Name: Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Leer hoe je RNA/DNA-hybriden genereert in levende gistcellen met behulp van RNA-bevattende oligonucleotiden. Deze methode maakt genecorrectie mogelijk en biedt inzicht in genetische informatieoverdracht.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Georgia Cancer Coalition subsidie-R9028.

Motivering Het benutten van het gebruik van Thermo Scientific Dharmacon oligo's, 50 tot 80-mers, hier presenteren we een procedure, op basis van een gen correctie-test, waarmee oligos kan de genetische informatie over te dragen aan genomisch DNA van gistcellen, na gloeien naar het doel chromosomale DNA. Succesvolle targeting door oligo's wordt gescoord door de verschijning van gist kolonies weergave van het verwachte fenotype. Als de gewenste genetische modificatie wordt uitgevoerd binnen een of meer ribonucleotiden opgenomen in de oligo volgorde, de genetische informatie vloeit rechtstreeks voort uit het RNA-darmkanaal om de chromosomale doel-DNA, dus een RNA / DNA hybride vormen op de chromosomale niveau tijdens de targeting proces. De ribonucleotide / s van een Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo kan dienen als sjabloon voor gen-targeting via DNA-reparatie synthese of kan worden ingebed in het DNA en dienen als template tijdens de replicatie van DNA. In deze experimenten gebruiken we de gist / Saccharomyces cerevisiae / eukaryotische model systeem, maar een dergelijke benadering kan ook worden toegepast in andere organismen of celtypen. In deze video maken we gebruik van een Thermo Scientific Dharmacon oligo ontworpen met homologie met een doel gist genomische locus en die een ribonucleotide in het midden om een ​​mutatie in het target-gen te corrigeren. Na transformatie met de RNA-bevattende oligo, zien we de correctie van de beoogde site op een bepaalde frequentie, wat aangeeft dat de RNA-darmkanaal van de oligo zou kunnen worden opgenomen in het chromosomale DNA en dienen als template voor DNA-synthese tijdens de DNA-replicatie. De genetische informatie uitgevoerd in het RNA-darmkanaal is stabiel doorgegeven aan de volgende cel generaties. Hier beschrijven we de stappen van de gistcel transformatie door de Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo en de aanpak van het RNA-informatie overdracht in het chromosomale DNA te detecteren. A. Ontwerp van de RNA-bevattende Oligo gebruikt in dit experiment We hebben een RNA-bevattende oligo aan een genetisch defect in de gist juiste S. cerevisiae chromosomale DNA in de trp5 locus. De gist stam gebruikt in de protocol bevat een mutant trp5 gen met een twee-base verwijderen en een nonsense mutatie (figuur 1A). Dergelijke giststam is een tryptofaan auxotrofe mutant en niet kolonies op media vorm zonder tryptofaan. De DNA-sequentie van de TRP5-gen is te vinden op de Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). De Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo gebruikt in dit protocol is een 65-mer met een 2-base DNA insertie, ontworpen om de verwijdering mutatie en een ribonucleotide ontworpen om de nonsense mutatie van het trp5 allel (Figuur 1A) correct te corrigeren. De volgorde van de oligo is als volgt opgebouwd: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Dit oligo wordt gesynthetiseerd door Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) bij 200 nm schaal, en wordt ontzout, ontschermd en gebruikt zonder PAGE zuivering. B. Bereiding van de RNA-bevattende Oligo voor Gist Transformatie (gemodificeerd van Storici et al.., 2007 1) <ol><li> Veeg materialen die gebruikt zal worden voor het experiment met inbegrip oligo buizen, pipetten, vortex, rekken, experimentele gebied en handschoenen gedragen door de onderzoeker met RNase decontaminatie oplossing voor potentiële RNase vervuiling te verwijderen voordat alles begint. Gebruik RNase-vrij water, chemische reagentia, buizen en pipetpunten in alle stappen. Elke stap in dit experiment moet worden RNase-vrij. </li><li> Resuspendeer de Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo ontvangen van de onderneming tot 250 pmol / ul voorraad oplossing met RNase-vrij water en vortex krachtig om de pellet te ontbinden. Bewaren bij -80 ° C. </li><li> Vlak voor de transformatie, dooi de RNA-bevattende oligo op het ijs en vul aan tot 50 pmol / ul met RNase-vrij water in RNase-vrij buizen. Elke transformatie vereist een nmol van het RNA-bevattende oligo's. </li><li> Denatureren een gekozen bedrag van het RNA-bevattende oligo's op de 100 ° C verwarmen blok voor 2 minuten naar secundair structuren van de oligos te elimineren. </li><li> Onmiddellijk na denaturatie plaats de buis op ijs. Te houden op ijs tot transformatie. </li><li> Als controle in het experiment een overeenkomstige DNA-oligo alleen wordt gebruikt. Dit oligo is ontdooid van -20 ° C en voorbereid voor de transformatie als de RNA-bevattende oligo, zoals hierboven beschreven. </li></ol> C. transformatie van gistcellen met behulp van de RNA-bevattende Oligo <ol><li> Inoculeer 5 ml van de rijke YPD vloeibaar medium met de trp5 mutant gistcellen en groeien bij 30 ° C gedurende de nacht (zie ook Materiaal). </li><li> Overdracht 1,5 ml van de overnacht cultuur in 50 ml YPD vloeibaar medium. </li><li> Incubeer cellen in een 30 ° C shaker (225 rpm) voor 4 uur. </li><li> Bereid Oplossing 1 en Oplossing 2 immediately voor transformatie in RNase-vrij buizen (zie ook Materiaal). </li><li> Breng de celcultuur om een ​​50 ml RNase-vrij buis en draaien op 3000 rpm, wat overeenkomt met 1562 g, gedurende 2 minuten. De pellet van de cel neerslag is ongeveer. 