Name: Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer efficiënte genexcisie met adenovirus-gemedieerde Cre-recombinase in primaire muizenembryonale fibroblasten. Deze methode onderzoekt de rol van Rac1 in actinedynamica met bijna 100% transductie-efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Rizaldy Scott bedanken Mount Sinai Hospital in Toronto, Ontario voor zijn gave van de primaire Rac1 Flox / Flox muis embryonale fibroblasten. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies ten behoeve van New Jersey van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2.009 tot 93.526 duizend) en de Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RG 327.372-06). SH en MW worden ondersteund door CGSMA en CGS-M onderscheidingen van CIHR en NSERC, respectievelijk. Steve Hawley en Melanie Wills droegen ook aan deze krant.

Ontdooien cellen <ol><li> Verkrijgen bevroren muis embryonale fibroblasten (MEF) (voorheen gegenereerd uit individuele embryo primaire culturen) van vloeibare stikstof. </li><li> Dooi cellen door onderdompeling flacon in 37 ° C water met wervelende totdat de inhoud volledig ontdooid. </li><li> Voeg 9ml van DMEM dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine met een 10cm celcultuur plaat. </li><li> Voeg de ontdooide celsuspensie druppelsgewijs op de plaat, schud de plaat naar de cellen en laat de plaat te verspreiden in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator 's nachts. Merk op dat als de cellen gevoelig zijn voor DMSO (uit de bevriezing proces), de eerste media kunnen worden vervangen door vers medium nadat cellen hebben gehandeld op grond van de plaat (ongeveer vier uur na de plating). Ook dat samenvloeiing van de cellen opmerking na ontdooien hangt af van het aantal van bevroren cellen, de opbrengst van de cellen na het bevriezen, en de groei van de cellen. </li></ol> Passage cellen <ol start="5"><li> Wanneer cellen zijn gegroeid in wezen 100% confluentie (dat wil zeggen: de volgende dag), zuigen uit de media en was cellen met 5 ml steriele PBS. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine bevat 10 mM EDTA en laat de plaat in de incubator voor ongeveer 5 minuten om cellen te los van de plaat. </li><li> Wanneer de cellen hebben losgemaakt, voeg 9ml van media om de getrypsiniseerd cellen, pipet 2-3 keer om groepjes uiteen te drijven, 1 ml van deze suspensie voeg druppelsgewijze op een nieuwe plaat met 9ml van de media, en deze plaats in het 37 ° C incubator 's nachts . De aanwezigheid van FBS in de media zal de trypsine alternatief te inactiveren, kunnen cellen eerst gewassen te verdunnen het trypsine. </li></ol> Tellen en beplating cellen op dekglaasjes <ol start="8"><li> Verwijder de cellen van incubator, wassen en trypsinize als voorheen, behalve dat dit keer weer toevoegen 5-6 ml media om de getrypsiniseerd cellen in plaats van 9ml. </li><li> Pipet cellen grondig in te vullen dissociatie zorgen in een enkele celsuspensie en verwijder 15μL met 15μL van trypan blauw te combineren in een aparte microfugebuis. </li><li> Mix deze cel / trypan blauw schorsing door en neer te pipetteren meerdere malen, en voeg 15μL aan de hemocytometer. </li><li> Onder de microscoop, wordt dode cellen verschijnen blauw. Tel het aantal duidelijke / kleurloze (levende) cellen in een van de 4X4 roosters op de hemocytometer. Herhaal deze rekenen op de drie andere 4x4 grids (aangeduid A, B, C en D) en gebruik de volgende vergelijking om het aantal cellen per microliter van de ophanging te berekenen: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Vergelijking 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 1"></li><li> Door middel van protocol optimalisatie, hebben wij vastgesteld dat plating 30.000 cellen resultaten in geschikte celdichtheid voor visualisatie aan het einde van het experiment. </li><li> Voor het berekenen van het volume van de celsuspensie die nodig is voor 30.000 cellen, gebruikt u de volgende vergelijking: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Vergelijking 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 2"></li><li> Plaats nu een steriele glazen deksel glijden in elk putje van een zes goed gerecht en voeg 2 ml van de media aan elk putje, en dan voeg druppelsgewijze uit uw celsuspensie het volume nodig voor 30.000 cellen in elk putje. Merk op dat glas dekglaasjes worden gebruikt voor dit experiment omdat we zullen het visualiseren van de cellen met behulp van fluorescentie microscopie op een later tijdstip, niet alle toepassingen zullen noodzakelijkerwijs microscopie, en dus dekglaasjes mag niet worden verlangd. </li></ol> Virus Transductie <ol start="15"><li> Na een aantal uren of een nacht (voldoende tijd om ervoor te zorgen dat de cellen zich houden aan de dekglaasjes), verwijder de media en wassen cellen met 1 ml van het serum-vrij DMEM. </li><li> Voeg 1 ml serum-vrije media aan elk goed voor de toevoeging van het virus. Voor dit experiment werd adeno-Cre virus in de handel verkrijgbaar bij Vector Biolabs. </li><li> Vorige protocol optimalisatie heeft aangetoond dat een multipliciteit van infectie (MOI) van 500 zeer efficiënte transductie-gen geeft in primaire MEFs met weinig of geen effect op de levensvatbaarheid van de cellen. MOI kan als volgt worden berekend: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Vergelijking 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Vergelijking 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 4"></li><li> Direct toe te voegen het berekende volume van het virus aan elk goed, dat is besmet zijn, schud de plaat aan het virus en de plaats cellen 's nachts verspreidt zich in de 37 ° C incubator. </li><li> De volgende ochtend, verwijder de virus-bevattende media uit de cellen en de cellen in 1 ml steriele PBS gewassen en voeg 2 ml van de reguliere media aan elk putje. </li><li> In het geval van de Rac1 cellen toegelicht in dit experiment, morfologische veranderingen opgetreden in de cellen op ongeveer 72 uur na transductie. </li></ol> Representatieve resultaten Cellen werden visualiserend door kleuring met de kleurstof actine phalloidin (voor imaging doeleinden) en beeld gebracht met behulp van de Leica TCS-SP5 multifoton confocale laser scanning microscoop op de Advanced Analysis Centre van de Universiteit van Guelph. Figuur 1 toont de gecontracteerde en langwerpige morfologie van de Rac1 Flox / Flox cellen die waren adeno-Cre virus worden blootgesteld in vergelijking met dezelfde cellen niet worden blootgesteld aan het virus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vergelijking tussen Rac1 Flox / Flox cellen die geïnfecteerd zijn met adeno-Cre virus (links) vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen uit dezelfde bron (rechts).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care set.

