Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Tijdens de humorale immuunrespons prolifereren B-cellen die door antigenen zijn geactiveerd en scheiden zij antilichamen uit naarmate de respons vordert. Het standaard IgM-antilichaam-isotype wordt vervangen door de meer diverse IgG-, IgA- of IgE-isotypes om proliferatie en class switching te beoordelen. In vitro worden splenische B-cellen uit een experimentele muis geïsoleerd met behulp van magnetische celseparatie.

De cellen worden gekleurd met de fluorescerende kleurstof CFSE om la proliferatie te monitoren, welke wordt gestimuleerd door behandeling met bacterieel L-P-S. L-P-S stimulatie induceert tevens class switching naar het isotype IgG3, wat samen met de proliferatie via flowcytometrie kan worden gemonitord. Vandaag laat ik u een techniek zien voor de isolatie en activatie van zuivere splenische B-cellen. Deze techniek kan worden gebruikt om class switch recombinatie en proliferatie in vitro te bestuderen, en kan tevens worden ingezet om kernvragen in het veld van de B-celimmuniteit te beantwoorden, waaronder de functie en regulatie van activation induced cytidine deaminase.

Begin met het weken van een geëuthanaseerde muis in 70% ethanol. De muis moet acht tot 12 weken oud zijn om volledige rijping van het immuunsysteem te garanderen. Gebruik een steriele schaar om een incisie te maken door de huid en spieren van het linker hypochondrium van de buikholte. Gebruik een schaar of pincet om de milt uit het omliggende weefsel te verwijderen.

Snijd het vervolgens in drie grote stukken in PBS. Gebruik daarna het rubberen uiteinde van de zuiger van een spuit van 1 mL om de milt voorzichtig door een cellzeef van 70 micron in PBS te pletten. Zorg ervoor dat u een duwbeweging gebruikt in plaats van een maalbeweging.

Aangezien malen kan leiden tot ruptuur van grotere prolifererende cellen, worden de cellen gedraaid bij maximaal 350 G gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de pellet in PBS.

Tel de resuspendeerde cellen met een hemocytometer in een steriele polystyreenbuis van vijf milliliter. Bereid een suspensie voor van 1 × 10⁸ cellen per milliliter in PBS met 5% normaal ratenserum. Er kan maximaal twee milliliter aan elke buis worden toegevoegd.

Voeg vervolgens 50 µL EP-negatieve selectie-muis B-cel-verrijkingscocktail toe per milliliter cellen. Sluit de buizen daarna af en plaats ze 15 minuten in de koelkast.

Voeg 100 µL EP biotin-selectiecocktail toe per milliliter cellen. Sluit de buisjes en plaats ze 15 minuten in de koelkast. Na de incubatie met de biotin-selectiecocktail mengt u de EP magnetische nanodeeltjes en voegt u 100 µL toe per milliliter cellen. Pipetteer het mengsel, sluit de buisjes en plaats ze vijf minuten in de koelkast.

Vul de oplossing aan tot 2,5 milliliters met PBS en plaats deze vijf minuten in een cept magneet. Keer de magneet met de buis om en giet de inhoud snel in een nieuwe polystyreen buis. Schud de buis niet, aangezien negatief geselecteerde cellen magnetisch aan de wanden van de buis zullen binden. Om de zuiverheid van de celsuspensie verder te verhogen, plaatst u de nieuwe buis met cellen gedurende vijf minuten in de magneet en giet u de inhoud vervolgens opnieuw in een nieuwe buis.

Deze stap kan het totale celherstel verminderen. De zuiverheid van de B-cellen kan worden beoordeeld via flowcytometrische analyse van B-celoppervlaktemarkers. Na verrijking moet meer dan 95% van de cellen B two 20 positief zijn.

Resuspendeer de geïsoleerde cellen in warme PBS aangevuld met 0,1% BSA tot een uiteindelijke concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter, gebruikmakend van een vijf millimolaire stockoplossing van CFSE-kleurstof gedilueerd in steriele dimethylsulfoxide. Voeg twee microliters toe voor elke milliliter cellen in de buis. CFSE wordt gebruikt om de celdeling van gestimuleerde cellen te monitoren.

