Name: Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer klasse-switch recombinatie in gezuiverde milt-B-cellen te induceren en analyseren met LPS-stimulatie en flowcytometrie. Deze methode biedt inzicht in B-celimmuniteit en antilichaamproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de Martin laboratorium voor nuttige discussies. Deze publicatie wordt ondersteund door een subsidie ​​van het Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM wordt ondersteund door een Canada Research Chair Tier II Award.

Stap I: Isolatie van milt B-cellen via magnetische verrijking <ol><li> Experimentele muizen moet worden leeftijd van 8-12 weken op volle rijping van het immuunsysteem te verzekeren. </li><li> Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en genieten in 70% ethanol. Chirurgisch te verwijderen van de milt door het maken van een incisie door de huid en spieren van de linker hypochondrium van de buik en snijd het in drie grote stukken in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorg ervoor dat alle instrumenten en reagentia steriel zijn. </li><li> Met behulp van de rubber einde van een 1 ml zuiger, de milt zachtjes beslag door een 70 um cel zeef in PBS. Zorg ervoor dat u een duwende beweging in plaats van een vermalen beweging te gebruiken als slijpen kan leiden tot scheuren van grotere (dwz prolifererende) cellen. </li><li> Spin down de cellen op niet meer dan 350 g gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in PBS. Tel de geresuspendeerd cellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Maak een suspensie van 1x10 8 cellen / ml in PBS met 5% normaal serum rat in een steriele 5 mL polystyreen buis met een kap (maximaal volume van 2 ml per buis). </li><li> Voeg 50 ul van EasySep negatieve selectie Mouse B Cell Enrichment cocktail voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 100 ul EasySep Biotine Selectie Cocktail voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 100 ul van EasySep magnetische nanodeeltjes (zorgen voor nanodeeltjes worden goed gemengd en de oplossing homogeen is) voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 5 minuten. </li><li> Top de oplossing voor 2,5 ml met PBS en plaats het in een EasySep magneet voor 5 minuten. Omkeren van de magneet en buis en giet al snel in een nieuwe polystyreen buis. Schud de buis als negatief geselecteerde cellen zullen magnetisch gebonden zijn aan de buis muren. </li><li> Verder te verhogen de zuiverheid van de celsuspensie, kan de buis worden opnieuw in de magneet voor een extra 5 minuten en gegoten in een nieuwe buis. Dit kan verminderen de totale cel herstel. </li><li> B-cel zuiverheid kan worden beoordeeld door flowcytometrische analyse van het B-cel oppervlakte markers. Na de verrijking, we voortdurend zien met een zuiverheid van&gt; 95% B220 positieve cellen. </li></ol> Stap II: CFSE cel verkleuring <ol><li> Resuspendeer de geïsoleerde cellen in warme PBS aangevuld met 0,1% bovine serum albumine bij een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 6 cellen per ml. </li><li> Bereid een 5mm voorraad oplossing van CFSE (verdund in steriele dimethylsulfoxide) en voeg 2μL voor elke mL van cellen in de buis. De uiteindelijke concentratie van 10μM is optimaal voor de kleuring van primaire B-cellen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten in het donker (let op: CFSE is lichtgevoelig en moet in het donker bewaard indien mogelijk zijn). </li><li> Quench de vlek door het toevoegen van een gelijk volume van runderen kalfsserum naar uw cellen en incuberen op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Was de cellen door bijvullen van de buizen met kweekmedium (zie stap III voor recept) en centrifugeren bij 350 g. Merk op dat ten minste 5 keer het volume equivalent van media moet worden toegevoegd om de viscositeit van de runder-kalf serum tegen te gaan en voor de cellen om een ​​pellet te produceren. </li><li> Was de cellen twee keer meer in cultuur medium. De cellen zijn nu klaar voor stimulatie. </li></ol> Stap III: cel stimulatie met LPS <ol><li> Bereid uw in-vitro-B celkweekmedium te vullen RPMI 1640 met 10% foetaal kalf serum en 50 uM β-mercapto-ethanol /. </li><li> Bereid uw stimulatie medium door het toevoegen