0,3 cm 3. </li><li> Verwijder het supernatant en was cellen met 50 ml RNase-vrij water en draaien op 3000 rpm gedurende 2 minuten. </li><li> Herhaal stap 6 voor 5 keer om zich te ontdoen van het kweekmedium en RNases die aanwezig kunnen zijn in het medium zo veel mogelijk. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml van oplossing 1 en draaien op 3000 rpm gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 250 ul van een oplossing. Deze hoeveelheid cellen is voldoende voor 7-8 transformaties. </li><li> Aliquot 50 pi van de celsuspensie in RNase-vrije microcentrifugebuizen, voeg 20 ul van RNA-bevattende oligo werkoplossing (1 nmol), of 20 ul van DNA-only oligo werkoplossing (1 nmol), of 20 ul steriel water zonder oligo voor de negatieve controle. Voeg vervolgens 300 pl Oplossing 2 voor elke transformatie reactie. Er is geen noodzaak om zalmsperma DNA toe te voegen in het proces van transformatie, zoals de oligos fungeren als drager zelf. </li><li> Vortex krachtig te mengen componenten homogeen. </li><li> Incubeer transformatie reacties bij 30 ° C gedurende 30 min in een shaker. </li><li> Heat shock bij 42 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Spin down-cellen bij 5000 tpm, wat overeenkomt met 2.236 gram, voor 4 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 100 ul steriel water. </li><li> Neem een ​​deel van deze celsuspensie en verdunnen met steriel water met 100.000 maal en plaat cellen op een YPD plaat met behulp van ca.. 15 steriele glazen kralen en incubeer bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Plaat alle geresuspendeerd cellen van elke transformatie reactie op een petrischaal van synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan (SC-Trp) met behulp van ca.. 15 steriele glazen kralen en incubeer bij 30 ° C gedurende 4-5 dagen (figuur 2). </li></ol> D. Analyse van Gene Correctie door de RNA-bevattende Oligo <ol><li> Tel het aantal kolonies gegroeid op het selectieve medium (Figuur 2) en op YPD medium om het gen correctie frequentie te berekenen voor de RNA-bevattende oligo, de DNA-only oligo en voor de no-oligo controle. Vergelijk de verkregen nummer. Spontane terugkeer tarief van de trp5 allelen met de twee-base deleties en de nonsense mutatie is minder dan 10-9 in de gebruikte giststam, dus we verwachten geen koloniën formatie op het selectieve medium als er geen oligo's worden toegevoegd aan de cellen. </li><li> Streak uit diverse willekeurig transformant kolonies opgepikt op YPD middellange tot enkele kolonie isoleert te verkrijgen. Wacht twee dagen voor de kolonie groei, vervolgens een aantal (minimaal 5) enkele kolonies en maken vlekken op YPD en op selectief medium. </li><li> Ontwerp een paar primers in de regio (250-1,000 bp) het doelwit van de RNA-bevattende oligo door de kolonie PCR (figuur 1B) te versterken. De procedure voor kolonie PCR is als volgt (gewijzigd uit Storici en Resnick, 2006 2). <ol><li> Resuspendeer cellen (ca. 1 mm3) genomen uit de individuele patches in 50 ul van het water en voeg een eenheid van lyticase. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min, gevolgd door incubatie in een warmte-blok bij 100 ° C gedurende 5 minuten naar de cellen en laat genomische DNA in oplossing te breken. </li><li> PCR-condities: De PCR-reactie omvat 10 ul van de cel resuspensie oplossing, 50 pmol elk van de voor-en achteruit primers, is een ui 10 mM dNTPs, een eenheid van Taq-polymerase, 5 ul van 10x buffer en aangepast met steriel water om een eindvolume van 50 pi. Het PCR-programma is 3 min bij 95 ° C, 30 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C, en een min bij 72 ° C, een laatste verlenging tijd van 7 minuten bij 72 ° C, dan monsters worden bewaard bij 4 ° C. Een verlenging tijd van 1 min / kb is aangenomen voor deze reactie. </li><li> Na de PCR worden stalen draaien op een 1% of 2% (afhankelijk van de verwachte grootte van het PCR-product) agarosegel voor observatie van de PCR-product (figuur 3). </li></ol></li><li> Als de genetische informatie overgedragen door de RNA-bevattende oligo genereert een nieuwe beperking site in de gist genomische doelregio (Figuur 1B), is het mogelijk om de juiste overdracht van informatie te verifiëren door het verteren van het PCR-product met de juiste restrictie-enzym. Als er geen restrictie site wordt gegenereerd door de RNA-bevattende oligo, ga dan naar stap 6. Digest PCR-producten met een specifieke restrictie-enzym. De spijsvertering reactie omvat 6 pi PCR-product, buffer, BSA (misschien niet nodig zijn voor sommige enzymen, zie instructie voor de gebruikte enzym), 0,5 pi van restrictie-enzym, en steriel water tot 15 pl. Monsters worden geïncubeerd gedurende 1 uur bij de