Name: Intracraniële orthotope Allografting van Medulloblastoom cellen in Immunogecompromitteerde Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Leer intracraniële orthotope allografting van medulloblastoomcellen in immunogecompromitteerde muizen. Deze methode modelleert secundaire tumorvorming en helpt bij het bestuderen van tumorgedrag in vivo voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), de Childhood Brain Tumor Foundation en het National Institutes of Health (NS042205).

1. Micro-dissectie van tumor-dragende kleine hersenen en dissociatie van tumorweefsel <ol><li> Ophalen van tumorweefsel <ol><li> Zieke muizen met medulloblastoom zijn vaak runted, en weer te geven hydrocefalie en typische neurologische symptomen, waaronder posterior verlamming en gebrek aan houding terug te krijgen wanneer deze is gekanteld. Te halen tumorweefsel, euthanaseren muizen door kooldioxide inademing. Het is imporant niet uit te voeren cervicale dislocatie, een procedure die druk genereert op de achterste schedel en in gevaar kunnen brengen tumorweefsel integriteit. </li><li> Onthoofding wordt onmiddellijk uitgevoerd na de dood met behulp van een schaar, het verwijderen van haar-en spierweefsel zo veel mogelijk voor een goede visualisatie van de schedel. Reinig het oppervlak van de schedel met Kimwipe doordrenkt met 95% ethanol. </li><li> Gebruik fijne schaar om een ​​opening snijden langs de middellijn van de schedel, en de schedel weefsel met behulp van fijne pincet, op welk punt de gehele hersenen inclusief tumor-dragende cerebellum wordt blootgesteld te verwijderen. </li><li> Terwijl de cerebella van gezonde volwassenen weer goed gedefinieerde halfrond en vermis, het cerebella van tumor-dragende muizen zijn vaak vergroot, amorfe met een glad oppervlak en opvallende bloedvaten. Met behulp van steriele technieken, halen de cerebellaire tumor met een pincet en plaats in de ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Mg 2 + en Ca 2 +. </li></ol></li></ol> Opmerking: alle instrumenten worden gedesinfecteerd in 95% ethanol en stoom autoclaaf voor gebruik. <ol start="2"><li> Dissociatie van tumorweefsel <ol><li> Breng de tumor weefsel van PBS tot 50% Accutase (verdund in PBS), dat is ongeveer 4 maal het volume van de tumor weefsel, gehakt het weefsel met fijne schaar gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 4 minuten , waarna het weefsel ondergaat repetitieve pipetteren met een 1-mL Pipetman voor een extra 3 minuten. Deze methode moet opleveren een mengsel van afzonderlijke cellen en kleine cellulaire aggregaten. </li><li> Verwatering van de cellulaire suspensie 3-voudige met PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000xg om pellet de cellen. (De procedures hiervoor zijn beschreven in &quot;Isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom stamcellen&quot;, Jove in press) </li></ol></li></ol> Resuspendeer de cel pellet in vers bereid neurale stamcellen medium dat bestaat uit Neurobasal medium met glutamine, penicilline-streptomycine, N2, B27, menselijke EGF (25 ng / ml) en basic FGF (25 ng / ml). Bereken de cel dichtheid van de oplossing en de nodige verdere verdunningen met extra neurale stamcellen medium, dat men 4 pi van de oplossing te laden met een passend aantal gescheiden tumorcellen, bijvoorbeeld 5x10 5, in een steriele schuine-tip 10μL spuit. Het exacte aantal cellen moet worden ingeënt moet worden bepaald door de onderzoeker op basis van specifieke experimentele eisen. Houd de cel oplossing in een mini-200μL microcentrifugebuis (PCR tube) op ijs. 2. Verdoving Procedures voor de Ontvanger Muizen Voor de chirurgische ingreep, is een gedesinfecteerd ruimte gewijd aan de knaagdieren een operatie die nodig is voor de duur van de procedure. Idealiter, het opzetten van een lange bank met een aparte, maar aangrenzende gebieden voor dier-voorbereiding, operationele veld en dier herstel. Chirurgische handschoenen, geen examen handschoenen, zijn nodig voor de operatie. Aseptische techniek wordt onderhouden door holding gehandschoende handen boven de taille en alleen gebruikt om steriele objecten uit een droog steriel oppervlak te behandelen. <ol><li> Een mengsel van ketamine (100 mg ketamine per 1 kg van muis gewicht) en xylazine (10 mg xylazine per 1 kg gewicht van de muis) wordt gebruikt voor anesthesie. Dien de verdovingsmiddelen intraperitoneaal. </li><li> Het duurt over het algemeen 3-5 minuten voor de verdoving te nemen volledige