Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Het algemene doel van het volgende experiment is om RNA-DNA-hybriden op chromosomaal niveau te genereren in levende gistcellen door de gistcellen te transformeren met RNA-bevattende oligos. Dit wordt bereikt door een enkelstrengs RNA-bevattende oligo te introduceren in delende gistcellen. De oligo zal vervolgens annealen met de complementaire regio van een gemuteerd markergen op een gistchromosoom om een RNA-DNA-hybride te vormen. Als tweede stap worden de cellen die zijn getransformeerd door de RNA-bevattende oligo uitgeplaat op selectieve media.

Dit maakt de groei mogelijk van cellen waarin het RNA-gedeelte van de oligo dient als sjabloon voor de correctie van het gemuteerde markergen. Vervolgens worden de gistkolonies die groeien op de selectieve media geteld om de frequentie van gen-correctie door de RNA-bevattende oligo vast te stellen; de resultaten tonen de overdracht van genetische informatie aan van het RNA-traject van de oligo naar het gemuteerde markergen in het gistgenoom. Dit is evident uit restrictiedigestie-analyse, sequentieanalyse en de alkalische labiliteitsassay.

Hallo, ik ben de oprichter van HIN, het laboratorium van Dr. Francesca aan de school voor biologie van het Georgia Institute of Technology. Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van RNA-DNA-hybriden op chromosomaal niveau in levende gistcellen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe de aanwezigheid van RNA ingebed in genomisch DNA door cellen wordt getolereerd en om vast te stellen welke factoren de stabiliteit van RNA-DNA-hybriden in vivo beïnvloeden.

Laten we beginnen. Veeg vóór de start van deze procedure alle materialen die voor het experiment worden gebruikt, waaronder oligo-buisjes, pipetten, vortex-rekken, het experimentele oppervlak en de handschoenen van de onderzoeker, af met een RNA-decontaminatieoplossing. Gebruik gedurende de gehele procedure RNA-vrij water, chemische reagentia, buisjes en pipetpunten om eventuele RNA-contaminatie te voorkomen.

Verkrijg een RNA-bevattende oligo om genetische informatie over te dragen naar het genomische DNA van gistcellen. De hier gebruikte giststam bevat een mutant trip vijf-gen met een deletie van twee basen en één nonsense-mutatie. Een dergelijke giststam is een tryptofaan-atrofische mutant en vormt geen kolonies op media zonder tryptofaan.

Het RNA-bevattende oligo is een 65-mer met een DNA-insertie van twee basen, ontworpen om de deletiemutatie te corrigeren. Daarnaast bevat het oligo één ribonucleotide om de nonsense-mutatie van het trip-5-allel te corrigeren. Zodra deze is verkregen, dient het RNA-bevattende oligo te worden klaargemaakt als een stockoplossing van 250 µM, zoals beschreven in het geschreven protocol. Inoculeer 16 uur vóór de transformatie met het RNA-bevattende oligo.

Voeg vijf milliliter rijk gistpeptide-dextrose of YPD vloeibaar medium toe aan de trip five mutante gistcellen en kweek de cellen gedurende de nacht bij 30 °C. Draag na de incubatie overnacht 1,5 milliliter van de overnachtcultuur over naar 50 milliliter YPD vloeibaar medium. Incubeer de cellen in een schudmachine bij 30 °C bij 225 omwentelingen per minuut gedurende vier uur vlak voor het ontdooien van de transformatie.

Plaats de RNA-bevattende oligos en de bijbehorende DNA-only oligos op ijs. De bijbehorende DNA-only oligos worden gebruikt als positieve controle. Verdun de oligos tot 50 µM met RNA-vrij water in RNA-vrije buisjes.

Bereid 70 µL van elke oligo voor om voldoende monster te hebben voor drie transformaties van één mol met een kleine overmaat. Denatureer de RNA-bevattende en DNA-alleen oligos op het warmteblok van 100 °C gedurende twee minuten om secundaire structuren van de oligos onmiddellijk na denaturatie te elimineren. Plaats de buisjes op ijs en houd ze daar tot de transformatie. Bereid oplossing één en oplossing twee onmiddellijk voor de transformatie in RNA-vrije buisjes. Draag de celcultuur over naar een 50 mL RNA-vrij buisje en centrifugeer bij 3000 rpm, wat overeenkomt met 1.562 ×g, gedurende twee minuten.