temperatuur die specifiek zijn voor het gebruikte enzym. </li><li> Runnen samen een onverteerd monster met de verteerde monsters op dezelfde rij van een 2% agarose gel met de genetische modificatie in acht overgedragen by de RNA-darmkanaal van het RNA-bevattende oligo (figuur 3). </li><li> Zuiver PCR-producten met behulp van een PCR zuivering kit en voor te bereiden hen voor DNA-sequencing. Monsters voor sequencing met dezelfde primers gebruikt om het product te versterken. </li><li> Analyseren van DNA-sequencing resultaten met behulp van software die uitlijning van meerdere sequenties met een gekozen referentie sequentie (figuur 4) mogelijk maakt. </li></ol> E. Alkali Behandeling van de RNA-bevattende oligo (figuur 5) <ol><li> Voor elke reactie, voeg 1 nmol (4 pl van 250 pmol / ul voorraad-oplossing) van het RNA-bevattende oligo, of DNA-oligo in een 1.5 ml buis. </li><li> Voeg 4 ul van 1 M NaOH voor hydrolyse, of als alternatief 4 ul H 2 O toe te voegen als negatieve controle, en incubeer bij 65 ° C in een waterbad gedurende 1 uur Verplaats vervolgens uit het waterbad met ijs. </li><li> Neutraliseren met 2 pi van 1,2 M HCl, 4 ul van 1 M Tris-HCl, en 4 pi H 2 O, of als alternatief 6 pi van H 2 O en 4 pl van 1 M Tris-HCl voor de negatieve controle. Te houden op ijs tot transformatie. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van het defecte gen en trp5 van de TRP5 allel gecorrigeerd door de RNA-bevattende oligo. A) De trp5 mutant gen bevat een 2-base wissen (zwarte driehoeken) en 1-base nonsense mutatie (asterisk). De single-streng RNA-bevattende oligo met 2-base inbrengen (blauwe lus) en 1-RNA-base substitutie (rode rechthoek) het genereren van een Van91 ik restrictie-enzym site (aangegeven door de beugel) wordt omgezet in gistcellen naar de genetische defecten te corrigeren van de trp5 gen. B) Na de TRP5 gen wordt gerepareerd door de RNA-bevattende oligo (gecorrigeerd bases worden aangeduid als blauwe rechthoeken), is de Van91 ik website gegenereerd in de TRP5 gen. Een 278 bp fragment met alleen een Van91 ik restrictieplaats in TRP5 gen is PCR versterkt door een paar primers (P1 en P2). De 177 bp en 101 bp fragmenten gegenereerd na vertering van de P1 en P2 PCR-product door Van91 I worden ook getoond. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Transformatie resultaat met de RNA-bevattende oligo. A) Gistcellen getransformeerd met geen oligo hebt geen kolonies vormen op de SC-Trp medium, zie borden ab. B) Platen cg tonen gist kolonies groeien op SC-Trp na cellen getransformeerd met een nmol van het RNA-bevattende oligo. C) Platen hl tonen gist kolonies groeien op SC-Trp na cellen getransformeerd met een nmol van het overeenkomstige DNA-only control oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Detectie van genetische overdracht van informatie van de RNA-bevattende oligo om gist chromosomale DNA door restrictie digestie van het PCR-product het versterken van de beoogde genomische regio. 2% agarose gelelektroforese van PCR-monsters versterkt door P1 en P2 en gedigereerd met Van91 ik restrictie-enzym. Lanen 1, 8 en 15, DNA-ladder met afmetingen van 100, 200, 300, 400 en 500 bp aangegeven op de links, laan 2, PCR-product van trp5 locus geamplificeerd uit het genomisch DNA van de trp5 mutante stam, baan 3, PCR product geamplificeerd uit genomisch DNA afkomstig van een Trp + kolonie doelwit van de DNA-only oligo; rijstrook 4-7, PCR producten geamplificeerd uit genomisch DNA afkomstig van Trp + kolonies doelwit van de RNA-bevattende oligo; laan 9 tot 14, Van91 ik restrictievertering van de PCR-producten van lanen 2 tot 7. De aanwezigheid van de onversneden PCR-product bands in rijstroken 10 tot 14 kan verklaard worden door een gedeeltelijke vertering door Van91 ik bij de TRP5 locus (CCACATTCTGG). Gezien het feit dat de snij-site voor Van91 I (CCANNNN NTGG) kan meerdere sequenties hebben, kan de site gegenereerd in TRP5 niet de meest optimale doelstelling voor het enzym. In feite, na DNA-sequentie van alle bovenstaande PCR-producten die we detecteren geen extra veranderingen dan die gedragen door de oligo's (zie figuur 4). Het 278 bp PCR-band versterkt door P1 en P2 primers en de spijsvertering product bands door Van91 I van 177 bp en 101 bp worden weergegeven door de pijlen aan de rechterkant. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figuur 4Duim" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4Thumb"> Figuur 4. DNA-sequencing resultaten laten zien gen correctie door de RNA-bevattende oligo. A) DNA electropherogram van de genomische regio het doelwit van de RNA-bevattende oligo. De G in de DNA-volgorde (blauwe doos) afkomstig is van de RG op de RNA-bevattende oligo. Ook boxed is het inbrengen van de CG basen. Sequencing resultaten van alle andere PCR-producten zijn ook zo helder als deze, met TL-signalen ver boven de achtergrond. B) sequenties van de TRP5 regio van de Trp + transformants doelwit van de DNA-only oligo (T1) en de RNA-bevattende oligo (T2-T5) wedstrijd in de consensus-sequentie op de top en worden vergeleken met die van de trp5 mutant cellen voor targeting op basis van de oligo's (Genomic DNA, rood gearceerd). De reparatie RNA-bevattende oligo aan de onderkant heeft twee-base DNA inbrengen en een-base (G) RNA substitutie rood gemarkeerd. De regio's verpakt in blauw met gele tint laten zien dat de RNA-bevattende oligo als de DNA-only oligo precies gecorrigeerd de verwijdering mutatie en nonsense mutatie in alle geteste monsters. De stippellijnen markeren de positie van de RNA-bevattende oligo volgorde. