Name: Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer intracraniële injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren voor fluorescente labelering van neuronen en glia in de visuele cortex. Deze methode maakt gerichte expressie van fluorescentie-eiwitten mogelijk voor in vivo beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van de NIH (EY012977), een Career Award in de Biomedische Wetenschappen aan de Burroughs Wellcome Fonds, de Stichting Whitehall, en de Sloan Foundation (AKM).

1. Virus Hantering en opslag <ol><li> Een goede bescherming en handling technieken moeten worden gekozen op basis van het bioveiligheidsniveau van het virus te worden gebruikt. Deze praktijken zijn te vinden in Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories 5 e editie, beschikbaar op de website van CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). Het gebruik van AAV vectoren is goedgekeurd voor bioveiligheid van niveau 1 (BSL-1). Voor het experiment hier wordt weergegeven, wordt een laboratoriumjas en handschoenen worden gedragen bij het hanteren van het virus, in overeenstemming met de procedures voor de behandeling van BSL-1 agenten. </li><li> Voor het behoud van de activiteit van het virus is het het beste om het te verdelen in kleine porties naar Herhaald invriezen en ontdooien te voorkomen. </li><li> Maak een bioveiligheid Cabinet (BSC) Klasse II voor aliquoting virus door het opruimen van de BSC van onnodige voorwerpen en steriliseren van het oppervlak met 70% EtOH. Plaats een bekerglas met 10% bleekwater oplossing in de kap voor het verzamelen van AAV-verontreinigd afval. Ook geplaatst in de BSC zijn steriel 0,5 ml buizen en een container van droog ijs. </li><li> Dooi virale voorraad op ijs buiten de BSC. </li><li> Vortex virus en open de tube in de BSC. </li><li> Pipetteer de gewenste hoeveelheid volume (bijv. 5 pi) in een 0,5 ml buis, sluit de buis en in de droge ijs te plaatsen flash-vries het virus. </li><li> Als alle virus is hoeveelheden verdeeld, ontdoen van het virus buis en pipetpunten in de afvalcontainer met 10% bleekwater. </li><li> Verwijder het afval container van de motorkap en voeg nog eens 10% bleekmiddel, en giet dan het bleekmiddel in de gootsteen. Afvoeren van plastic afval in een container biohazard volgens de instructies van de bioveiligheid van uw instituut officer. </li><li> Reinig alle apparatuur en oppervlakken die in contact kwamen met het virus met 10% bleekwater. Gooi handschoenen. </li><li> Bewaar aliquots in -80 ° C vriezer. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Bedek de chirurgische gebied met absorberend labtafel papier. Chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd en chirurgie gedaan onder aseptische omstandigheden in overeenstemming met bioveiligheid van uw instelling en het gebruik van dieren richtlijnen. </li><li> Kies een gebied grenzend aan de chirurgische gebied dat zal worden gewijd aan het laden van de micropipetten met het virus, en dek deze af met absorberend labtafel papier. Een hoeveelheid van het virus in een container van ijs in dit gebied, en laat het virus te ontdooien op ijs als de ingreep wordt uitgevoerd. </li><li> Opzetten van een afvalcontainer van 10% bleekmiddel in de speciale virus handling gebied voor het storten van pipetpunten, etc. die in contact komen met het virus. </li><li> Trek een glas Wiretrol micropipet om een ​​tip diameter van ongeveer 20 micron. Plaats een kleine druppel van minerale olie op het stompe eind van de micropipet en steek de draad plunjer die bij de micropipetten. </li><li> Zet de micropipet in de klem van de micropomp arm. </li><li> Subcutaan injecteren een muis met buprenorfine in een dosering van 0,5 mg / kg. Verdoven van de muis met Avertin via intraperitoneale injectie met een dosis van 200 mg / kg en verwijder het haar van de bovenkant van het hoofd met chirurgische scharen, en zorg ervoor dat de marges groot genoeg om haar te voorkomen dat de incisie te verlaten. </li><li> Bevestig een warmte deken om de basis van een stereotax om een ​​lichaamstemperatuur van 37 ° C gedurende de operatie te houden en de muis veilig in de stereotax. </li><li> Baad het hoofd met drie afwisselende scrubs van ethanol en betadine om het gebied te steriliseren. </li><li> Plaats een druppel Tobradex oogzalf op elk oog om de ogen vochtig te houden tijdens de operatie. </li><li> Maak een incisie beneden de middellijn van