effect. Bepaal of een muis is volledig verdoofd door toe / staart knijpen. Plaats een kleine hoeveelheid oogzalf op de ogen van de muis. Breng het geheel verdoofde muis om de operationele omgeving, voortdurend in de gaten om ervoor te zorgen dat de muis normaal ademt. </li></ol> 3. Intracraniale enten van de tumorcellen <ol><li> Scheer de dorsale achterste hoofd gebied van de muis, met behulp van een haartrimmer, om de achterste schedel zichtbaar boven de middenhersenen en het cerebellum. </li><li> Betadine oplossing toe te passen op de blootgestelde hoofdhuid met behulp van een wattenstaafje applicator, gevolgd door af te vegen met een alcoholdoekje. Herhaal deze twee stappen twee keer steriliseren. </li><li> Maak kwart-inch incisie in het achterste hoofdhuid met behulp van een scalpel gesteriliseerd. Boor een 0,5 mm braam gat 2 mm naar rechts en 2 mm achter de lambda met behulp van een steriele tandartsboor. </li><li> Plaats de muis op een stereotactisch kader door het inhaken van de snijtanden op het frame vast te houden. Voorzichtig afdalen en de positie van de schuine-tipped 10 pi spuit geladen met 4 pl van tumorcellen oplossing in de braam gat. Zodra de afschuining van de syriNSE naald wordt onder de schedel oppervlak, afdaling voor een ander 3 mm en daarna stijgen naar 0,5 mm. Injecteer langzaam de gewenste hoeveelheid van tumorcellen, met een gestage kracht in een 30 seconden tijd, in de kleine hersenen van de ontvanger. Laat de naald op zijn plaats na afronding van de injectie voor een extra twee minuten. Verwijder vervolgens de naald en spuit. Clip de wond met behulp van een autoclip. </li><li> Houd de muis op een warming deken na de operatie te helpen zijn lichaamstemperatuur te behouden. Mobiliteit en luchtwegen patronen zal voortdurend worden nageleefd. Zodra de muis zich herstelt van de narcose, plaats deze terug in een steriele behuizing kooi. Monitor dagelijks voor voedsel-en wateropname, gedrag, verzorging, en de rode kleuring van de ogen. Controleer op tekenen van infectie op de incisie site. Verwijder de autoclips op dag 7 na de operatie. Houden de muizen voor een gemiddelde van 2-6 maanden en offers die het weergeven van typische symptomen medulloblastoom voor verdere studies. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Secundaire medulloblastomen ontwikkeld in de ontvangende muizen zeer leken op die van de primaire tumoren. De cerebella lager secundaire tumoren waren vaak vergroot, amorfe met ectopische bloedvaten zichtbaar wanneer bekeken als een geheel-mounts. Immunohistochemische analyses van de secundaire tumor weefsel is gebleken dat de tumorcellen zijn zeer proliferatieve, maken zich grote SmoM2-YFP en markers van cerebellaire korrel neuron voorlopers, zoals Math1 en PAX6. Wanneer gedissocieerd en gekweekt met behulp van gemelde methodes (&quot;Isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom stamcellen&quot;, Jove in press), de secundaire medulloblastoom tumorcellen snel kan worden uitgebreid, express meerdere stamcellen bevat, worden Monogene en kan verder initiëren de vorming van tumoren bij getransplanteerd in extra immuungecompromitteerde ontvangers. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Typische whole-mount en doorsneden van een secundaire medulloblastoom tissue Een typisch voorbeeld van secundaire medulloblastoom weefsel ontwikkeld 26 dagen na de injectie van 5x10 5 primaire tumor cellen. Hematoxyline vlekken onthult de typische cellulaire morfologie van medulloblastoom, met inbegrip van hoge nucleaire / cytoplasmatische verhouding en nucleaire polymorfisme. Deze secundaire tumorcellen zijn zeer proliferatieve zoals aangegeven door Ki67 expressie en ze ook fors drukken membraneuze SmoM2-YFP. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Secundaire medulloblastoom cellen kunnen worden gekweekt en uitgebreid in vitro Met behulp van het protocol beschreven voor primaire muis medulloblastoom cellen (&quot;Isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom stamcellen&quot;, Jove in press), kunnen deze secundaire medulloblastoom cellen worden gekweekt en uitgebreid voor meerdere passages. De foto toont dezelfde vertegenwoordiger tumor kolonie gekweekt op 4 dagen en 14 dagen. De gekweekte tumorcellen zijn bipolair, langwerpig met weinig cytoplasma en vaak stralen uit een dichte kern van cellulaire aggregaat. Ze vertonen geen groei contact remming. De kleine ronde cellen zijn rode bloedcellen.