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 4 te zien. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Alkali-behandeling voorkomt gen correctie door de RNA-bevattende oligo. De transformatie frequentie van de RNA-bevattende oligo (R) is weergegeven in de rode balk en dat door de DNA-only oligo (D) wordt getoond in de blauwe balken. De fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde voor de drie onafhankelijke transformaties voor elke oligo. De DNA-only oligo displays vergelijkbare modificaties frequentie zonder en met NaOH behandeling. Anders, transformatie frequentie door de RNA-bevattende oligo daalt naar 0 na behandeling met NaOH. Daarom is de voorbereiding met de RNA-bevattende oligo niet besmet is met DNA-only oligo, dus de waargenomen frequentie van transformatie is specifiek voor de RNA-bevattende oligo.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
</ol>

De video productie voor dit artikel werd gesponsord door Thermo Fisher Scientific, die reagentia en instrument in deze publicatie produceert.

Het feit dat RNA kan genetische informatie direct over te dragen aan genomisch DNA in de cellen werd ontdekt benutten van het gebruik van synthetische RNA-bevattende oligo (Dharmacon gesynthetiseerd-oligo&#39;s) 1. Het was het bewijs van het principe dat cellen kunnen RNA-bevattende moleculen of RNA-sequenties alleen te gebruiken als sjablonen voor DNA-synthese. Het gebruik van RNA-bevattende oligo&#39;s leidde niet alleen tot de demonstratie dat genetische informatie kan direct worden overgedragen van RNA naar genomisch DNA zonder de noodzaak van een reverse getranscribeerd DNA-kopie intermediair, maar ook om het bewijs dat RNA kan worden gebruikt als homologe template in de reparatie van een DNA-schade 1,3. De oligo kan worden gemaakt van RNA-only of bevatten slechts een enkele ribonucleotide ingebed in een DNA-sequentie, zoals in het voorbeeld dat we hier gepresenteerde. Het RNA-bevattende oligo heeft een ingebouwde ribonucleotide ontworpen om de nonsense mutatie in het genoom defecte trp5 allel te corrigeren. De overdracht van genetische informatie van de ribonucleotide om de genomische DNA wordt onthuld door een verandering in fenotype (cel groeien op het medium zonder tryptofaan) van de beoogde cellen. De frequentie van gen-correctie verkregen met de RNA-bevattende oligo wordt gemeten en vergeleken met die van een controle DNA-only oligo. Door het uitvoeren van dit gen correctie test in verschillende cel achtergronden, waar we muteren verschillende gist genen, kunnen we ontdekken die specifiek factor / s van invloed zijn gericht op door de RNA-bevattende oligo&#39;s. Zo kunnen we laten zien mechanismen hoe cellen van de stabiliteit van RNA / DNA hybriden te reguleren. Door simpelweg het ontwerpen van verschillende varianten van het RNA-bevattende oligo&#39;s kunnen we bepalen de kans voor een bepaalde RNA-darmkanaal als template dienen in DNA-modificatie en kunnen we de stabiliteit van specifieke RNA-sequenties ingebed in DNA te bepalen. Bovendien kunnen we vaststellen wat de voorkeur in vivo substraten voor factoren die de interactie met RNA / DNA hybriden. Terwijl de verschillende in vitro studies, voornamelijk gebruik te maken van korte RNA-bevattende oligos, zijn uitgevoerd om de functie van factoren die RNA kan in een hybride te herkennen met DNA, zoals het RNase H enzymen 4, de in vivo functies van RNases H en karakteriseren als de identiteit van andere eiwitten die van invloed kunnen zijn RNA / DNA hybride stabiliteit blijven meestal onbekend. De mogelijkheid om gebruik te maken RNA-bevattende oligo&#39;s van een aanzienlijke lengte (50 tot 80-mers) en een optimale kwaliteit (zoals Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo&#39;s) heeft de weg openen voor de behandeling van een breed scala aan moleculaire processen direct in vivo in de cellen van belang. Zoals te zien in deze video, transformatie met behulp van RNA-bevattende oligo&#39;s vereist in wezen slechts een paar extra stappen in vergelijking met de transformatie met behulp van DNA-moleculen, om degradatie te voorkomen door RNases. Zo kan de transformatie met behulp van RNA-bevattende oligo&#39;s is niet beperkt tot de gist systeem, maar worden toegepast op een organisme of cel type waar transformatie door DNA-oligo is bedreven. Tot slot, gericht op cellen door RNA-bevattende oligo&#39;s biedt de mogelijkheid om RNA / DNA hybriden en ribonucleotiden ingebed in DNA in vivo in de cellen te genereren. De stabiliteit, functie en gevolgen van deze in vivo gegenereerde RNA / DNA hybriden kunnen worden geanalyseerd en gekarakteriseerd, potentieel blootleggen van onbekende mechanismen van DNA-herstel en onthullende nieuwe strategieën voor gen-targeting.