De bijhorende video is een voorbeeld van hoe een recombinant virus kan worden gebruikt om accijnzen een specifiek gen in vitro gebruik van Cre recombinase. De ontwikkeling van dit protocol echter wel onthullen een aantal specifieke punten waard adressering. <ul><li> De juiste veiligheidsprocedures moeten altijd worden gebruikt bij het werken met adenovirussen. Een laboratoriumjas en handschoenen moeten worden gedragen op elk moment tijdens het werken met het virus. Media en kunststofmateriaal moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voor ten minste 30 minuten, en kunststofmateriaal moet daarna worden geautoclaveerd. </li><li> Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van het virus aandelen als deze kunnen dus virus titer beïnvloeden en te verminderen transductie efficiëntie. Kleine hoeveelheden van het virus voorraad moet in eerste instantie worden in hoeveelheden verdeeld in aparte buizen. </li><li> MOIS variërend 50 tot 500 werden getest tijdens de methode-ontwikkeling en efficiënte transductie percentages werden waargenomen in de meeste gevallen, zonder negatieve effecten op de levensvatbaarheid van de cellen. </li><li> Adeno-GFP werd ook gebruikt tijdens de ontwikkeling van methodes om snel het scherm transductie efficiëntie. Deze controle (of een lege vector) moeten worden uitgevoerd tijdens het experiment aan dat virale infectie alleen zorgen niet leidt tot cellulaire veranderingen. Evenzo, als de weg te snijden floxed gen van interesse in je cellen niet resulteert in een cellulaire veranderingen (dat wil zeggen veranderingen in de morfologie of levensvatbaarheid), dan infecteert hetzelfde celtype met adeno-GFP is een belangrijk controle te gebruiken om aan te tonen dat virus transductie is voorkomen. </li></ul> Buiten het onderzoek van de signalering cascades in de cultuur, heeft het adeno-Cre aanpak ook is gebruikt in vivo voorwaardelijk genen te verwijderen van proefdieren 3,4, en specifieke populaties van cellen label binnen een organisme 6. Het adenovirus systeem kan ook worden aangepast aan andere genen dan de Cre-recombinase in gastheercellen te introduceren. Twee belangrijkste voordelen van het gebruik van deze aflevering vector door zijn hoge transductie en gen delivery-efficiëntie, en het gebrek aan integratie met gastheer-DNA. Echter, de generatie van nieuwe recombinante adenovirussen te arbeidsintensief. Het protocol beschreven hier dus benut de kracht van het adenovirale systeem door gebruik te maken van de eerder ontwikkelde adeno-Cre virus, en de koppeling die met onze floxed allel van belang, Rac1. Door middel van deze voorwaardelijke knock-out experiment, hebben we bevestigd dat transductie met behulp van het adeno-virus van Cre MEFs het dragen van een floxed Rac1 allel wel degelijk excisie van Rac1 die leidt tot de veranderingen in de cellulaire morfologie kenmerk van Rac1-deficiënte cellen 2,5 veroorzaken.

