikte van ~ 200 urn kan worden gesneden bij de maximale mes trillende snelheid en een voorwaartse bladsnelheid zodanig ingesteld dat het 4 tot 5 seconden duurt om dwars door het netvlies van elke plak. </li><li> Gebruik een nr. 11 scalpel op elk plakje een bruikbaar te verwijderen op een moment </li><li> Goede schijfjes bevatten netvlies worden geplaatst in het opnemen van kamers en worden gewogen neer met slice ankers met nylon draden kruisen. De nylon draden houd de agar rond het netvlies, waardoor het netvlies vrij voor de opnames. </li><li> Breng de opname kamer tot de fase van de rechtopstaande microscoop, sluit het gordijn en zet de infrarood lichtbron om de slice visie op een infrarood-gevoelige camera. </li></ol> 6. Opname <ol><li> Zodra een goede netvlies slice (met intacte fotoreceptoren en de juiste snijhoek) wordt geïdentificeerd beginnen perfuseren het netvlies met een snelheid van meer dan 5 ml / min met een verwarmd Ames 'media die is verwarmd tot 35 37 ° C en in evenwicht met 5% CO 2 / 95% O 2. </li><li> Sommige beschadigingen van het oppervlak kan worden duidelijk als gevolg van het snijden proces. Dit meestal dunne laag van cellen kan worden verwijderd met behulp van een pipet met een gebroken tip, en voorzichtig wegzuigen de dode cellichamen. Dit zal meestal onthullen levende cellen eronder. Identificeer een gezonde cel lichaam waarvan de positie is gelegen in de lagen van belang. </li><li> Vul een micropipet met de KAsp interne oplossing en toe te passen positief (naar buiten) druk door de punt van de pipet, en laat de punt van de pipet in de opname kamer en tot op het niveau van de cel met behulp van een micromanipulator. </li><li> Verplaats de pipetpunt zodanig dat het de celmembraan kuiltjes, en zachtjes negatief (naar binnen) druk om een ​​hoge weerstand afdichting te maken. Whole-cell-modus kan worden bereikt door toepassing van negatieve druk op de elektrode in te breken in de cel. </li><li> Het stimuleren van de retinale weefsel met behulp van LED's kunnen dan roepen reacties op licht. </li><li> Foto van de cel van waaruit de opname is gemaakt door oproepen van fluorescentie van de fluorofoor in de pipet interne oplossing. </li></ol> 7. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Hier, licht-evoked potentials van een donker aangepaste netvlies neuron tot flitsen van het licht van de toenemende kracht worden getoond. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Fluorescentie afbeelding van een schijfje waar de retina cellen zijn gevuld met de fluorofoor, Lucifer Yellow. Evoked fluorescentie toont de morfologie van de cellen waaruit patch opnamen zijn gemaakt.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

Snijd de opname van gewervelde netvliezen zijn gemaakt voor tientallen jaren 1,2, en zijn redelijk succesvol in het verstrekken van een dieper begrip van hoe de retinale circuits codeert invallende licht. De voordelen van het snijden met een trillende microtoom in plaats van rechtstreeks met een scheermesje is dat het netvlies plakken minder schade aan het oppervlak oplopen. Met een zuigkracht pipet is het gemakkelijk te verwijderen deze schade en doel gezonde cellen net onder de oppervlakte die hun connectiv...

<table><tbody><tr><td>Micropipetpuller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenslangen</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose met lage gellingtemperatuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Ames&amp;rsquo; Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp opnamen van mouse retinal neuronen in een donker aangepaste slice voorbereiding

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Onze visuele ervaring wordt gestart wanneer de visuele pigment in ons netvlies fotoreceptoren fotonen van licht energie absorbeert en initieert een cascade van intracellulaire gebeurtenissen die leiden tot sluiting van cyclisch-nucleotide-gated kanalen in het celmembraan. De resulterende verandering in de membraanpotentiaal leidt weer tot vermindering van de hoeveelheid van de neurotransmitter release van zowel de staafjes en kegeltjes synaptische terminals. Om te meten hoe het licht opgewekte verandering in fotoreceptor membraanpotentiaal leidt tot downstream activiteiten in het netvlies, hebben wetenschappers gemaakt elektrofysiologische opnames van het netvlies slice de voorbereidingen voor tientallen jaren 1,2. In het verleden zijn deze schijfjes zijn hand gesneden met een scheermesje op het netvlies weefsel dat wordt gehecht aan papieren filter, in de afgelopen jaren een andere methode van in plakken snijden is ontwikkeld, waarbij het netvlies weefsel is ingebed in een lage temperatuur gelering agar en in plakjes gesneden op een koele oplossing met een trillende microtoom 3,4. Deze voorbereiding maakt het netvlies plakken met minder beschadiging van het oppervlak en zeer robuust licht-geëvoceerde responsen. Hier hebben we document hoe deze procedure kan worden gedaan onder infrarood licht om te voorkomen dat het bleken van de visuele pigment.

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Onze visuele ervaring begint wanneer het visuele pigment in onze retinale fotoreceptoren fotonen van lichtenergie absorbeert en een cascade in gang zet van ...

Onze visuele ervaring begint wanneer het visuele pigment in onze retinale fotoreceptoren fotonen van lichtenergie absorbeert, wat uiteindelijk leidt tot de sluiting van cyclisch nucleotide-gestuurde kanalen in het celmembraan. Dit onderdrukt de afgifte van de neurotransmitter glutamaat door zowel staafjes als kegeltjes. Het vrijgekomen glutamaat wordt waargenomen door stroomafwaartse retinale cellen om de stroomafwaartse signalen te bestuderen.De ogen worden verwijderd uit een geëuthanaseerde muis. De S worden geïsoleerd, ingebed in een agarblok en gesneden met een vibrerende microtoom. Vervolgens worden de retinaalplakjes onder een microscoop geplaatst en gestimuleerd met LED-verlichting.Tijdens dit proces worden patchclamp-metingen uitgevoerd om de gegenereerde synaptische stromen of potentialen te meten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de extra complexiteit van het werken in het donker. Het kunnen visualiseren van het gehele proces geeft daarom een gevoel dat anders moeilijk te beschrijven is.Begin deze procedure door de registratie- en referentiedradelektroden die gebruikt zullen worden te voorzien van een laag zilverchlor

patch-clamp-recordings-from-mouse-retinal-neurons-dark-adapted-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Leer patch clamp-opnamen van donker aangepaste muizenretina's met deze gedetailleerde methode. Isolatie, agar-inbedding en vibratiemicrotomie maken elektrofysiologische metingen van lichtgeëvoceerde synaptische stromen mogelijk.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Meer video's verkennen