van LPS op een uiteindelijke concentratie van 50μg/mL. Aliquot 125 pi van de stimulatie medium in elk putje van een vlakke bodem met 96 putjes weefselkweek plaat. </li><li> Bereid uw CFSE-gekleurde B-cellen in kweekmedium zonder LPS bij een uiteindelijke concentratie van 3,2 x 10 6 cellen / ml. Voeg 125 pi van de celsuspensie aan de wells met uw stimulatie medium en meng door pipetteren voorzichtig. </li><li> Elk putje bevat nu 4 x 10 5 cellen in een uiteindelijke LPS concentratie van 25 ug / ml. Dit zorgt voor een optimaal niveau van de celproliferatie en klasse schakelen, maar wijzigingen in deze waarden kunnen worden gedaan zoals gewenst. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 72 tot 96 uur. Na 48 uur zal clusters van grote prolifererende B-cellen zijn duidelijk zichtbaar onder een microscoop. </li></ol> Stap IV: Flowcytometrische analyse van klasse wisselen <ol><li> Als u klaar bent om naar te kijken class switching, verwijder je cellen uit hun kweekomstandigheden en twee keer was ze in 1 ml vlekken buffer (PBS met 2% boviene kalfsserum). </li><li> Om niet-specifieke antilichaam kleuring van je cellen, pellet de cellen te voorkomen dat door het draaien van hen neer op 350 g en incute ze in 100μL van verkleuring buffer met 5% normale muis serum en 1μg van FcBlock per106 cellen gedurende 15 minuten op ijs. Cel blokkeren moet worden uitgevoerd op het ijs. </li><li> Zonder het wassen van je cellen, voeg 1μg per 10 6 cellen van een fluorescent gelabelde anti-muis antilichaam IgG3 en laat de cellen vlek gedurende 30 minuten op ijs. </li><li> Twee keer wassen van de cellen door centrifugeren en resuspendeer in 200-300 ul vlekken buffer. De cellen zijn nu klaar voor beoordeling door flowcytometrie. </li><li> CFSE is optimaal enthousiast bij 492 nm (door een argon-ion laser) en stoot op 517 nm. De excitatie-en emissiespectrum van de IgG3 antilichaam is afhankelijk van zijn geconjugeerde fluorescente kleurstof. </li></ol> Representatieve resultaten Na de magnetische verrijking, moet de celsuspensie eruit als een homogene populatie van niet te onderscheiden kleine ronde cellen (Figuur 1A). Na 48-72 uur van de stimulatie, zal geïsoleerde clusters van vergrote prolifererende cellen zijn duidelijk zichtbaar (figuur 1B). Een groot deel van de niet-prolifererende cellen zal verschijnen klein en korrelig als ze ondergaan apoptose. MVO kan normaal gesproken worden gedetecteerd op het hoogste niveau tussen de 72 en 96 uur na stimulatie voor het grootste deel van de cellen beginnen te sterven 7. In dit stadium, moeten de cellen hebben ondergaan een aantal celdelingen met geschakelde cellen die in de latere dochter celpopulatie. Een vertegenwoordiger flowcytometrische perceel van CFSE verdunning en oppervlakte-expressie van IgG3 na 96 uur van LPS stimulatie is te zien in figuur 2. Tabel 1. Isotype schakelen cocktails. Let op: Stimulant concentraties zijn slechts aanbevelingen. Titraties kan nodig zijn. <table border="1"><tbody><tr><td> Gewenste Isotype </td><td> Stimulatie Cocktail </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> LPS (25μg/mL) en IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> Anti-CD40 (10μg/mL) en IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) en IFN-γ (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2b en IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> IgA </td><td> LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) en IL-5 (1.5 ng / mL) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Isolatie en LPS stimulatie van milt B-cellen. (A) Magnetisch verrijkt milt B-cellen voor de LPS stimulatie. (B) 48 uur na stimulatie met 25 ug / ml LPS. Woekerende cellen worden gezien als clusters in een achtergrond van straal-en apoptotische cellen. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Proliferatie en klasse switch recombinatie na 96 uur. (A) CFSE verwatering voor LPS gestimuleerde cellen na 96 uur in cultuur. Iedere onafhankelijke piek vertegenwoordigt een verwatering van de CFSE fluorescentie die overeenkomt met een onafhankelijke celdeling. (B) IgG3 uitdrukking met de opkomst van een IgG3 positieve populatie na verscheidene rondes van celdeling.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

