Name: Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer het embryonale zenuwstelsel visualiseren in Drosophila-embryo's met immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode helpt onderzoekers genetische mutaties in de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SG wordt ondersteund door middelen van de State University van New York in Buffalo en van John R. Oishei Foundation.

1. Voorbereiding van de reagentia <ol><li> Bereid de PEMFA Buffer met behulp van 100mm Pipes, 2mm EGTA, en 1 mM MgSO 4. Breng de pH van de buffer tot 7,0. De buffer is PEMFA filter gesteriliseerd en opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Bereid PBT door het toevoegen van 1 ml van Triton X-100 tot 100 ml 1x PBS (fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing) (pH 7,0). Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid 5% BSA (bovine serum albumine) met 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0). </li><li> Bereid de zoutoplossing met 0,7% NaCl en 0,03% Triton X-100 in gedeïoniseerd water. </li><li> Bereid het fixatief door de combinatie van vier onderdelen PEMFA buffer met 1 deel 37% Formaldehyde. </li></ol> 2. Het verzamelen van embryo's <ol><li> Bereid een kooi voor de Drosophila stam van belang door het plaatsen van&gt; 100 vliegt in een plastic fles met daarin een adapter met agar voeden plaat. </li><li> Laat de kooi van vliegen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 72 uur, het wijzigen van platen iedere 8-12 uur, zodat de vliegen te krijgen gewend aan de kooi en niet in het bezit van hun eieren. </li><li> Voor het experiment te verzamelen embryo's voor 12 uur. Haal de petrischaal uit de container en vervang deze. Neem de verwijderde petrischaal en was de embryo's uit de schotel met de zoutoplossing en een schone kwast. </li><li> Het verzamelen van de embryo's in een fijne zeef. Spoelen met zoutoplossing om eventuele overtollige gist te verwijderen. </li><li> Met behulp van een spatel voorzichtig pick-up van de embryo's en leg ze in een klein glazen flesje met een dop. Voeg ongeveer 1 ml zoutoplossing. </li></ol> 3. Verwijdering van de Chorion en Vitelline Membranen en fixatie <ol><li> Na het verzamelen van embryo's, de voorbereiding van de heptaan-Fix-oplossing door het combineren van 50% heptaan en 50% fixeermiddel. De oplossing zal worden gelaagd met heptaan aan de bovenkant en het fixeermiddel op de bodem. </li><li> In het glazen flesje was de embryo's door het incuberen van hen in de zoutoplossing gedurende 5 minuten. Verwijder overtollig zout met behulp van een Pasteur pipet. </li><li> Spoel de embryo's met gedeïoniseerd water. </li><li> Dechorionate de embryo's door het incuberen van hen in 50% bleekwater gedurende 3 minuten. </li><li> Spoel de embryo's met gedeïoniseerd water. </li><li> Bevestig de embryo's door het incuberen ze gedurende 30 minuten in de Heptane-Fix oplossing met zacht schudden. </li><li> Met behulp van een Pasteur pipet vervangen door het fixeermiddel (onderste laag) met methanol het verlaten van de heptaan in de buis. Schud krachtig om de vitelline membraan te verwijderen. De devitellinized embryo's zal zinken naar de bodem van de buis. </li><li> Het verzamelen van de embryo's in een nieuwe glazen flacon met behulp van een Pasteur pipet. Spoel de embryo's vijf keer met methanol, telkens uitbroeden van de embryo's voor 5 minuten. </li></ol> 4. Antilichaam kleuring, Montage, en Visualisatie <ol><li> Hydrateren de embryo's in een mengsel van 50% PBT-oplossing en 50% methanol gedurende 5 minuten. Vervolgens hydrateren in 100% PBT-oplossing gedurende 5 minuten. </li><li> Blokkeer de embryo's door het incuberen van hen in 5% BSA met 0,01% NaAcide-oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Embryo's zijn nu klaar voor antilichaam kleuring. Bereid de primaire antilichaam door het verdunnen van het aan de juiste concentratie met 5% BSA met 0,01% NaAcide oplossing. We maken gebruik van een antilichaam tegen de cysteine ​​snaar eiwit (CSP), een vesiculaire synaptische eiwit en een anti-HRP of mierikswortelperoxidase antilichaam, dat een specifieke neuronale-koolhydraatgroep aanwezig in het oppervlak glycoproteïnen en labels alle neuronen herkent. </li><li> Incubeer de embryo's een nacht bij 4 ° C in het primaire antilichaam oplossing. </li><li> De volgende dag, was de embryo's 10 keer met PBT in de loop van een uur. </li><li> Bereid het secundaire antilichaam oplossing door verdunning van de juiste concentratie. We maken gebruik van Alexa secundaire antilichamen bij een concentratie van 1:200. </li><li> Incubeer de embryo's gedurende twee uur in 4 ° C in het secundaire antilichaam oplossing. </li><li> Was de embryo's 10 keer met PBT in de loop van een uur. </li><li> Incubeer de embryo's 's nachts in Vectashield Mounting Medium. </li><li> Monteer de embryo's op een glasplaatje en sluit de deksel slip met nagellak. Visualiseer embryo's met behulp van een fluorescentie microscoop. </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Samengevoegd Figuur 1: Een vertegenwoordiger van beelden die het embryonale stadium CNS in 16-17, met behulp van antilichamen tegen CSP (rood) en HRP (groen). Let op de duidelijke kleuring van de commissuur. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> HRP-FITC "/&gt; Samengevoegd Figuur 2: Een vertegenwoordiger van beelden die het embryonale stadium PNS in 16-17 met behulp van antilichamen tegen CSP (rood) en HRP (groen). Let op de herhaalde patronen van de perifere neuronen.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

