Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo's

Het algemene doel van deze procedure is om oph- en melanogaster-embryo's voor te bereiden voor whole mount-visualisatie van het zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen van de betreffende vliegenstam. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van het chorion met bleekmiddel.

De derde stap van de procedure is het aanbrengen van heptaan en methanol om het viline-membraan te verwijderen. De laatste stap van de procedure is het aanbrengen van antilichamen op de embryo's. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de structuur van het zenuwstelsel van het drosophila-embryo tonen via immunofluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen, zoals de rol die mutaties kunnen spelen in het ontwikkelende zenuwstelsel. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat ze per ongeluk embryo's uit het vials kunnen pipetteren. Begin dit protocol met het klaarmaken van de benodigde reagentia, waaronder P-E-M-F-A, PBC-buffer met 5% BSA en 0,01% natriumazide zoutoplossing en formaldehyde-fixatief.

Bereid een kooi voor voor de gewenste drosophila-stam door de vliegen uit te schakelen met kooldioxide en vervolgens ten minste 100 vliegen over te brengen naar een plastic fles met een adapter met een appelmassa-agarvoedingsplaat. Plaats de kooi met vliegen 72 uur lang in het donker bij kamertemperatuur. Vervang de appelmassa-agarvoedingsplaten elke acht tot 12 uur, zodat de vliegen aan de kooi wennen en hun eieren niet vasthouden voor het experiment.

Verzamel na de acclimatisatieperiode van 72 uur de embryo's 12 uur na de laatste wisseling van de voedingsplaat met appelsapsagar. Verwijder de voedingsplaat met appelsapsagar uit de legkooi en vervang deze door een zoutoplossing. Spoel de voedingsplaat met appelsapsagar af.

Vang de embryo's op in een fijne zeef. Gebruik een schone verfkwast om embryo's die nog aan de plaat kleven los te maken. Spoel de embryo's in de zeef met zoutoplossing om overtollige gist te verwijderen; gebruik vervolgens een spatel om de embryo's voorzichtig op te pakken en plaats ze in een klein glazen flacon.

Voeg ongeveer 1 mL zoutoplossing toe. Sluit vervolgens het flaconnetje en incubeer gedurende vijf minuten om de embryo's te wassen. Na de collectie van embryo's.

Bereid de met heptaan gefixeerde oplossing door 50% heptaan en 50% fixatief te combineren. De oplossing zal gelaagd zijn met heptaan bovenop en het fixatief aan de onderzijde. Nadat er vijf minuten zijn verstreken, gebruikt u een pastapipet om het overtollige zoutoplossing uit het glazen vials met embryo's te verwijderen.

Spoel de embryo's af met gedeïoniseerd water door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water toe te voegen aan het glazen vials waarin de embryo's zich bevinden. Laat de embryo's één minuut rusten voordat het water wordt verwijderd met een 50% bleekoplossing. Schud het vial een paar keer handmatig en incubeer vervolgens gedurende drie minuten om de embryo's te coaten.

De behandelde embryo's zullen naar de bodem van het flacon zakken. Embryonale COR's zullen drijven. Verwijder het bleekmiddel en de COR's na de incubatie van drie minuten.

Spoel de embryo's na de decoratie grondig af met gedeïoniseerd water door ongeveer één milliliter gedeïoniseerd water toe te voegen aan het glazen vial met de embryo's. Laat de embryo's één minuut rusten voordat het water wordt verwijderd; overgebleven COR's zullen drijven en moeten worden verwijderd. Voeg de heptaan-fixatieoplossing toe aan de embryo's en incubeer deze gedurende 30 minuten onder zachte schudding om ze te fixeren.

Gebruik een pasta-pipet om het fixeer middel, de onderste laag, te verwijderen, zodat het heptaan in de buis achterblijft. Voeg vervolgens methanol toe aan de bodem van de buis ter vervanging van het fixeer middel, sluit de buis af en schud deze krachtig met de hand om het vitellijn membraan te verwijderen. Na deze stap zullen de geëxfolieerde embryo's naar de bodem van de buis zakken.

Verwijder met een Pasteurpipet de methanol en de huls uit het vial, zodat de gedeïoniseerde embryo's achterblijven. Spoel de embryo's vervolgens vijf keer met methanol en verwijder de methanol tussen elke spoelbeurt met een Pasteurpipet. Incubeer de embryo's bij elke spoelbeurt vijf minuten.

Plaats de embryo's gedurende vijf minuten in een mengsel van 50% PBT-oplossing en 50% methanol om ze te rehydrateren. Zet het rehydratieproces vervolgens voort door ze gedurende vijf minuten over te brengen naar een 100% PBT-oplossing. Blok daarna de embryo's door ze gedurende één uur bij vier graden Celsius te incuberen in een 5% BSA-oplossing met 0,01% natriumazide.

Bereid vervolgens het primaire antilichaam voor de embryo-kleuring voor door het te verdunnen tot de juiste concentratie met een 5% BSA-oplossing met 0,01% natriumazide. De hier gebruikte antilichamen zijn gericht tegen het vesiculaire cysteïne-string-eiwit en het anti-HRP-antilichaam. Anti-HRP herkent een neurale specifieke koolhydraatgroep in de oppervlakte-glycoproteïnen, waardoor alle neuronen worden gelabeld.

Incubeer de embryo's overnight bij vier graden Celsius in de primaire antilichaamsoplossing. Was de embryo's 10 keer met PBT gedurende een uur. Voeg ongeveer één milliliter PBT toe aan het glazen vial met de embryo's en laat de embryo's zes minuten inwerken voordat de PBT wordt verwijderd.

Herhaal dit proces van het aanbrengen van PBT, incuberen en het verwijderen van PBT 10 keer. Bereid de secundaire antilichaamoplossing in het donker voor, aangezien deze lichtgevoelig is, door te verdunnen tot de juiste concentratie. Wij gebruiken Alexa secundaire antilichamen in een concentratie van 1:200.

Incubeer de embryo's gedurende twee uur bij vier graden Celsius in de secundaire antilichaamoplossing. Wikkel het glazen buisje met de embryo's en de secundaire antilichaamoplossing in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Was de embryo's 10 keer met PBT gedurende een uur.

Voeg vector shield monteermedium toe aan de embryo's en laat ze een nacht incuberen bij vier graden Celsius om ze te monteren. Gebruik een pasteurpipet om de embryo's samen met een beetje monteermedium op te zuigen. Breng de embryo's en het medium aan op een glazen objectglas.

Plaats een dekglas over de embryo's en seal het dekglas met nagellak. Visualiseer de embryo's hier met een fluorescentiemicroscoop. Het embryonale CZS wordt getoond in stadium 16 tot 17.

Cystine string-eiwit is in het rood weergegeven. HRP-neuronen zijn in het groen weergegeven. Let op de duidelijke kleuring van de commissuur in deze representatieve afbeelding.

Het embryonale PNS wordt getoond in stadium 16 tot 17. Opnieuw is het cystine string-eiwit in het rood weergegeven en de neuronen in het groen. Let op de herhalende patronen van perifere neuronen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met de embryo's, zodat u ze niet per ongeluk uit het vials verwijdert. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u oph fla embryo's moet prepareren voor whole mount visualisatie van het zenuwstelsel.