De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System
28 augustus 2010
Hele embryo cultuur techniek stelt ons in staat om de cultuur muis en rat embryo's Ex vivo Conditie tijdens een beperkte periode die overeenkomt met midgestation fasen. In deze video protocol, tonen wij onze standaard procedures van de rat gehele embryo cultuur na E12.5 het gebruik van de rotator-type fles cultuur-systeem.
In de ontwikkelingsbiologie worden verschillende dieren gebruikt voor experimenten. De techniek voor het kweken van embryo's is in de jaren 50 ontwikkeld en was al gevestigd voordat moderne genetische manipulatie in de landbouw werd geïmplementeerd. Specifieke gebieden van het embryo kunnen direct worden getarget door middel van micro-injectie of transfectie van genen, aangezien embryo's gemanipuleerd kunnen worden en onder een microscoop kunnen worden geobserveerd; daarom is het kweken van complete embryo's een zeer nuttig instrument.
Wanneer we het dynamische ontwikkelingsproces van maorian-embryo's willen bestuderen na de post-implantatieontwikkeling. De groei van maorian-embryo's is kritisch afhankelijk van de functionele presenter, wat de cultuurperiode beperkt. In het algemeen kunnen we embryo's cultiveren tijdens de periode van embryonale dag 8.5 tot 14.5 bij de rat, en E 6.5 tot 12.5 bij de muis.
In het laboratorium kweken we ratten- en muizenembryo's met behulp van een roterend kweeksysteem. Dit kweeksysteem is het meest gangbaar en geschikt voor de kweek van ratten- en muizenembryo's tijdens de late dracht. Dit is na E 11.5 bij ratten en E 9.5 bij muizen.
In deze video introduceren we ons standaardprotocol voor de kweek van E 12.5 RU-embryo's. Onder deze omstandigheden kan het embryo gedurende twee dagen worden gekweekt, wat voldoende is om diverse effectieve manipulaties in de kweek te onderzoeken. Er zijn twee kritieke stappen voor het succes hiervan.
Ten eerste moet de dissectieprocedure accuraat worden uitgevoerd om beschadiging van het embryo te voorkomen, in het bijzonder van de staafvaten. Ten tweede moet de procedure zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Dit geldt met name voor de oudere embryo's.
Voorbeelden hiervan zijn muizembryo's van E 10.5, die binnen 30 minuten overgeplaatst moeten worden. We hebben de techniek van hele-embryo-kweek toegepast voor embryo's van de pack six-mutant. Zo analyseren we het migratiepatroon van neurore-cellen in de mutant door een klein aantal cellen met kleurstof te labelen of door cellen te transplanteren in embryo's met een wild-type of mutante achtergrond.
Bovendien hebben we een methode ontwikkeld voor genoverdracht in gecultiveerde muizen- en rattenembryo's via elektroporatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van elektrische schokken. We kunnen op eenvoudige wijze constructen van exogene genen, dominant-negatieve vormen en siRNAs introduceren in het gebied van de ontwikkelende hersenen. Hierdoor kunnen we genfuncties gemakkelijk analyseren door middel van loss-of-function en gain-of-function experimenten.
We onderzoeken ook het gedrag van cellen die zijn gelabeld met GFP of RFP met behulp van orgaancultuur of slice-cultuur na transplantatie of cultivatie. U kunt dus diverse experimenten uitvoeren met Lio-cultuur in combinatie met andere technieken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit videoprotocol demonstreert de techniek voor het kweken van het gehele embryo voor rattenembryo's na E12.5 met behulp van een kweeksyteem met een roterende fles. Deze methode maakt ex vivo kweek mogelijk tijdens kritieke stadia van de mid-gestatie.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Embryologie
- Ex vivo kweektechnieken
Achtergrond
- De techniek voor kweek van het gehele embryo is sinds de jaren 1950 gevestigd.
- Het maakt manipulatie van embryo's mogelijk voor genetische studies.
- Embryo's kunnen worden gekweekt tijdens specifieke ontwikkelingsperioden.
- De groei is afhankelijk van de functionele aanwezigheid van het embryo.