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre virus</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>DME medium met hoge glucoseconcentratie 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS van Canadese oorsprong 500mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>PEN-STREP 1X oplossing 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X phalloïdine</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirus-gemedieerde genetische verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

De mogelijkheid om genetisch te verwijderen specifieke onderdelen van de verschillende cell signaling cascades is een integraal instrument in de moderne signaaltransductie analyse. Een bijzondere methode om deze voorwaardelijke verwijdering te bereiken is via het gebruik van het Cre-loxP systeem. Deze methode houdt in flankerend het gen van belang met loxP sites, die specifiek zijn herkenningssequenties voor het Cre recombinase eiwit. Blootstelling van de zogenaamde floxed (geflankeerd door loxP site) DNA aan dit enzym resulteert in een Cre-gemedieerde recombinatie evenement op de loxP plaatsen, en de daaropvolgende excisie van de tussenliggende gen 3. Verschillende methoden bestaan ​​om Cre recombinase toe te dienen aan de plaats van belang. In deze video, tonen we het gebruik van een adenovirus met het Cre recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten (MEF) verkregen uit embryo&#39;s met een floxed Rac1 allel een infecteren. Onze reden voor de keuze van Rac1 MEFs voor onze experimenten is dat duidelijk morfologische veranderingen te zien bij de verwijdering van Rac1, als gevolg van veranderingen in het actine cytoskelet 2,5. 72 uur na virale transductie en Cre expressie, werden de cellen gekleurd met behulp van de actine kleurstof phalloidin en beeld gebracht met behulp van confocale laser scanning microscopie. Er werd vastgesteld dat MEFs die waren blootgesteld aan het adeno-virus verscheen Cre gecontracteerd en langwerpig in de morfologie in vergelijking met niet-geïnfecteerde cellen, in overeenstemming met eerdere verslagen 2,5. Het adenovirus methode van Cre recombinase aflevering is voordelig als het adeno-virus Cre is makkelijk verkrijgbaar, en gendeletie via Cre in bijna 100% van de cellen kan worden bereikt met optimale adenovirale infectie.