Een proces dat cruciaal is voor isotype-switching. Een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar is optimaal voor de kleuring van primaire B-cellen. Geïncubeerd bij 37 °C gedurende 10 minuten in het donker.

Let op dat CFSE lichtgevoelig is en indien mogelijk in het donker moet worden bewaard. Quench na de incubatie de kleuring door een gelijk volume kalfsserum aan de cellen toe te voegen en deze op ijs te incuberen. Om de cellen gedurende vijf minuten te wassen, vul de buizen aan met kweekmedium; er moet minstens vijf keer het volumeequivalent aan medium worden toegevoegd om de viscositeit van het kalfsserum tegen te gaan en om de cellen een pellet te laten vormen, centrifugeer vervolgens op 350 G. Was de cellen nogmaals twee keer in kweekmedium; de cellen zijn nu klaar voor stimulatie.

Bereid in vitro B-celcultuurmedium voor door RPMI 1640 aan te vullen met 10% foetaal runderserum en 50 micromolar Beto me capita ethanol. Bereid vervolgens stimulatiumedium door LPS toe te voegen tot een eindconcentratie van 50 micrograms per milliliter. Verdeel 125 microliters van het stimulatiumedium over elke well van een vlakbodem 96-wells weefselkweekplaat.

Bereid de CFS E-gekleurde B-cellen voor in kweekmedium zonder LPS bij een uiteindelijke concentratie van 3,2 × 10⁶ cellen per milliliter. Voeg 125 µL van de celsuspensie toe aan de wells die het stimulatiedium bevatten en meng door voorzichtig te pipetteren. Elke well bevat nu 400.000 cellen bij een uiteindelijke LPS-concentratie van 25 µg per milliliter.

Dit zorgt voor optimale niveaus van celproliferatie en class switching. Hoewel deze waarden naar behoefte kunnen worden aangepast, moeten de cellen worden geïncubeerd bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende 72 tot 96 uur. Na 48 uur zullen clusters van grote prolifererende B-cellen duidelijk zichtbaar zijn onder een microscoop om de class switching te bestuderen.

Haal de cellen uit de incubator en was ze tweemaal in één milliliter kleuringsbuffer om aspecifieke antilichaamkleuring te voorkomen. Pelleteer de cellen door ze te centrifugeren bij 350 G. Resuspendeer de cellen vervolgens in 100 microliters kleuringsbuffer met 5% normaal muis serum en één microgram FC-block per miljoen cellen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs zonder te wassen. Voeg een fluorescentiegelabeld anti-US IgG drie-antilichaam toe bij één microgram per miljoen cellen, incubeer gedurende 30 minuten op ijs, was de cellen tweemaal en resuspendeer ze in twee tot 300 microliters kleuringsbuffer.

De cellen zijn nu klaar voor analyse via flowcytometrie. CFSE wordt optimaal geëxciteerd bij 492 nanometers door een argon-ionlaser en emittert bij 517 nanometers. Het excitatie- en emissiespectrum van het IgG3-antilichaam is afhankelijk van de geconjugeerde fluorescente kleurstof.

Na magnetische verrijking moet de cel-suspensie eruitzien als een homogene populatie van ononderscheidbare kleine ronde cellen. Na 48 tot 72 uur stimulatie zullen geïsoleerde clusters van vergrote prolifererende cellen duidelijk zichtbaar zijn. Een groot deel van de niet-prolifererende cellen zal er klein en granulair uitzien terwijl ze apoptose ondergaan.

CSR kan normaal gesproken op de hoogste niveaus worden gedetecteerd tussen 72 en 96 uur na stimulatie, voordat de meeste cellen beginnen af te sterven. In dit stadium zouden de cellen een aantal celdelingen moeten hebben ondergaan, waarbij de geswitchte cellen verschijnen in de populatie van de later gevormde dochtercellen. Na het volgen van deze protocollen kunnen andere technieken, zoals RNAi-gemedieerde gene knockdown, worden gebruikt om het effect van elk gen op de functie van een ID en het proces van class switch recombinatie te bestuderen.