Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 ^Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Axonaal transport kan worden bestudeerd door de segmentale zenuwen van de larve te visualiseren. Een derde instar Drosophila. De larve wordt eerst gedisseceerd, waarbij het CZS wordt blootgelegd zonder de optische lobben, het ventrale ganglion en de segmentale zenuwen te beschadigen.

De tweede stap van de procedure is het fixeren van de lava in formaldehyde vóór incubatie met het primaire antilichaam gedurende de nacht en het secundaire antilichaam gedurende een uur in het donker. De lava wordt vervolgens op een glazen objectglas gemonteerd om defecten in het axonale transport, de eiwitlokalisatie en de eiwitdistributie te onderzoeken via immunofluorescentiemicroscopie.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in axonaal transport, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals synaps- en spiermorfologie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het in het begin lastig is om deze toegestane dissectie uit te voeren, vooral om de segmentale zenuwen en spieren van het brein intact te houden. Bereid ter start van deze procedure een eenmalige dissectiebufferfixatief, een eenmalige PBT en een 5% BSA-oplossing voor.

Verzamel, zoals gespecificeerd in de tabel voorafgaand aan de dissectie, een schoon paar biceps nummer vijf, een schoon paar scharen met recht blad en spelden om met de dissectie te beginnen; gebruik een microlepel om zwervende derde stadiumlarven met een specifiek genotype op een Petrischaal te verzamelen. Was de larven vervolgens door ze te spoelen in een Petrischaal gevuld met gedeïoniseerd water om alle voedselresten te verwijderen.

Plaats vervolgens een larve met de rugzijde naar boven op de S guard-schaal. Zet de larve aan de voor- en achterzijde vast met spelden. Breng met een fijne pipet een druppel van de eenmalige dissectiebuffer aan op de vastgezette larve.

Knip de lava op de dorsale middellijn nabij het posterieure uiteinde door. Snijd met de schaar de lava-cuticula vanaf het posterieure uiteinde tot aan het anterieure uiteinde open. Plaats een druppel nieuwe 1x dissectiebuffer op de gedissecteerde lava.

Pak met een speld een laterale rand van het exoskelet vast nabij het midden van de larve en zet het exoskelet vast met een tweede speld. De tweede laterale rand van het exoskelet; er worden twee spelden gebruikt aan elke laterale zijde, zoals weergegeven in het diagram. Verwijder nu voorzichtig de darm, de vetlichamen en de trachea, zodat alleen de hersenen met de twee optische lobben en ventrale ganglia overblijven.

Nadat de segmentale zenuwen zijn vastgezet, worden de fixatie en antilichaamkleuring uitgevoerd terwijl de larven aan het bewakingsschaaltje zijn bevestigd. Incubeer de gedissekeerde larven in 50 µL fixeerder gedurende 30 minuten. Vervang de fixeerder elke 15 minuten. Spoel de larven na de fixatie gedurende 30 minuten in 1× PBT.

Bij het elke 10 minuten vervangen van de buffer is het belangrijk op te merken dat de larven altijd in de buffer ondergedompeld moeten blijven. Bereid de primaire antilichaamoplossing voor door deze te verdunnen tot de juiste concentratie in de 5%BSA-oplossing. Optimale concentraties verschillen per antilichaam.

Construeer een bevochtigingskamer door een plastic schaal te bekleden met water-doordrenkt Kimwipe-papier.

Spoel af met de bereide primaire antilichaamoplossing en incubeer in de bevochtigingskamer bij vier graden Celsius gedurende de nacht tot de volgende dag. Spoel de gedissekeerde larven 30 minuten lang in één keer PBT door de buffer elke 10 minuten te vervangen. Bereid het secundaire antilichaam voor door het te verdunnen tot de juiste concentratie in de 5% BSA-oplossing.

Wikkel de bevochtigingskamer in folie, aangezien sommige secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn. Incubeer de larven met de secundaire antilichaamoplossing gedurende een uur bij 25 °C. Wanneer de incubatie met het secundaire antilichaam is voltooid, spoel de larven gedurende 30 minuten in 1x PBT door de buffer elke 10 minuten te vervangen, en ga vervolgens over tot het prepareren en visualiseren van de gedissekeerde larven voordat de larve op het objectglas wordt geplaatst.

Bereid het objectglas voor door in het midden twee verticale lijnen nagellak aan te brengen, met een tussenruimte die groot genoeg is voor een dekglas, zoals in het diagram wordt getoond. Laat de nagellak volledig drogen. Plaats een druppel monteerbuffer in de ruimte tussen de verticale nagellaklijnen op het objectglas, zoals in deze afbeelding wordt getoond.

Het preparaat is nu klaar om te worden gemonteerd. Haal de larven uit de PBT na de laatste incubatietijd. Spoel ze af en verwijder voorzichtig de zijdelingse pinnen uit een larve.

Zorg ervoor dat de cuticula niet wordt gescheurd. Verwijder de twee resterende pinnen, pak de larve met een pincet op en plaats deze op het voorbereide preparaatglas. Zorg ervoor dat de larve niet is omgedraaid en ventraal georiënteerd is.

Plaats voorzichtig met de zijkant naar boven een dekglas erop en kit de randen af met nagellak, zoals hier geïllustreerd. De larven zijn nu klaar voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop. Deze representatieve afbeelding is van een wild-type larve, gekleurd met antilichamen tegen het synaptische blaasjes-eiwit, cystine string protein.

De segmentale zenuwen van de lava zijn gelijkmatig gekleurd. Hier is een motor-eiwitmutant lava gekleurd met antilichamen tegen CSP. De segmentale zenuwen vertonen massale accumulaties die fel kleuren voor CSP.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de segmentale zenuwen die aan de hersenen vastzitten te behouden en de spieren intact te houden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u moet dissekeren. Fixeer een immunostain third en start larvale segmentale zenuwen om axonaal transport te bestuderen met behulp van een fluorescentiemicroscoop.