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

De mogelijkheid om specifieke componenten van diverse cel-signaleringscascades genetisch te verwijderen, is een essentieel instrument geworden in de moderne signaaltransductie...

Moderne genetische analyse is sterk afhankelijk van technieken die de gerichte verwijdering van specifieke genen uit cellen, organen of volledige organismen mogelijk maken. Deze knockout-experimenten helpen bij het onthullen van de functie van het gen in zijn cellulaire context. De moleculaire, morfologische en fysiologische fenotypes van de knockout bieden allen aanwijzingen over de rol van de genproducten die door de verwijderde sequentie worden gecodeerd.In modelorganismen zoals muizen is een gangbare methode om een conditionele gen-deletie te bewerkstelligen het flankeren van het gen of exon van belang met loxP-sites, die dienen als herkenningssequenties voor het enzym Cre-recombinase. De onomkeerbare excisie van het zogenaamde geflankeerde allel wordt vervolgens gekatalyseerd door Cre, waardoor de sequentie uit het genoom wordt verwijderd. Er bestaan verschillende methoden om Cre-recombinase in het systeem te introduceren, waaronder methoden die in vivo worden uitgevoerd en methoden die direct worden toegepast op gevestigde cellijnen.Voor deze specifieke toepassing gebruiken we een adenovirus om Cre af te leveren aan fibroblastcellen die zijn geïsoleerd en gekweekt uit een transgene muis met een flox-allel. Deze methode resulteert in een efficiëntie van bijna 100% bij de aflevering van het transgen. Wanneer het virus aan de cellen wordt toegediend, wordt het geïnternaliseerd in een endocytische vesikel en getransporteerd naar de kernenvelop, waar het DNA, inclusief het transgen van belang, via het kernporiecomplex de kern kan binnendringen.De cellulaire machinerie kan vervolgens het geïnjecteerde gen transcriberen, waardoor de eiwitproducten ervan in de cel kunnen werken. In dit geval excideert het viraal gecodeerde Cree Recombinase-enzym het geflockte allel uit het genoom van de gastheercel. Wij komen van het Jones Lab aan de University of Guelph in Guelph, Ontario, Canada.In ons laboratorium zijn we geïnteresseerd in het concept van signaaltransductie en wat er gebeurt wanneer specifieke componenten van diverse signaaltransductiecascades worden verwijderd. Vandaag gaan we kijken naar een cascade die gerelateerd is aan de organisatie van actine. Signaaltransductie wordt gerealiseerd door een reeks biochemische componenten die informatie overdragen en fenotypische veranderingen teweegbrengen, zoals de reorganisatie van actine.Ons eiwit van belang is RAC1, een kleine GTPase die een belangrijke rol speelt bij het mediëren van actinedynamiek, waaronder celadhesie, migratie en morfologie. In dit onderzoek zullen we het Cre-LoxP-systeem gebruiken om dit gen te verwijderen en de rol ervan in de cel te bevestigen. Voorheen werden fibroblastcellen geïsoleerd uit embryonale muizen met een gefloreerde RAC1-allel, 12 dagen na laatkennis.Deze cellen werden vervolgens in vloeibare stikstof geplaatst voor langdurige bewaring, en we beginnen met het ontdooien van één buisje van deze cellen die één embryo vertegenwoordigen. Bij het uitvoeren van celkweekexperimenten is het belangrijk dat een steriele omgeving wordt gehandhaafd. Dit houdt in dat de blootgestelde oppervlakken van een goedgekeurde laminaire flowkast worden afgenomen, en dat alle reagensflessen en laboratoriumapparatuur die de kast ingaan, worden besproeid met 70% ethanol.Zodra de laminaire flowkast is voorbereid, worden de cellen ontdooid door het vials in een bekerglas met water van 37 °C te plaatsen totdat de inhoud vloeibaar is. Steriliseer vervolgens het vial met 70% ethanol en voeg