Verwijder het supernatant en was de cellen met 50 milliliters RNAse-vrij water. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 3000 rotations per minute gedurende twee minuten. Herhaal dit proces vijf keer om het kweekmedium en eventueel aanwezige RNAse na de laatste centrifugering te verwijderen.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vijf milliliters oplossing. Eén. Centrifugeer het monster op 3000 rotaties per minuut gedurende twee minuten, gooi het supernatant weg en voeg 250 microliters van oplossing één toe aan de cellen. Deze hoeveelheid cellen is voldoende voor zeven tot acht transformaties.

Verdeel aliquots van 50 µL van de celsuspensie over zeven RNA-vrije microcentrifugebuisjes. Voeg vervolgens 20 µL van de 50 µM RNA-bevattende oligo toe aan drie buisjes, 20 µL van de 50 µM DNA-only oligo aan drie buisjes en 20 µL steriel water zonder oligo aan één buisje als negatieve controle.

Voeg vervolgens voor elk van de zeven transformatiereacties 300 µL van oplossing twee toe. Vortex de monsters krachtig om de componenten te mengen. Incubeer de transformatiereacties na incubatie 30 minuten bij 30 °C in een schudmachine.

Zet de monsters bloot aan een hitte-shock bij 42 °C gedurende 15 minuten. Centrifugeer de cellen vervolgens 4 minuten lang bij 5.000 toerentallen per minuut, wat overeenkomt met 2.236 ×g. Verwijder het SUP-agens en resuspendeer de cellen in 100 µL steriel water voor elk van de drie buizen.

Neem een aliquot van deze celsuspensie en verdun elke aliquot met steriel water in een verhouding van 100.000 keer. Voeg ongeveer 15 steriele glaskralen per plaat toe en breng 100 µL van de 100.000 keer verdunde cellen aan op drie YPD-platen. Breng 100 µL van de resuspendeerde cellen van elke transformatiereactie aan op één petrischaal met synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan en schud de platen gelijkmatig.

Verwijder vervolgens de beads. Incubeer de cellen op YPD-platen bij 30 °C gedurende twee dagen en incubeer de cellen die zijn geplaatst op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan bij 30 °C gedurende vier tot vijf dagen. Tel en vergelijk het aantal gegroeide kolonies op het selectieve medium en op het YPD-medium om de gen-correctiefrequentie te berekenen voor de oligo met RNA, de oligo met alleen DNA en voor de controle zonder oligo.

Er wordt geen kolonievorming verwacht op het selectieve medium wanneer er geen oligos aan de cellen zijn toegevoegd; strijk verschillende willekeurig gekozen getransformeerde kolonies uit op YPD-medium om enkelkolonie-isolaten te verkrijgen. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 30 °C voor de groei van de kolonies. Kies na incubatie verschillende enkelkolonies en maak patches op YPD en op het selectieve medium.

Na een incubatie van één dag wordt groei waargenomen voor de cellen die getransformeerd zijn met de oligos op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan, maar niet voor de controlestam zonder oligo op het selectieve synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan. Ontwerp vervolgens een paar primers om de regio die getarget wordt door de RNA-bevattende oligo te amplificeren met behulp van kolonie-PCR om met de kolonie-PCR te beginnen. Resuspendeer de cellen die van de individuele patches zijn genomen in 50 µL water met één unit lyase en incubeer de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie in een heatblock bij 100 °C gedurende vijf minuten om de cellen te lyseren en genomisch DNA in de oplossing vrij te maken.

Bereid de PCR-reacties voor in PCR-buisjes door 10 µL van de celsuspensie aan elk voorbereid buisje toe te voegen en voer de amplificatiereactie uit zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Analyseer de resulterende monsters op een 1% agarosegel om het PCR-product waar te nemen. Aangezien de genetische informatie die in dit experiment door het RNA-bevattende oligo wordt overgedragen een nieuwe VAN 91 1 restrictieplaats genereert in de genomische targetregio van de gist, is het mogelijk om de correcte overdracht van informatie te verifiëren door het PCR-product te couperen met het restrictie-enzym van 91 1.

Stel de digestiereactie samen met zes µL PCR-product, buffer, 0,5 µL BSA, het restrictie-enzym en steriel water tot een totaalvolume van 15 µL. Incubeer de monsters gedurende één uur bij 37 °C. Voer een niet-gedigesteerd monster samen met de gedigesteerde monsters uit op dezelfde rij van een 2% agarosegel om de genetische modificatie te observeren die is overgedragen door het RNA-traject van de RNA-bevattende oligo.