A. Transformatie reagentia en media (aangepast uit Storici en Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Gist Peptone dextrose): Voor een L, 10 g gistextract, 20 g soja-pepton, 20 g dextrose. Voeg 15 g agar aan YPD vaste media te maken. Autoclaaf voor gebruik. Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Oplossing 1: 0,1 M van de lithium-acetaat. Bereid deze oplossing onmiddellijk voor de transformatie. Oplossing 1 is een werkende oplossing, dus het is direct bereid uit de poeder. Geen voorraad oplossing is gemaakt. Bewaren bij kamertemperatuur. LiAc verhoogt de gistschillen permeabiliteit voor DNA. </li><li> Oplossing 2: 0,1 M van lithium-acetaat en 50% van polyethyleenglycol 4000. Ook oplossing 2 is een werkende oplossing en het is gemaakt rechtstreeks van het poeder. Geen stamoplossing bereid. Bewaren bij kamertemperatuur. PEG&#39;s oligo&#39;s op gistcellen. </li><li> RNA-bevattende oligo (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, ontzout, ontschermd en niet-gezuiverd. Resuspendeer tot 250 pmol / pl. Bewaren bij -80 ° C. </li><li> DNA-only oligos, 50-80-mers, ontzout en niet-gezuiverd. Resuspendeer tot 50 pmol / pl. Bewaren bij -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic complete media ontbreekt tryptofaan) vaste media. </li><li> 0,5 cm diameter glazen kralen, gesteriliseerd door autoclaveren. </li><li> RNase-off: RNase decontaminatie-oplossing. </li><li> DNase / RNase-vrij, steriele centrifuge buizen. </li><li> DNase / RNase-vrij, steriele conische buizen. </li><li> DNase / RNase-vrij, aërosol steriele pipet tips met ZAP: 100-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. kolonie PCR materialen. <ol><li> DNA-primers, ontzout en niet-gezuiverd. Los op in steriel water tot 50 pmol / pl. Bewaren bij -20 ° C. </li><li> Taq DNA-polymerase, buffer, dNTP. </li><li> PCR-buizen. </li></ol> C. PCR zuivering. <ol><li> PCR zuivering kit. </li></ol> D. gelelektroforese. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x TBE lopen buffer (45 mM Tris-boraat en 1 mM ethyleendiamine tetraacetate), verdund uit 10x TBE. </li><li> Prestained moleculair gewicht marker. </li><li> DNA laden kleurstof. </li></ol> E. Beperking spijsvertering. <ol><li> Restrictie-enzymen, 10x buffers, BSA. </li></ol> F. Alkali behandeling voor de RNA-bevattende oligo. <ol><li> 1 M NaOH-oplossing. </li><li> 1,2 M HCl-oplossing toe. </li><li> 1 M Tris-HCl, pH 7,4 oplossing. </li></ol>

genereren van rna / dna-hybriden in genomic dna door omzetting door middel rna-bevattende oligonucleotiden

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetische korte nucleïnezuur polymeren, oligonucleotiden (oligos), zijn de meest functionele en wijdverbreide instrumenten van de moleculaire biologie. Oligo kunnen geproduceerd worden in elke gewenste DNA-of RNA-sequentie bevatten en kunnen worden bereid om een ​​breed scala aan basis-en suiker wijzigingen omvatten. Bovendien kan oligo worden ontworpen om specifieke nucleïnezuur veranderingen na te bootsen en zo, kan dienen als belangrijke instrumenten om de effecten van DNA-schade en de mechanismen van de reparatie te onderzoeken. We vonden dat de Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo&#39;s met een lengte tussen de 50 en 80 nucleotiden kunnen bijzonder geschikt zijn om te studeren, in vivo, functies en gevolgen van chromosomale RNA / DNA hybriden en van ribonucleotiden ingebed in DNA. RNA / DNA hybriden kan gemakkelijk vorm tijdens de DNA-replicatie, reparatie en transcriptie, echter zeer weinig bekend over de stabiliteit van het RNA / DNA hybriden in cellen en in welke mate deze hybriden kan de genetische integriteit van de cellen beïnvloeden. RNA-bevattende oligos, daarom vormen een perfecte vector om ribonucleotiden te introduceren in chromosomaal DNA en het genereren van RNA / DNA hybriden van de gekozen lengte en de basis samenstelling. Hier presenteren wij het ​​protocol voor de integratie van ribonucleotiden in het genoom van de eukaryote modelsysteem gist / Saccharomyces cerevisiae /. Toch heeft ons lab gebruikt Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo&#39;s aan RNA / DNA hybriden te genereren op het chromosomaal niveau in verschillende celsystemen, van bacteriën tot menselijke cellen.