Het protocol hierboven geschetste biedt een standaard test om AID expressie en functie analyseert tijdens de les schakelen van de primaire muizen B-cellen. Dit protocol maakt gebruik van bacteriële LPS te induceren schakelen van IgM naar IgG3, maar aanpassingen aan de stimulatie media kan worden gemaakt om te bewegen te schakelen naar andere isotypen (samengevat in Tabel 1 8, 9). We hebben opgemerkt dat, voor nog onbekende redenen, foetaal kalf serum kan het niveau van de klasse t...

<table><tbody><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreenbuisjes</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Kalfsserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 cultuursmedium</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysachariden uit &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;ethanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Normaal muizenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-muis IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie en beoordeling van klasse switch recombinatie in gezuiverd murine b-cellen

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humorale immuniteit is de tak van het immuunsysteem onderhouden door B-cellen en gemedieerd door de secretie van antilichamen. Bij de B-cel activatie, de immunoglobuline locus ondergaat een reeks van genetische modificaties te veranderen het bindend vermogen en effector functie van de uitgescheiden antilichamen. Dit proces wordt benadrukt door een genomische recombinatie gebeurtenis bekend als klasse switch recombinatie (CSR), waarin de standaard IgM-antilichaam isotype is vervangen door een van de IgG, IgA of IgE. Elke isotype beschikt over verschillende effector functies waardoor MVO cruciaal voor het behoud van de immuniteit. Diversificatie van de immunoglobuline locus wordt gemedieerd door het enzym activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID). Een schematische video beschrijft dit proces in detail is online beschikbaar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID activiteit en het MVO-pad worden over het algemeen bestudeerd in de beoordeling van de B-cel functie en humorale immuniteit bij muizen. Het protocol beschreven in dit rapport presenteert een methode van B-cel isolatie van murine milt en de daaropvolgende stimulatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) te bewegen klasse overschakelen naar IgG3 (voor andere antilichaam isotypes zie tabel 1). Daarnaast is de fluorescente kleurstof cel vlekken carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gebruikt om de celdeling van de gestimuleerde cellen, een proces dat van cruciaal belang om over te stappen 1, 2 isotype monitor. De regulering van de AID en het mechanisme waarmee MVO gebeurt nog steeds onduidelijk en dus in-vitro-klasse switch testen leveren een betrouwbare methode voor het testen van deze processen in verschillende muismodellen. Deze testen zijn eerder gebruikt in de context van gen-deficiëntie gebruik van knock-out muizen 3. Bovendien kan in vitro schakelen van B-cellen worden voorafgegaan door virale transductie voor het moduleren van genexpressie door RNA knockdown of transgenexpressie 4-6. De gegevens van dit soort experimenten hebben beïnvloed ons begrip van de AID activiteit, resolutie van de MVO-reactie, en antilichaam-gemedieerde immuniteit in de muis.

Na blootstelling aan antigeen, subpopulaties van geactiveerde B-cellen worden onderworpen aan een proces dat bekend staat als klasse switch recombinatie (CSR) van antilichamen isotypen te produceren met verschillende effector functies. Het protocol beschreven in dit rapport legt uit hoe MVO kan worden opgewekt en geanalyseerd<em&gt; In vitro</em&gt; Voor de doeleinden van het bestuderen van B-cel-functie.

Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Humorale immuniteit is het deel van het immuunsysteem dat wordt onderhouden door B-cellen en wordt gemedieerd via de secretie van antilichamen. Na activering van de B-cel...

Tijdens de humorale immuunrespons prolifereren B-cellen die door antigenen zijn geactiveerd en scheiden zij antilichamen uit naarmate de respons vordert. Het standaard IgM-antilichaam-isotype wordt vervangen door de meer diverse IgG-, IgA- of IgE-isotypes om proliferatie en class switching te beoordelen. In vitro worden splenische B-cellen uit een experimentele muis geïsoleerd met behulp van magnetische celseparatie.De cellen worden gekleurd met de fluorescerende kleurstof CFSE om la proliferatie te monitoren, welke wordt gestimuleerd door behandeling met bacterieel L-P-S. L-P-S stimulatie induceert tevens class switching naar het isotype IgG3, wat samen met de proliferatie via flowcytometrie kan worden gemonitord. Vandaag laat ik u een techniek zien voor de isolatie en activatie van zuivere splenische B-cellen. Deze techniek kan worden gebruikt om class switch recombinatie en proliferatie in vitro te bestuderen, en kan tevens worden ingezet om kernvragen in het veld van de B-celimmuniteit te beantwoorden, waaronder de functie en regulatie van activation induced cytidine deaminase.Begin met het weken van een geëuthanaseerde muis in 70% ethanol. De muis moet acht tot 12 weken oud zi

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in...

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

We beschrijven hoe retrovirale of lentivirale infecties van overexpressie of shRNA-bevattende constructies in het menselijk Ramos B-cellijn en hoe somatische hypermutatie te meten in deze cellen. Uit te...

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

In vitro analyse van klasse-switch recombinatie bij muizen is uitdagend vanwege cytofiele IgE-moleculen die gebonden zijn aan Fc-receptoren op het oppervlak van B-cellen.  We beschrijven een methode voor IgE-detectie door middel van trypsine-gemedieerde splitsing van oppervlakte-gebonden IgE vóór fixatie en permeabilisatie voor cytoplasmatische fluorescentiekleuring.

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Hier wordt een test gepresenteerd om somatische hypermutatie binnen de immunoglobuline zware keten gen locus te kwantificeren met behulp van germinale centrum B cellen van muis Peyer's patches.

Analyse van somatische hypermutatie in de JH4-intron van Germinal Center B-cellen van Mouse Peyer's Patches

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Leer klasse-switch recombinatie in gezuiverde milt-B-cellen te induceren en analyseren met LPS-stimulatie en flowcytometrie. Deze methode biedt inzicht in B-celimmuniteit en antilichaamproductie.

Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Meer video's verkennen