Zuiver de PCR-producten met een PCR-zuiveringskit en bereid ze voor op DNA-sequencing. Dien de monsters in voor sequencing met dezelfde primers die zijn gebruikt om het product te amplificeren. Analyseer tot slot de DNA-sequencingresultaten met software die de alignment van meerdere sequenties met een gekozen referentievolgorde mogelijk maakt, om een alkalische behandeling van het RNA-bevattende oligo voor elke reactie uit te voeren met één mol van het RNA-bevattende oligo of het DNA-only oligo in een 1,5 milliliter buisje.

Voeg vervolgens 4 µL 1 M natriumhydroxide toe voor hydrolyse of 4 µL water voor de negatieve controle. Incubeer de monsters na incubatie gedurende één uur in een waterbad bij 65 °C. Plaats de reactie op ijs.

Neutraliseer de hydrolysereactie met twee µL 1,2 M zoutzuur, vier µL 1 M tris-hydrochloride en vier µL water voor de negatieve controle. Voeg zes µL water en vier µL 1 M tris-hydrochloride toe. Bewaar de monsters op ijs totdat de transformatie kan worden uitgevoerd.

Zoals zojuist beschreven, vormen gistcellen die niet met een oligo zijn getransformeerd geen kolonies op het synthetische complete vaste medium zonder tryptofaan. Omgekeerd vertonen cellen die zijn gegroeid op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan, nadat de cellen zijn getransformeerd met één oligo van het RNA-bevattende oligo, nu wel kolonies.

Gistkolonies groeien ook op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan nadat cellen zijn getransformeerd met slechts één nanomol van de overeenkomstige DNA-alleen controle-oligo; de detectie van genetische informatieoverdracht van de RNA-bevattende oligo naar het chromosomale DNA van de gist is evident door VAN 91 1 restrictiedigestie van het PCR-product dat de doellocatie in het genoom amplificeert; zoals getoond kan het PCR-product van de trip. Five locus, geamplificeerd uit het genomische DNA van de trip. Five mutantstam, worden gezien.

Ook wordt het PCR-product getoond dat is geamplificeerd uit genomisch DNA afgeleid van een trip plus-kolonie die is gericht op de DNA-only oligo. De PCR-producten die zijn geamplificeerd uit genomisch DNA afgeleid van trip plus-kolonies gericht op de RNA-bevattende oligo zijn eveneens op de gel geladen. De resultaten van de van 91 1 restrictiedigestie van dezelfde PCR-producten onthullen een geamplificeerde PCR-band van 278 baseparen en de digestieproduct-banden door van 91 1 van 177 baseparen en 101 baseparen.

DNA-sequencing onthult de gen correctie door het RNA-bevattende oligo hier. Een DNA-electropherogram van de genomische regio die door het RNA-bevattende oligo wordt getarget, wordt getoond. De g in de DNA-sequentie is afkomstig van de RG op het RNA-bevattende oligo go.

Ook omkaderd is de insertie van de CG-basissequenties van de trip vijf-regio van de trip plus-transformanten die gericht zijn door de DNA-only oligo en de RNA-bevattende oligo; deze komen overeen met de consensussequentie en worden vergeleken met die van de trip vijf-mutante cellen vóór targeting door de oligo's. De herstel-RNA-bevattende oligo onderaan heeft een insertie van twee basen DNA en een substitutie van één base RNA.

De blauw omkaderde regio's met gele schaduw tonen aan dat zowel de RNA-bevattende oligo als de uitsluitend DNA-bevattende oligo de deletiemutatie en de nonsense-mutatie in alle geteste monsters nauwkeurig hebben gecorrigeerd; de streeplijnen markeren de positie van de RNA-bevattende oligosequentie. Alkalische behandeling voorkomt gen correctie door de RNA-bevattende oligo; de transformatiefrequentie door de RNA-bevattende oligo en de uitsluitend DNA-bevattende oligo wordt weergegeven. De foutenbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde voor drie onafhankelijke transformaties per oligo.

De DNA-only oligo vertoont een vergelijkbare transformatiefrequentie met en zonder behandeling met natriumhydroxide. Omgekeerd daalt de transformatiefrequentie van de RNA-bevattende oligo naar nul na behandeling met natriumhydroxide. Daarom is de preparatie met de RNA-bevattende oligo niet gecontamineerd met DNA-only oligo.

De waargenomen transformatiefrequentie is dus specifiek voor het RNA-bevattende oligonucleotide. We hebben zojuist aangetoond hoe een RNA-DNA-hybride op chromosomaal niveau kan worden gevormd en hoe de overdracht van genetische informatie van RNA naar genomisch DNA in gistcellen verloopt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de RNA-bevattende oligonucleotiden van uitstekende kwaliteit zijn en dat er onder RNA-vrije omstandigheden wordt gewerkt.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.