Dit werk laat zien hoe een RNA / DNA hybride vorm op de chromosomale niveau en onthullen de overdracht van genetische informatie van RNA naar DNA genoom in gistcellen.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Synthetische korte nucleïnezure polymeren, oligonucleotiden (oligo's), zijn de meest functionele en wijdverspreide instrumenten van de moleculaire biologie. Oligo's kunnen ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om RNA-DNA-hybriden op chromosomaal niveau te genereren in levende gistcellen door de gistcellen te transformeren met RNA-bevattende oligos. Dit wordt bereikt door een enkelstrengs RNA-bevattende oligo te introduceren in delende gistcellen. De oligo zal vervolgens annealen met de complementaire regio van een gemuteerd markergen op een gistchromosoom om een RNA-DNA-hybride te vormen. Als tweede stap worden de cellen die zijn getransformeerd door de RNA-bevattende oligo uitgeplaat op selectieve media.Dit maakt de groei mogelijk van cellen waarin het RNA-gedeelte van de oligo dient als sjabloon voor de correctie van het gemuteerde markergen. Vervolgens worden de gistkolonies die groeien op de selectieve media geteld om de frequentie van gen-correctie door de RNA-bevattende oligo vast te stellen; de resultaten tonen de overdracht van genetische informatie aan van het RNA-traject van de oligo naar het gemuteerde markergen in het gistgenoom. Dit is evident uit restrictiedigestie-analyse, sequentieanalyse en de alkalische labiliteitsassay.Hallo, ik ben de oprichter van HIN, het laboratorium van Dr. Francesca aan de school voor biologie van het Georgia Institute of Technology. Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van RNA-DNA-hybriden op chromosomaal niveau in levende gistcellen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe de aanwezigheid van RNA ingebed in genomisch DNA door cellen wordt getolereerd en om vast te stellen welke factoren de stabiliteit van RNA-DNA-hybriden in vivo beïnvloeden.Laten we beginnen. Veeg vóór de start van deze procedure alle materialen die voor het experiment worden gebruikt, waaronder oligo-buisjes, pipetten, vortex-rekken, het experimentele oppervlak en de handschoenen van de onderzoeker, af met een RNA-decontaminatieoplossing. Gebruik gedurende de gehele procedure RNA-vrij water, chemische reagentia, buisjes en pipetpunten om eventuele RNA-contaminatie te voorkomen.Verkrijg een RNA-bevattende oligo om genetische informatie over te dragen naar het genomische DNA van gistcellen. De hier gebruikte giststam bevat een mutant trip vijf-gen met een deletie van twee basen en één nonsense-mutatie. Een dergelijke giststam is een tryptofaan-atrofische mutant en vormt geen kolonies op media zonder tryptofaan.Het RNA-bevattende oligo is een 65-mer met een DNA-insertie van twee basen, ontworpen om de deletiemutatie te corrigeren. Daarnaast bevat het oligo één ribonucleotide om de nonsense-mutatie van het trip-5-allel te corrigeren. Zodra deze is verkregen, dient het RNA-bevattende oligo te worden klaargemaakt als een stockoplossing van 250 µM, zoals beschreven in het geschreven protocol. Inoculeer 16 uur vóór de transformatie met het RNA-bevattende oligo.Voeg vijf milliliter rijk gistpeptide-dextrose of YPD vloeibaar medium toe aan de trip five mutante gistcellen en kweek de cellen gedurende de nacht bij 30 °C. Draag na de incubatie overnacht 1,5 milliliter van de overnachtcultuur over naar 50 milliliter YPD vloeibaar medium. Incubeer de cellen in een schudmachine bij 30 °C bij 225 omwentelingen per minuut gedurende vier uur vlak voor het ontdooien van de transformatie.Plaats de RNA-bevattende oligos en de bijbehorende DNA-only oligos op ijs. De bijbehorende DNA-only oligos worden gebruikt als positieve controle. Verdun de oligos tot 50 µM met RNA-vrij water in RNA-vrije buisjes.Bereid 70 µL van elke oligo voor om voldoende monster te hebben voor drie transformaties van één mol met een kleine overmaat. Denatureer de RNA-bevattende en DNA-alleen oligos op het warmteblok van 100 °C gedurende twee minuten om secundaire structuren van de oligos onmiddellijk na denaturatie te elimineren. Plaats de buisjes op ijs en houd ze daar tot de transformatie. Bereid oplossing één en oplossing twee onmiddellijk voor de transformatie in RNA-vrije buisjes. Draag de celcultuur over naar een 50 mL RNA-vrij buisje en centrifugeer bij 3000 rpm, wat overeenkomt met 1.562 ×g, gedurende twee minuten.Verwijder het supernatant en was de cellen met 50 milliliters RNAse-vrij water. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 3000 rotations per minute gedurende twee minuten. Herhaal dit proces vijf keer om het kweekmedium en eventueel aanwezige RNAse na de laatste centrifugering te verwijderen.Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vijf milliliters oplossing. Eén. Centrifugeer het monster op 3000 rotaties per minuut gedurende twee minuten, gooi het supernatant weg en voeg 250 microliters van oplossing één toe aan de cellen. Deze hoeveelheid cellen is voldoende voor zeven tot acht transformaties. Verdeel aliquots van 50 µL van de celsuspensie over zeven RNA-vrije microcentrifugebuisjes. Voeg vervolgens 20 µL van de 50 µM RNA-bevattende oligo toe aan drie buisjes, 20 µL van de 50 µM DNA-only oligo aan drie buisjes en 20 µL steriel water zonder oligo aan één buisje als negatieve controle.Voeg vervolgens voor elk van de zeven transformatiereacties 300 µL van oplossing twee toe. Vortex de monsters krachtig om de componenten te mengen. Incubeer de transformatiereacties na incubatie 30 minuten bij 30 °C in een schudmachine.Zet de monsters bloot aan een hitte-shock bij 42 °C gedurende 15 minuten. Centrifugeer de cellen vervolgens 4 minuten lang bij 5.000 toerentallen per minuut, wat overeenkomt met 2.236 ×g. Verwijder het SUP-agens en resuspendeer de cellen in 100 µL steriel water voor elk van de drie buizen.Neem een aliquot van deze celsuspensie en verdun elke aliquot met steriel water in een verhouding van 100.000 keer. Voeg ongeveer 15 steriele glaskralen per plaat toe en breng 100 µL van de 100.000 keer verdunde cellen aan op drie YPD-platen. Breng 100 µL van de resuspendeerde cellen van elke transformatiereactie aan op één petrischaal met synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan en schud de platen gelijkmatig.Verwijder vervolgens de beads. Incubeer de cellen op YPD-platen bij 30 °C gedurende twee dagen en incubeer de cellen die zijn geplaatst op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan bij 30 °C gedurende vier tot vijf dagen. Tel en vergelijk het aantal gegroeide kolonies op het selectieve medium en op het YPD-medium om de gen-correctiefrequentie te berekenen voor de oligo met RNA, de oligo met alleen DNA en voor de controle zonder oligo.Er wordt geen kolonievorming verwacht op het selectieve medium wanneer er geen oligos aan de cellen zijn toegevoegd; strijk verschillende willekeurig gekozen getransformeerde kolonies uit op YPD-medium om enkelkolonie-isolaten te verkrijgen. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 30 °C voor de groei van de kolonies. Kies na incubatie verschillende enkelkolonies en maak patches op YPD en op het selectieve medium.Na een incubatie van één dag wordt groei waargenomen voor de cellen die getransformeerd zijn met de oligos op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan, maar niet voor de controlestam zonder oligo op het selectieve synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan. Ontwerp vervolgens een paar primers om de regio die getarget wordt door de RNA-bevattende oligo te amplificeren met behulp van kolonie-PCR om met de kolonie-PCR te beginnen. Resuspendeer de cellen die van de individuele patches zijn genomen in 50 µL water met één unit lyase en incubeer de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie in een heatblock bij 100 °C gedurende vijf minuten om de cellen te lyseren en genomisch DNA in de oplossing vrij te maken.Bereid de PCR-reacties voor in PCR-buisjes door 10 µL van de celsuspensie aan elk voorbereid buisje toe te voegen en voer de amplificatiereactie uit zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Analyseer de resulterende monsters op een 1% agarosegel om het PCR-product waar te nemen. Aangezien de genetische informatie die in dit experiment door het RNA-bevattende oligo wordt overgedragen een nieuwe VAN 91 1 restrictieplaats genereert in de genomische targetregio van de gist, is het mogelijk om de correcte overdracht van informatie te verifiëren door het PCR-product te couperen met het restrictie-enzym van 91 1.Stel de digestiereactie samen met zes µL PCR-product, buffer, 0,5 µL BSA, het restrictie-enzym en steriel water tot een totaalvolume van 15 µL. Incubeer de monsters gedurende één uur bij 37 °C. Voer een niet-gedigesteerd monster samen met de gedigesteerde monsters uit op dezelfde rij van een 2% agarosegel om de genetische modificatie te observeren die is overgedragen door het RNA-traject van de RNA-bevattende oligo.Zuiver de PCR-producten met een PCR-zuiveringskit en bereid ze voor op DNA-sequencing. Dien de monsters in voor sequencing met dezelfde primers die zijn gebruikt om het product te amplificeren. Analyseer tot slot de DNA-sequencingresultaten met software die de alignment van meerdere sequenties met een gekozen referentievolgorde mogelijk maakt, om een alkalische behandeling van het RNA-bevattende oligo voor elke reactie uit te voeren met één mol van het RNA-bevattende oligo of het DNA-only oligo in een 1,5 milliliter buisje.Voeg vervolgens 4 µL 1 M natriumhydroxide toe voor hydrolyse of 4 µL water voor de negatieve controle. Incubeer de monsters na incubatie gedurende één uur in een waterbad bij 65 °C. Plaats de reactie op ijs.Neutraliseer de hydrolysereactie met twee µL 1,2 M zoutzuur, vier µL 1 M tris-hydrochloride en vier µL water voor de negatieve controle. Voeg zes µL water en vier µL 1 M tris-hydrochloride