Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo's

Het algemene doel van deze procedure is om oph- en melanogaster-embryo's voor te bereiden voor whole mount-visualisatie van het zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen van de betreffende vliegenstam. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van het corium met bleekmiddel.

De derde stap van de procedure is het aanbrengen van heptaan en methanol om het vilinmembraan te verwijderen. De laatste stap van de procedure is het aanbrengen van antilichamen op de embryo's. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de structuur van het zenuwstelsel van het drosophila-embryo laten zien via immunofluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen, zoals de rol die mutaties kunnen spelen in het ontwikkelende zenuwstelsel. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat zij per ongeluk embryo's uit het vial kunnen pipetteren. Begin dit protocol met het klaarmaken van de benodigde reagentia, waaronder P-E-M-F-A, buffer PBC 5%BSA met 0,01% natriumazide zoutoplossing en formaldehyde-fixeermiddel.

Bereid een kooi voor voor de drosophila-stam van belang door de vliegen uit te schakelen met koolstofdioxide en vervolgens ten minste 100 vliegen over te brengen naar een plastic fles die is voorzien van een adapter met een appelsap-agar voedingsplaat. Plaats de kooi met vliegen 72 uur lang in het donker bij kamertemperatuur. Vervang de appelsap-agar voedingsplaten elke acht tot 12 uur, zodat de vliegen aan de kooi kunnen wennen en hun eieren niet vasthouden voor het experiment.

Verzamel na de acclimatisatieperiode van 72 uur de embryo's 12 uur na de laatste wisseling van de appelstapsuikersagar-voedingsplaat. Verwijder de appelstapsuikersagar-voedingsplaat uit de legkooi en vervang deze door een zoutoplossing. Spoel de appelstapsuikersagar-voedingsplaat af.

Verzamel de embryo's in een fijne zeef. Gebruik een schoon schilderspenseel om eventuele embryo's die aan de plaat blijven kleven los te maken. Spoel de embryo's in de zeef met zoutoplossing om overtollige gist te verwijderen; pak de embryo's vervolgens voorzichtig met een spatel op en plaats ze in een klein glazen vial.

Voeg ongeveer één milliliter zoutoplossing toe. Sluit daarna het vial en incubeer vijf minuten om de embryo's te wassen. Na het verzamelen van de embryo's.

Bereid de heptaan-fixeeroplossing door 50% heptaan en 50% fixeerder te combineren. De oplossing zal gelaagd zijn, met heptaan aan de bovenzijde en de fixeerder aan de onderzijde. Wanneer er vijf minuten zijn verstreken, gebruik dan een pastapipet om het overtollige zoutoplossing uit het glazen vial met embryo's te verwijderen.

Spoel de embryo's met gedeïoniseerd water door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water toe te voegen aan het glazen vials waarin de embryo's zich bevinden. Laat de embryo's één minuut rusten voordat het water wordt verwijderd met een 50% bleekoplossing. Schud het vial een paar keer handmatig en incubeer vervolgens gedurende drie minuten om de embryo's te coaten.

De dode embryo's zullen naar de bodem van het vial zakken. Embryonale COR's zullen blijven drijven. Verwijder het bleekmiddel en de COR's na de incubatie van drie minuten.

Spoel de embryo's na de decoratie grondig af met gedeïoniseerd water door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water toe te voegen aan het glazen vial met de embryo's. Laat de embryo's één minuut rusten voordat u het water verwijdert; resterende COR's zullen drijven en moeten worden verwijderd. Voeg de heptaan-fixatieoplossing toe aan de embryo's en incubeer deze gedurende 30 minuten met voorzichtig schudden om ze te fixeren.

Gebruik een Pasteurpipet om het fixatief, de onderste laag, te verwijderen, zodat het heptaan in de buis achterblijft. Voeg vervolgens methanol toe aan de bodem van de buis ter vervanging van het fixatief, sluit de buis af en schud deze krachtig met de hand om het vitellijnvlies te verwijderen. Na deze stap zullen de gedevitellineerde embryo's naar de bodem van de buis zinken.

Verwijder met een Pasteurpipet het methanol en de resten uit het flacon, zodat de gedeïoniseerde embryo's achterblijven. Spoel de embryo's vervolgens vijf keer met methanol en verwijder tussen elke spoeling het methanol met een Pasteurpipet. Incubeer de embryo's bij elke spoeling vijf minuten.

Plaats de embryo's gedurende vijf minuten in een mengsel van 50% PBT-oplossing en 50% methanol om ze te rehydreren. Zet het rehydratieproces vervolgens voort door ze vijf minuten over te brengen naar een 100% PBT-oplossing. Blok daarna de embryo's door ze één uur lang bij vier graden Celsius te incuberen in een 5% BSA-oplossing met 0,01% natriumazide.

Bereid vervolgens het primaire antilichaam voor de embryo-kleuring voor door het te verdunnen tot de juiste concentratie met een 5% BSA-oplossing met 0,01% natriumazide. De hier gebruikte antilichamen zijn gericht tegen het vesiculair cysteïne-string-eiwit en het anti-HRP-antilichaam. Anti-HRP herkent een neurale specifieke koolhydraatgroep in de oppervlakteglycoproteïnen, waardoor alle neuronen worden gelabeld.

Incubeer de embryo's overnacht bij four degrees Celsius in de primaire antilichaamoplossing. Was de embryo's 10 keer met PBT gedurende een uur. Voeg ongeveer one milliliter PBT toe aan het glazen flacon met de embryo's en laat de embryo's zes minuten rusten voordat de PBT wordt verwijderd.

Herhaal dit proces van het aanbrengen van PBT, incuberen en het verwijderen van PBT 10 keer. Bereid de secundaire antilichaamoplossing in het donker voor, omdat deze lichtgevoelig is, door te verdunnen tot de juiste concentratie. Wij gebruiken Alexa secundaire antilichamen bij een concentratie van 1:200.

Incubeer de embryo's gedurende twee uur bij vier graden Celsius in de secundaire antilichaamoplossing. Wikkel het glazen vial met embryo's en de secundaire antilichaamoplossing in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Was de embryo's 10 keer met PBT gedurende een uur.

Voeg vector shield monteermedium toe aan de embryo's en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius om ze te monteren. Gebruik een pasteurpipet om de embryo's samen met wat monteermedium op te zuigen. Breng de embryo's en het medium aan op een glazen objectglas.

Plaats een dekglas over de embryo's en kit het dekglas af met nagellak. Visualiseer de embryo's hier met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Het embryonale centrale zenuwstelsel wordt getoond in stadium 16 tot 17.

Cystine string-eiwit is in het rood weergegeven. HRP-neuronen zijn in het groen weergegeven. Let op de duidelijke kleuring van de commissuur in deze representatieve afbeelding.

Het embryonale perifere zenuwstelsel (PNS) wordt getoond in stadium 16 tot 17. Opnieuw is het cystine-string-eiwit in het rood weergegeven en de neuronen in het groen. Let op de herhalende patronen van perifere neuronen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met de embryo's, zodat u ze niet per ongeluk uit het flacon verwijdert. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u oph fla embryo's klaarmaakt voor whole mount visualisatie van het zenuwstelsel.