daarna de celsuspensie toe. Voeg deze druppelsgewijs toe aan een 10 cm plaat met 9 mL DMEM, high glucose medium dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline.Voeg Streptomycine toe, schud de plaat voorzichtig om de cellen te verspreiden en plaats deze in de incubator op 37 °C met 5% CO2, waarbij u erop let dat de plaat met de juiste informatie wordt gelabeld. De cellen bereiken doorgaans binnen 24 uur een confluentie van 100%. Op dit punt kunnen de cellen worden overgezet naar een nieuwe plaat.Om dit te doen, begint u met het aspireren van het oude medium. Voeg vijf ml steriele PBS toe om de cellen te spoelen en verwijder dit vervolgens ook. Voeg nu één ml trypsine toe die 10 millimol EDTA bevat.Plaats de plaat gedurende ongeveer vijf minuten in de incubator bij 37 °C om de cellen los te laten komen van het substraat. Keer terug naar de laminaire flowkast en voeg negen ml medium toe aan de getrypsineerde plaat, waardoor de cellen 1 op 10 worden verdund; pipetteer de vloeistof meerdere keren op en neer om celklonters op te breken, neem vervolgens één ml van de suspensie op en voeg deze druppelsgewijs toe aan negen ml vers medium in een nieuwe 10 centimeter plaat. Schud de plaat opnieuw voorzichtig om de cellen te verspreiden en plaats deze in de incubator bij 37 °C.Wanneer de cellen confluentie hebben bereikt, is de volgende stap om ze uit te zaaien op glazen dekglasjes, zodat ze via microscopie kunnen worden bekeken. Bereid de cellen voor met dezelfde techniek als bij het verpakken, tot en met het toevoegen van trips aan de cellen en het plaatsen ervan in de incubator van 37 °C. Terwijl de cellen van de plaat loslaten, bereidt u een six-wellplaat voor met glazen dekglasjes, waarbij per well één geautoclaveerd dekglasje wordt gebruikt.Zodra de cellen los zijn gekomen van de plaat, worden vijf tot zes ml medium toegevoegd aan de getrypsiniseerde cellen. Voor de volgende fase van het experiment worden celstellingen uitgevoerd, zodat een passend aantal cellen kan worden geplaatst voor een efficiënte virusinfectie. Om de cellen te tellen, worden 15 µL monster gecombineerd met een gelijk deel trypanblauw; meng dit door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen en voeg 15 µL van deze oplossing toe aan de hemocytometer.Dode cellen zullen blauw kleuren. Tel bij deze preparatie alleen de levende of kleurloze cellen in het vier-bij-vier raster om het aantal cellen per microliter te berekenen. Begin met het tellen van de cellen in vier afzonderlijke rasters, A tot en met D, en bepaal het gemiddelde. Vermenigvuldig deze waarde vervolgens met twee om rekening te houden met de verdunning in trypan blue.Aangezien het rooster een volume van een tiende van een microliter bevat, vermenigvuldigt u dit getal met 10 om het aantal cellen per microliter uit te drukken. Bepaal vervolgens het benodigde volume door het gewenste aantal cellen te delen door de eerder berekende celconcentratie. Voeg het berekende volume van de celsuspensie druppelsgewijs toe aan elke put van de six-well plaat.Laat deze cellen een nacht in de incubator bij 37 °C. De volgende dag wordt het virus aan de cellen toegevoegd. Het Den creek virus dat is verkregen van Vector B labs is in aliquoten verdeeld en bewaard bij -80 °C.Haal dit virus op en keer terug naar de laminaire flowkast. Haal de zes-well plaat uit de incubator en breng deze naar de kast. Aspireer het medium en was de cellen met 1 mL serumvrij DMEM.Voeg nu 1 ml serumvrij medium toe aan elke put voor de toevoeging van het virus. Voor de virale applicatie gebruiken we een multipliciteit van infectie of MOI van 500. De optimalisatie van het protocol is eerder uitgevoerd met verschillende MOI's, waarbij we hebben vastgesteld dat een MOI