toe. Bewaar de monsters op ijs totdat de transformatie kan worden uitgevoerd.Zoals zojuist beschreven, vormen gistcellen die niet met een oligo zijn getransformeerd geen kolonies op het synthetische complete vaste medium zonder tryptofaan. Omgekeerd vertonen cellen die zijn gegroeid op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan, nadat de cellen zijn getransformeerd met één oligo van het RNA-bevattende oligo, nu wel kolonies.Gistkolonies groeien ook op synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan nadat cellen zijn getransformeerd met slechts één nanomol van de overeenkomstige DNA-alleen controle-oligo; de detectie van genetische informatieoverdracht van de RNA-bevattende oligo naar het chromosomale DNA van de gist is evident door VAN 91 1 restrictiedigestie van het PCR-product dat de doellocatie in het genoom amplificeert; zoals getoond kan het PCR-product van de trip. Five locus, geamplificeerd uit het genomische DNA van de trip. Five mutantstam, worden gezien.Ook wordt het PCR-product getoond dat is geamplificeerd uit genomisch DNA afgeleid van een trip plus-kolonie die is gericht op de DNA-only oligo. De PCR-producten die zijn geamplificeerd uit genomisch DNA afgeleid van trip plus-kolonies gericht op de RNA-bevattende oligo zijn eveneens op de gel geladen. De resultaten van de van 91 1 restrictiedigestie van dezelfde PCR-producten onthullen een geamplificeerde PCR-band van 278 baseparen en de digestieproduct-banden door van 91 1 van 177 baseparen en 101 baseparen.DNA-sequencing onthult de gen correctie door het RNA-bevattende oligo hier. Een DNA-electropherogram van de genomische regio die door het RNA-bevattende oligo wordt getarget, wordt getoond. De g in de DNA-sequentie is afkomstig van de RG op het RNA-bevattende oligo go.Ook omkaderd is de insertie van de CG-basissequenties van de trip vijf-regio van de trip plus-transformanten die gericht zijn door de DNA-only oligo en de RNA-bevattende oligo; deze komen overeen met de consensussequentie en worden vergeleken met die van de trip vijf-mutante cellen vóór targeting door de oligo's. De herstel-RNA-bevattende oligo onderaan heeft een insertie van twee basen DNA en een substitutie van één base RNA.De blauw omkaderde regio's met gele schaduw tonen aan dat zowel de RNA-bevattende oligo als de uitsluitend DNA-bevattende oligo de deletiemutatie en de nonsense-mutatie in alle geteste monsters nauwkeurig hebben gecorrigeerd; de streeplijnen markeren de positie van de RNA-bevattende oligosequentie. Alkalische behandeling voorkomt gen correctie door de RNA-bevattende oligo; de transformatiefrequentie door de RNA-bevattende oligo en de uitsluitend DNA-bevattende oligo wordt weergegeven. De foutenbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde voor drie onafhankelijke transformaties per oligo.De DNA-only oligo vertoont een vergelijkbare transformatiefrequentie met en zonder behandeling met natriumhydroxide. Omgekeerd daalt de transformatiefrequentie van de RNA-bevattende oligo naar nul na behandeling met natriumhydroxide. Daarom is de preparatie met de RNA-bevattende oligo niet gecontamineerd met DNA-only oligo.De waargenomen transformatiefrequentie is dus specifiek voor het RNA-bevattende oligonucleotide. We hebben zojuist aangetoond hoe een RNA-DNA-hybride op chromosomaal niveau kan worden gevormd en hoe de overdracht van genetische informatie van RNA naar genomisch DNA in gistcellen verloopt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de RNA-bevattende oligonucleotiden van uitstekende kwaliteit zijn en dat er onder RNA-vrije omstandigheden wordt gewerkt.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.

Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

In dit artikel presenteren en bespreken we nieuwe ontwikkelingen in de synthese en toepassingen van nucleïnezuur micro arrays die in situ zijn gefabriceerd. Concreet laten we zien hoe de protocollen voor DNA-synthese kunnen worden uitgebreid naar RNA en hoe micro arrays kunnen worden gebruikt om opvraagbaar nucleïnezuur bibliotheken te creëren.

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

We beschrijven de engineering van een nieuw DNA-gebonden T7-RNA-polymerase om in vitro transcriptiereacties te reguleren. We bespreken de stappen voor eiwitsynthese en karakterisering, valideren proof-of-concept transcriptionele regulatie en bespreken de toepassingen ervan in moleculaire computing, diagnostiek en moleculaire informatieverwerking.

DNA-gebonden RNA-polymerase voor programmeerbare in vitro transcriptie en moleculaire berekening

Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.

Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Leer hoe je RNA/DNA-hybriden genereert in levende gistcellen met behulp van RNA-bevattende oligonucleotiden. Deze methode maakt genecorrectie mogelijk en biedt inzicht in genetische informatieoverdracht.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Meer video's verkennen