Uitdrukking, Wasmiddel oplosbaar, en zuivering van een Membraan Transporter, de MexB Multidrug Resistance Protein

Om het Mex B-membraaneiwit te zuiveren, wordt Mex B eerst tot expressie gebracht in e coli met behulp van recombinante DNA-methoden. Vervolgens worden de membranen geïsoleerd en worden de membraaneiwitten gesolubiliseerd met een mild detergent. Het gesolubiliseerde membraaneiwit wordt gezuiverd door middel van iMac en het eiwit wordt verder gezuiverd door middel van gelfiltratiechromatografie.

Het zuiveringsniveau van het eiwit wordt bepaald met behulp van SDS poly ACRYLAMIDE Gel elektroforese. Hoewel deze procedure inzicht kan geven in multi-drug resistentie transmembraan transporters, kan het ook worden toegepast op andere membraaneiwitten die aantonen dat de procedures van vandaag zullen worden gevormd door een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Voor deze procedure zal Mex B van pseudomonas Aosa worden subgekloond in de PET 30 B plus expressievector, zodat Mex B wordt geëxpresseerd met een C-terminaal HEXA histamine tag. Begin 's avonds door vier drie milliliter lb can mycin culturen te inoculeren met verse transformanten of gebruik een bevroren voorraad, kweek de culturen 's nachts op een roller bij 37 graden Celsius.

Gebruik de overnachtelijke culturen om 150 milliliter LB met 30 microgram per milliliter te inoculeren. Kan Mycin laat de cultuur groeien bij 37 graden Celsius op een shaker in de namiddag? Gebruik de kleine cultuur om zes keer één liter, twee XYT-media met 30 microgram per milliliter te inoculeren.

Kan mycin in fern terugflessen? Gebruik 25 milliliter per cultuur voor een 1 tot 40 verdunning. Laat de culturen groeien bij 37 graden Celsius tot ze een optische dichtheid bereiken.

600 van 0,4 tot 0,6, ongeveer 1,5 uur. Wanneer de culturen de juiste dichtheid bereiken, induceert u eiwitexpressie door 0,5 milliliter van één molair toe te voegen.IPTG. Doe alle flessen terug in de shaker en laat ze 's nachts groeien bij 30 graden Celsius tot het oogsten van de bacteriën de volgende ochtend.

Haal de culturen uit de shaker en koel ze. Om de cellen te oogsten, breng de culturen over naar centrifugeerbuisjes en centrifugeer ze gedurende 30 minuten bij 5.000 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius in een grootschalige centrifuge terwijl de cellen worden gecentrifugeerd. Vul 100 milliliter van de celre suspensiebuffer aan met DNA-proteaseremmers en lysozym.

Voeg ook twee aliquoten van membraanre suspensiebuffer toe aan proteaseremmers zoals in deze tabel is weergegeven. Houd alle drie de oplossingen op ijs wanneer de centrifugatie is voltooid. Resus spend de cell pellets in 100 milliliter van de celre suspensiebuffer.

Trek vervolgens de cellen uit. De celsuspensie wordt geladen in de French pressure cell en de cel wordt op de French press geplaatst. De druk wordt toegepast totdat deze 12.000 pond per vierkante inch bereikt.

De klep wordt een heel klein beetje geopend zodat de gebroken cellen eruit druppelen. Het is belangrijk om de klep niet te veel te openen en de cellen eruit te laten spuiten, omdat ze met te weinig druk vrijkomen en niet efficiënt worden gebroken. Verzamel het cellysaat in een fles, gekoeld op ijs.

Leidt de celloplossing opnieuw door een French pressure cell bij 12.000 pond per vierkante inch. Breng het cellysaat over naar SS 34 centrifugeerbuisjes en centrifugeer om cellulaire brokjes te verwijderen bij 10.000 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in een SS 34 rotor. De verduidelijkte lysate is vervolgens.

Wordt gebruikt om de membraanfractie voor te bereiden. Breng de supinate voorzichtig over in ti. 6 4, 7 0.5 ultra centrifugeerbuisjes, centrifugeer in een TI 6 4 7 0.5 rotor bij 40.000 omwentelingen per minuut gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de supinate weg. Gebruik een pipet om voorzichtig de pellet, die de celmembranen bevat, te resuspenderen in ongeveer 25 milliliter van de membraanre suspensiebuffer, breng de membraansuspensie over naar een schone centrifugeerbuis en centrifugeer opnieuw in een TI I 6 4 7 0.5 rotor bij 40.000 omwentelingen per minuut gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius en resuspendeer de gewassen membraanpellet in 25 milliliter van de membraanre suspensiebuffer. Gevolgd door het solubiliseren van de membraaneiwitten naar de geresuspeneerde membranen bij ongeveer 25 milliliter.

Voeg zes milliliter van 10%DDM toe zodat de uiteindelijke detergentconcentratie 2%DDM is. Roer het mengsel bij vier graden Celsius gedurende twee uur na de twee uur incubatie in aanwezigheid van DDM. Centrifugeer het mengsel bij 40.000 omwentelingen per minuut gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius in de TI I 6 4 7 0.5 rotor. Om de oplosbare eiwitdetergent complexen te scheiden van de onoplosbare eiwitten. Bewaar het supine natant dat het Mex B-eiwitdetergentcomplexen bevat om te gebruiken in de zuivering meng de supine natant met twee milliliter van de lon-metaalaffiniteitbeads geëquilibreerd in Resus suspensiebuffer. Incubeer gedurende één uur op een roller bij vier graden Celsius na binding van de eiwitten aan de hars.

Giet de slurry in een zwaartekrachtstroomkolom en gooi de stroom door. Was de kolom met 20 milliliter of 10 kolomvolumen van iMac binding en wasbuffer wanneer het wassen van de kolom voltooid is. Eluteer de gebonden eiwitten met 10 milliliter van iMac elutiebuffer.

Neem 10 microliter monsters van elke elutiefractie. Meng met 10 microliters van twee keer SDS-monster, buffer en analyseer op een 10%poly acrylamide. SDS-gel.

Schat de hoeveelheid en zuiverheid van mex B in elke fractie. Trek de fracties met de Mex B-eiwitdetergentcomplexen en concentreer ze in een spinconcentrator bij vier graden Celsius. Zorg ervoor dat het eiwit in deze stap niet uitprecipiteert.

Gebruik verschillende korte spins en let op precipitatie. Na elke spin, ga dan verder met het zuiveren van de gepoolde fracties met behulp van een gelfiltratiekolom. Voorvermeng een super rose 12 HL 30 over 10 kolom met 24 milliliter van de loopbuffer en wacht op een platte basislijn.