<ol><li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li>
<li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li>
<li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li>
<li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een aantal kritische factoren voor een succesvolle medulloblastoom cel allografting dat de rendementen secundaire tumoren ontstaan ​​zijn als volgt te waarborgen: Gebruik eerst slechts 50% Accutase voor weefsel dissociatie en niet over-verteren het weefsel als langdurige enzym behandeling leidt tot een significante vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. Ook gebruik alleen de 1 mL grootte Pipetman als kleinere tips kan genereren ook fysieke schade aan de gedissocieerde cellen. Het is fijn om een ​​mengsel v...

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50% </td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2mM</td></tr><tr><td>Stereotaxisch instrument</td><td>Stoelting Co.</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Foredom flexibele assenboor, ophangmodel</td><td>Stoelting Co.</td><td>58650</td><td></td></tr><tr><td>Grote probehouder</td><td>Stoelting Co.</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L spuit, 26 ga., schuine tip</td><td>Stoelting Co.</td><td>51105</td><td></td></tr><tr><td>Boorbit .75mm</td><td>Stoelting Co.</td><td>51455-3</td><td></td></tr></tbody></table>

intracraniële orthotope allografting van medulloblastoom cellen in immunogecompromitteerde muizen

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Medulloblastoom is de meest voorkomende pediatrische tumor van het zenuwstelsel. Een groot deel van onderzoek bij dieren is gericht op het cerebellum granule neuron precursors (CGNPs) als de cel-van-oorsprong voor medulloblastoom 1-4. Echter, de diverse klinische presentaties van medulloblastoom subtypes in menselijke patiënten (nodulair, desmoplastic, klassieke en grote cel / anaplastisch), en het feit dat medulloblastoom is gevonden in een subgroep van de menselijke patiënten zonder ectopische expressie van CGNP marker 5, suggereren dat de cellulaire en moleculaire oorsprong van het medulloblastoom zijn meer complex en lang niet volledig ontcijferd. Daarom is het essentieel om te bepalen of er een alternatief is medulloblastoom tumorcel-van-oorsprong op basis van welke cel-type specifieke therapeutische modaliteit kunnen worden ontwikkeld. Te dien einde zal intracraniële orthotopische allografting van genetisch gemarkeerde tumorcellen soorten, gevolgd door latere analyses van secundaire ontwikkeling van tumoren in de ontvangers laten bepalen van de cellulaire oorsprong van tumor-initiëren cellen. Hier beschrijven we de experimentele protocol voor intracraniële orthotope allografting van medulloblastoom cellen afkomstig van de primaire tumor weefsel, en deze procedure kan ook worden gebruikt voor het transplanteren van cellen van gevestigde cellijnen.

Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van de muis medulloblastoom weefsel, en de daaropvolgende allografting van de tumorcellen in immuungecompromitteerde ontvangende muizen in om secundaire medulloblastoom te starten.

Intracraniële orthotope Allografting van Medulloblastoom cellen in Immunogecompromitteerde Muizen

Medulloblastoom is de meest voorkomende pediatrische tumor van het zenuwstelsel. Een groot aantal dierstudies heeft zich gericht op cerebellaire korrelneuronen ...

Het algemene doel van deze procedure is om medulloblastoom tumorcellen van een allograft topisch in een immuungecompromitteerde gastheer te plaatsen om een secundaire tumor te initiëren. Dit wordt bereikt door primair medulloblastoomweefsel eerst te dissociëren in enkelvoudige cellen en kleine cellulaire aggregaten. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van immuungecompromitteerde muizen voor intracraniële injectie.De derde stap van de procedure is het uitvoeren van de microinjectie van tumorcellen in het cerebellum van de gastheer. De laatste stappen van de procedure bestaan uit het onderhouden en observeren van de gastheren waarin de tumorcellen zijn getransplanteerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die secundaire medulloblastoomvorming in de gastheren aantonen aan de hand van de vertoonde neurologische symptomen en histologische analyse.Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de kankersbiologie, zoals het bepalen van de cellulaire oorsprong van een tumor en factoren die belangrijk zijn voor het initiëren en propageren van tumoren. Microdissecteer en dissocieer tumorweefsel van m sparing medulloblastoom zoals beschreven in het b

intracranial-orthotopic-allografting-medulloblastoma-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Het doel van dit artikel is het beschrijven van het gebruik van een orthotope glioblastoma model voor chemoradiatie studies. Dit artikel gaat echter cel verwerking, het implanteren, en radiotherapie van de muis met behulp van een intracraniële model.

Combinatie Radiotherapie in een orthotope Mouse hersentumor Model

This video demonstrates implantation of tumor cells in the mouse brain by performing intracranial injection.

Intracranial Orthotopic Model: A Procedure to Implant Cancer Cells in Mouse Brain

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.

Intranasale Levering van Therapeutische Stamcellen aan Glioblastoma in een Muis Model

Tumor-zoekende therapeutische mesenchymale stamcellen (MSCs) tonen belofte als een behandeling voor invasieve glioblastoma. Optimale transplantatie gaat om levering van MSCs in de holte van de resectie tumor op steigers. Hier, preklinische technieken om te studeren MSC behandeling van glioblastoma zijn geleverd inclusief: afbeelding-geleide tumor resectie; implantatie van MSC-geplaatste steigers; en postoperatieve therapie volgen.

Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer intracraniële orthotope allografting van medulloblastoomcellen in immunogecompromitteerde muizen. Deze methode modelleert secundaire tumorvorming en helpt bij het bestuderen van tumorgedrag in vivo voor kankeronderzoek.

Intracraniële orthotope Allografting van Medulloblastoom cellen in Immunogecompromitteerde Muizen

Meer video's verkennen