van 500 zeer efficiënte infectiepercentages opleverde met weinig of geen effect op de cellevensvatbaarheid.Gebruik de volgende vergelijking om de MOI te berekenen. Begin met het berekenen van het benodigde aantal virussen; dit kan worden gedaan door de doel-MOI, in dit geval 500, te vermenigvuldigen met het aantal cellen per putje. Om het volume van de virusvoorraad dat gebruikt moet worden te bepalen, vermenigvuldigt u het aantal virussen met 1000 en deelt u dit door de initiële concentratie van het virus. In dit geval voegen we 1,5 µL virusvoorraad toe aan elk putje dat geïnfecteerd moet worden.Wieg de plaat voorzichtig om het virus te verspreiden en plaats de plaat overnight in de incubator op 37 °C. Verwijder de volgende ochtend het virusmedium van de cellen, was met PBS en voeg twee ml regulier medium toe aan de cellen. In dit experiment stelden we vast dat fenotypische veranderingen in de cellen na ongeveer 72 uur optraden.Cellen die waren gekleurd met Acton din werden afgebeeld met de Leica T-C-S-S-P five multi-foton confocale laser scanning microscoop in het Advanced Analysis Center van de University of Guelph. Dit onthulde veranderingen in morfologie tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. Cellen die RAC one missen, lijken verlengd en dun in vergelijking met de brede, afgeplatte cellen die niet waren geïnfecteerd.Hier hebben we aangetoond dat het ADOC-creasesysteem een robuuste methode is voor efficiënte genoverdracht naar cellen, buiten de studie van signaaltransductie. U kunt deze methode echter ook gebruiken om genen uit te schakelen in proefdieren of wellicht om specifieke celpopulaties in een organisme te labelen. In principe kan het adenovirus-systeem ook worden gebruikt om andere genen dan Cre te introduceren.De voordelen van deze afleveringsmethode zijn de hoge affiniteit, efficiëntie en het gebrek aan integratie met het DNA van de gastheercel. De productie van gangbare adenovirussen kan echter arbeidsintensief zijn. Het hier beschreven protocol maakt daarom gebruik van de kracht van het adenovirale systeem met behulp van het eerder ontwikkelde ocre-virus met onze geflockte RAC one mes; via deze conditionele knockout hebben we aangetoond dat.De morfologie is dus inderdaad gedeeltelijk afhankelijk van de kleine GTPase zoals RAC. Tot slot willen wij vanuit het Jones Lab jullie bedanken voor het kijken naar onze video en veel succes wensen met al jullie toekomstig onderzoek.

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal...

Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in...

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van gen knock-outs die embryonaal dodelijk zijn in vivo in genetisch gemanipuleerde muismodel-afgeleide tumoren en vervolgens het effect beoordelen dat de knock-out heeft op tumorgroei, proliferatie, overleving, migratie, invasie en het transcriptoom in vitro en in vivo.

Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door ex vivo ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Dit protocol beschrijft hoe intrasplentische injectie van AAV8-afgeleverd klein haarspeld-RNA dezelfde gen-knockdown-efficiëntie in de lever bereikt als injectie van de poortader, wat een eenvoudigere procedure vertegenwoordigt met veel lagere perioperatieve en postoperatieve mortaliteit en complicaties.

Efficiënte genknockdown in de lever via intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8)-afgeleverd klein haarspeld-RNA

Leer efficiënte genexcisie met adenovirus-gemedieerde Cre-recombinase in primaire muizenembryonale fibroblasten. Deze methode onderzoekt de rol van Rac1 in actinedynamica met bijna 100% transductie-efficiëntie.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Meer video's verkennen