het hoofd en trek de huid aan de schedel bloot te leggen. </li><li> Verwijder voorzichtig de fascia van de schedel met behulp van fijne punt tang. </li><li> Zoek de gebied dat moet worden geïnjecteerd met behulp van stereotaxische coördinaten en markeer de schedel met een chirurgische pen. </li><li> Met behulp van een tandheelkundige boor met een 1,4 mm braam, dun een deel van de schedel ongeveer 2 mm in diameter tot aan de schedel scheuren, het verdelen van de verdunde gebied in meerdere segmenten. </li><li> Gedurende deze procedure blijven de schedel vochtig met toepassingen van steriele zoutoplossing. </li><li> Voer een craniotomie door voorzichtig het verwijderen van de verdunde schedel segmenten met behulp van extra-fijne getipt pincet. </li></ol> 3. Injectie Voorbereiding <ol><li> Met een KimWipe geplaatst over de deksel, opent de buis van het virus en de pipet 1.5uL (voor een 1uL injectie) van het virus op een klein stukje van Parafilm. </li><li> Plaats de tip van de micropipet in het virale voorraad en handmatig te trekken van de zuiger. Als moeilijkheid is ervaren tekening virale voorraad in de micropipet, kan de punt vergroot worden enigszins worden piercing een KimWipe met de micropipet om een ​​klein gedeelte van het glas te breken. </li><li> Lagere micropomp arm op zuiger totdat er een kleine hoeveelheid van het virus is verdreven van het uiteinde van de micropipet. Verwijder deze kleine druppel met een wattenstaafje applicator en gooi applicator in zijte container. </li><li> Breng een druppel van minerale olie aan de top van de micropipet om verstopping te voorkomen als de micropipet wordt neergelaten in de hersenen. </li></ol> 4. Virusinjectie <ol><li> Met behulp van X-en Y-coördinaten stereotaxische, plaatst u de micropipet over het gebied dat moet worden geïnjecteerd. In dit experiment, coördineert de stereotaxische gebruikt om de primaire visuele cortex te lokaliseren zijn 2.7mm posterior te bregma en 2,5 mm lateraal van de middellijn. Heel langzaam lager de micropipet (een geschatte snelheid van 1mm/1minute) naar de juiste Z-positie. </li><li> Voer de gewenste injectie parameters in de SYS Micro4 micropomp controller box en start van de injectie. Voor dit experiment, zal een microliter meer dan 10 minuten worden gebruikt als een percentage van de injectie. </li><li> Wanneer de injectie is voltooid, laat de pipet te rusten voor een-twee minuten efflux van het virus te voorkomen tijdens het verwijderen. Na deze periode, heel langzaam verwijder de micropipet van de hersenen (hetzelfde tarief als hierboven). </li><li> Suture de hoofdhuid en verzegelt het met weefsel lijm. Subcutaan injecteren het dier met buprenorfine in een dosering van 0,1 mg / kg om de 8-12 uur in de komende 72 uur, of zo lang als het dier vertoont tekenen van pijn. Laat het dier te laten bekomen onder een warmtelamp totdat het ambulating en klaar om te worden teruggestuurd naar zijn kooi. Imaging experimenten kan worden gestart nadat de gewenste incubatie tijd (dagen tot weken na de virale injectie). </li></ol> 5. Schoonmaken <ol><li> Spoel de micropipet met 10% bleekwater en gooi het in een naaldencontainer. </li><li> Afvoeren van afval container op dezelfde manier als afdeling 1. </li><li> Gooi labtafel papier in biohazard bin en veeg alle oppervlakken en instrumenten die mogelijk in contact komen met het virus met 10% bleekwater. </li><li> Ongebruikte virus kan opnieuw worden ingevroren, rekening houdend met dat herhaalde vries / dooi cycli afbraak van het virus kan veroorzaken. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Getransduceerde neuron na de injectie van double-stranded adeno-geassocieerd virus serotype 1 (dsAAV S1) uitvoeren groen fluorescerend eiwit (GFP) onder controle van de CMV promotor. De cel zowel lichaam als proximale en distale dendrieten zijn duidelijk zichtbaar in de vaste rubrieken beeld gebracht met behulp van een epifluorescerende microscoop. Schaalbalk = 100 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Labeling typisch zijn voor een intracraniële virus injectie in primaire visuele cortex met behulp van dsAAV S1 waaruit de omvang van de virusverspreiding en gelabelde neuronen, glia en processen. Schaalbalk = 250 pm. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Etikettering van cellen in de hippocampus met behulp van dsAAV S1. Schaalbalk = 250 pm. Deze cijfers zijn aangepast van Lowery et al.. 2009 1