Doel van de studie
- Om dynamische ontwikkelingsprocessen van embryo's na de implantatie te bestuderen.
- Om een gestandaardiseerde procedure te bieden voor de kweek van het gehele embryo.
- Om onderzoek in de ontwikkelingsbiologie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Techniek voor kweek van volledige embryo's
- Kweeksysteem met flessen van het rotatortype
- Ex vivo-condities voor rattenembryo's
- Kweekperioden van embryonale dag 8.5 tot 14.5
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kweek van rattenembryo's na E12.5.
- Demonstratie van standaardprocedures voor embryo-manipulatie.
- Inzicht in de kritieke groeifasen van embryo's.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor toekomstige studies.
Conclusies
- De techniek van gehele embryo-cultuur is een waardevol hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie.
- Het maakt de studie van de embryonale ontwikkeling onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.
- Gestandaardiseerde methoden verbeteren de reproduceerbaarheid in het onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het rotator-type systeem voor volledige embryo-cultuur (WEC) maakt directe manipulatie en observatie van knaagdierembryo's mogelijk tijdens kritieke stadia van de midgestatie, wat mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Dit ex vivo platform maakt nauwkeurige genetische en cellulaire interventies mogelijk, wat functionele targetvalidatie en pathway-onderzoek faciliteert voorafgaand aan in vivo studies. De reproduceerbaarheid en aanpasbaarheid maken het een waardevol instrument voor translationeel onderzoek en portfoliotriage bij ontwikkelings- en ziektemodellering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Maakt directe genetische of cellulaire manipulatie mogelijk voor functionele targetvalidatie in zoogdierembryo's.
- Ondersteunt mechanistische risicovermindering door loss-of-function- en gain-of-function-studies mogelijk te maken in een gecontroleerd ex vivo-systeem.
- Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden en hypothesetoetsing op cruciale ontwikkelingsmomenten.
- Biedt een platform voor het evalueren van de impact van kandidaat-interventies op de embryonale ontwikkeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, manipuleerbare embryonale systemen voor voor daaropvolgende fenotypische screening of mechanistische assays.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling van ontwikkelingsuitkomsten mogelijk na genetische of chemische perturbatie.
- Ondersteunt standaardisatie en schaalbaarheid van assays voor vergelijkende studies over verschillende genotypen of interventies.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van verbindingen of genfuncties mogelijk in een fysiologisch relevante context.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante ontwikkelingsstadia voor het modelleren van congenitale afwijkingen of genfunctie.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door mechanistische studies in intacte embryo's mogelijk te maken.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door ontwikkelingsrisico's vroeg in de pijplijn te verhelderen.
- Faciliteert de ontdekking en validatie van biomarkers in een gecontroleerd, manipuleerbaar systeem.
Integratie van Pipeline en Workflow
Het WEC-systeem van rotator-type slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde manipulatie en kwantitatieve analyse van de embryonale ontwikkeling mogelijk te maken. Gepositioneerd tussen in vitro assays en in vivo modellen, biedt het een uniek platform voor mechanistische studies en target de-risking.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via directe genetische of cellulaire interventie.
- Screening: Biedt assay-klare, reproduceerbare embryonale systemen voor kwantitatieve fenotypische read-outs.
- Analytics: Maakt meting van ontwikkelings-, migratie- of moleculaire uitkomsten mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt vroege mechanistische bevindingen met preklinische ziekte-modellering en biomarker-validatie.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, aanpasbaar platform voor herhaald gebruik in meerdere discovery-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij doelwitvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare ex vivo workflows voor ontwikkelingsstudies.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van assets in de ontdekkingsfase mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in embryologie, microdissectie en ex vivo manipulatietechnieken.
- Speciale instrumentatie voor kweek in flesjes van het rotatortype en microscopie-infrastructuur zijn vereist.
- Strenge standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende knaagdierstammen of ontwikkelingsstadia.
- De kweekperiode is beperkt door de embryonale afhankelijkheid van de placentafunctie, wat het analysevenster beperkt.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