De Drosophila embryo is een krachtig systeem voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire veranderingen tijdens neuronale ontwikkeling. In dit protocol hebben we laten zien hoe je ganse berg embryo&#39;s voor te bereiden op immunohistochemie. We hebben aangepast dit protocol bij het protocol beschreven in Carroll en Scott, 1985. Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere neuronale antistoffen te testen, maar optimalisatie van antilichamen moet worden gedaan. Verder kunnen defecten in de ontwikkel...

<table><tbody><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Geit Anti-Muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montage Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount drosophila embryo&#39;s

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

De Drosophila embryo is een aantrekkelijk model voor onderzoek naar de cellulaire en moleculaire basis van neuronale ontwikkeling. Hier beschrijven we de procedure voor de visualisatie van Drosophila embryonale zenuwstelsel met behulp van antilichamen tegen neuronale eiwitten. Omdat de hele embryonale perifere zenuwstelsel en het centrale zenuwstelsel zijn goed gekarakteriseerd op het niveau van individuele cellen (Dambly-Chaudière et al., 1986;.. Bodmer et al., 1987;. Bodmer et al., 1989), eventuele afwijkingen aan deze systemen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen verschillende neuronale eiwitten. De zich ontwikkelende embryo&#39;s worden verzameld op bepaalde tijden te zorgen dat de embryo&#39;s worden in de juiste ontwikkelingsstadia voor visualisatie. Na het verzamelen, worden de buitenste lagen van het embryo, het chorion membraan en de vitelline envelop dat het embryo omgeeft, verwijderd voordat fixatie. Embryo&#39;s worden vervolgens geïncubeerd met neuronale antilichamen en gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde secundaire antilichamen. Embryo&#39;s in stadia 12 tot 17 worden gevisualiseerd op de embryonale zenuwstelsel toegang. In fase 12 van de CNS kiem band begint verkorten en door etappe 15 de definitieve patroon van de commissuur is bereikt. Per fase 17 van de CNS contracten en de PNS is volledig ontwikkeld (Campos-Ortega et al.. 1985). Zo veranderingen in het patroon van de PNS en CNS kan gemakkelijk worden geobserveerd tijdens deze ontwikkelingsstadia.

Beschrijven we de procedure voor te bereiden geënsceneerde<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s voor de visualisatie van de embryonale zenuwstelsel tijdens de embryogenese.

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Het Drosophila-embryo is een aantrekkelijk modelsysteem voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire basis van neuronale ontwikkeling. Hier beschrijven wij de ...

Het algemene doel van deze procedure is om oph- en melanogaster-embryo's voor te bereiden voor whole mount-visualisatie van het zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen van de betreffende vliegenstam. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van het chorion met bleekmiddel.De derde stap van de procedure is het aanbrengen van heptaan en methanol om het viline-membraan te verwijderen. De laatste stap van de procedure is het aanbrengen van antilichamen op de embryo's. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de structuur van het zenuwstelsel van het drosophila-embryo tonen via immunofluorescentiemicroscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen, zoals de rol die mutaties kunnen spelen in het ontwikkelende zenuwstelsel. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat ze per ongeluk embryo's uit het vials kunnen pipetteren. Begin dit protocol met het klaarmaken van de benodigde reagentia, waaronder P-E-M-F-A, PBC-buffer met 5% BSA en 0,01% natriumazide zoutoplossing en formaldehyde-fixatief.Bereid een kooi voor voor de gewenste drosophila-stam door de v

visualization-embryonic-nervous-system-whole-mount-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Drosophila melanogaster larven zorgen voor een ideaal modelsysteem om de mechanismen van het axonaal transport te onderzoeken binnen de larvale segmentale zenuwen. Met behulp van deze procedure, kan 3 e instar larven dragen verschillende mutaties worden vergeleken met wild-type larven.

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Hier presenteren wij een montage protocol voor...

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

We beschrijven een protocol voor dissectie, fixatie en immunokleuring van steroidogenic organen in Drosophila larven en volwassen vrouwtjes steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme bestuderen. Naast steroïdogene organen visualiseren we de innervatie van steroidogenic organen en steroidogene doelcellen zoals kiemlijn stamcellen.

Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

Dit protocol beschrijft drie stappen om larvale en volwassen Drosophila optische kwabben voor te bereiden op beeldvorming: 1) hersendissecties, 2) immunohistochemie en 3) montage. De nadruk wordt gelegd op stap 3, omdat er verschillende montagerichtingen nodig zijn om specifieke optische lobstructuren te visualiseren.

Dissectie, immunohistochemie en montage van larvale en volwassen Drosophila-hersenen voor visualisatie van optische kwabben

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Leer het embryonale zenuwstelsel visualiseren in Drosophila-embryo's met immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode helpt onderzoekers genetische mutaties in de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen.

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo's

Meer video's verkennen