<ol><li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li>
<li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model%2C+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li>
<li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain%3A+duration+and+modulation+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li>
<li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li>
</ol>

Het dier en experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Rochester University Comite voor de Resources (UCAR) in overeenstemming met de PHS beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren.

Viraal gemedieerde genafgifte biedt veel mogelijkheden voor de studie van neurologische processen en behandeling van hersenaandoeningen 1,2,3. De grote veelzijdigheid van deze techniek kan ook worden benut om fluorescent label-cellen voor het afbeelden van zowel in vitro als in vivo 4. Hier laten we zien een gedetailleerde procedure voor de transductie van neuronen en glia in de muis visuele cortex met behulp van een double-stranded adeno-vereniging virus dat versterkt groen fluorescent ei...

<table><tbody><tr><td>St&amp;#8211;lting adapter voor muizen en pasgeboren ratten</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Een reguliere stereotaxische houder voor het fixeren van dieren voor chirurgie kan worden gebruikt als alternatief</td></tr><tr><td>Extra fijne Bonn-scharen, 8,5 cm, rechte punt, snijkant 13 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Oogverbandpincet, 10 cm, puntbreedte 0,5 mm, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 pincet - Dumoxel standaardpunt, 11 cm, onder een hoek</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Pincet met extra fijne punt voor het uitvoeren van een craniotomie</td></tr><tr><td>Standaard pincet, recht, punt 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtorque controlebox en Tech2000 handstuk</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td> Tandartsboor</td></tr><tr><td>Micro-boor roestvrijstalen frezen, punt diameter 1,4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-14</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol micropipetten, voor afgifte van 1-5 µL</td><td>VWR international</td><td>5-000-1001 of 53480-287</td><td></td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>VWR international</td><td>29447-338</td><td></td></tr><tr><td>Handmatige micromanipulator en kantelbare basis (voor rechtshandigen)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3-R</td><td>Gebruikt voor het bepalen van stereotaxische coördinaten</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (één) met SYS-Micro4 controller</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Hechtmateriaal</td><td>VWR international</td><td>95056-952</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown micropipetten-trekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Tobradex</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar via de veterinaire diensten van uw instelling&amp;rsquo;</td></tr></tbody></table>

intracraniële injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële injectie van virale vectoren ontwikkeld om een fluorescerend eiwit tot expressie is een veelzijdige labeling techniek voor visualisatie van specifieke subsets van cellen in verschillende hersengebieden, zowel in vivo en in de hersenen secties. In tegenstelling tot de injectie van fluorescerende kleurstoffen, virale etikettering biedt targeting van individuele celtypen en is minder kostbaar en tijdrovend dan het vaststellen van transgene muis lijnen. In deze techniek wordt een adeno-geassocieerde virale (AAV) vector geïnjecteerd met behulp van intracranially stereotaxische coördinaten, een micropipet en een automatische pomp voor precieze aflevering van AAV naar het gewenste gebied met minimale schade aan het omringende weefsel. Injectie parameters kunnen worden aangepast aan de individuele experimenten door het aanpassen van het dier leeftijd bij injectie, injectie locatie, het volume van de injectie, de mate van injectie, AAV serotype en de promotor rijden genexpressie. Afhankelijk van de gekozen omstandigheden kunnen viraal geïnduceerde transgenexpressie laten visualisatie van groepen cellen, individuele cellen of fijne cellulaire processen, tot op het niveau van de dendritische spines. Het experiment hier getoond toont een injectie van double-stranded AAV uiten van groen fluorescerend eiwit voor de etikettering van neuronen en glia in de muis primaire visuele cortex.

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracraniële injectie van virale vectoren die zijn ontwikkeld om een fluorescent eiwit tot expressie te brengen, is een veelzijdige labelingstechniek voor de visualisatie van specifieke ...

Virale vectoren kunnen worden gebruikt om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen in specifieke subsets van cellen in weefsel. Hier wordt een virus dat gemodificeerde eiwitten tot expressie brengt, geïntroduceerd in de primaire visuele cortex van de hersenen door eerst een kleine craniotomie over dit gebied uit te voeren. Vervolgens wordt een glazen micropipet in de hersenen gebracht, waarna een dentale geassocieerde virale vector in de hersenen wordt geïnjecteerd en de chirurgische plek wordt gesloten.Zodra het dier is hersteld, kan beeldvorming worden uitgevoerd om het lot van fluorescent gelabelde cellen in vivo of in hersensecties te volgen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals labeling met fluorescente kleurstoffen en transgene muislijnen, zijn dat het gericht kan worden op individuele celtypen en dat het minder kostbaar en tijdrovend is dan het opzetten van een transgene lijn. Het gebruik van adeno-geassocieerde virale vectoren is goedgekeurd voor biosafety level one of BSL 1.Hier wordt een laboratoriumjas en handschoenen gedragen in overeenstemming met de procedures voor het hanteren van BSL 1-agentia; begin met het

intracranial-injection-of-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Source: Li, D., et al. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for the intrathecal injection of adeno-associated viruses (AAV) into the cerebrospinal fluid (CSF) of an awake mouse, covering syringe preparation, spinal alignment, and precise needle insertion. This method validates targeted gene delivery, supporting its potential for CNS therapies.

Intrathecal Delivery of Viruses in a Mouse Model for Treating Central Nervous System Diseases

Source: Grames, M. S., et al. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the tail vein injection of recombinant adeno-associated virus (AAV) in rats. After injection into the lateral tail vein, the virus enters the bloodstream, circulates through the heart, and reaches the brain, where it enters neurons and facilitates target protein production for...

 Intravenous Administration of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in a Rat Model 

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.

Intrathecale vectortoediening bij jonge ratten via lumbale stortbakinjectie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

Leer intracraniële injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren voor fluorescente labelering van neuronen en glia in de visuele cortex. Deze methode maakt gerichte expressie van fluorescentie-eiwitten mogelijk voor in vivo beeldvorming.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Meer video's verkennen