Name: De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer de hele embryocultuurtechniek voor rattenembryo's na E12.5 met een roterend flessysteem. Deze methode maakt ex vivo-kweek mogelijk tijdens cruciale midgestatieperiodes voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de heer Hajime Ichijo voor video-opname en nuttige adviezen voor het bewerken van de video. We danken ook Drs.Yuji Tsunekawa en Kaichi Yoshizaki voor soort assistent voor video-opname. Dit werk wordt ondersteund door KAKENHI op Young Scientist B en op prioritaire gebieden-Molecular Brain Science van MEXT van Japan. Wij erkennen de steun van Global COE-programma &#39;Basic and Translational Research Center for Global Brain Science &quot;van MEXT van Japan en de Core Research voor Evolutionaire Wetenschap en Technologie (CREST) ​​van de Japanse Science and Technology Corporation uit Japan Science and Technology Agency (JST) .

1. Het opzetten van de WEC-systeem <ol><li> Gezamenlijk een 0.22 um membraanfilter naar de inlaat siliconenslang binnen WEC-systeem een). </li><li> Open de klep van een gasfles met O 2 (95%) en CO 2 (5%). Doorstroming het gasmengsel in de trommel via de bruisende fles met geautoclaveerd water. </li><li> Stel de flow volume van het gas mengsel tot 50 cc. </li><li> Plaats de uit siliconen tube te laten in een fles water en bekijk de stroom van gas mengsel. </li><li> Draai de trommel met de snelheid van 20 rpm / min. </li></ol> 2. De voorbereiding van kweekmedium <ol><li> Dooi rat onmiddellijk-gecentrifugeerd (IC) serum bij 37,0 ° C b). Voeg D-glucose (2 mg / ml) in serum ontdooid in een autoclaaf bekerglas van 100 ml. Kweekmedium moeten worden voorbereid op de primaire cultuur-niveau (bijvoorbeeld met behulp van een kap). </li><li> Voeg antibiotica-antimycotische (100X) vloeistof aan het serum met 1: 400 verdunning. </li><li> Verdampen resterende isofluraan (als gevolg van anesthesie van de ratten tijdens het verzamelen van bloed) uit het serum gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT), c). </li><li> Steriliseer het kweekmedium met behulp van een 0,45 um membraanfilter. </li><li> Giet 3,0 ml van het medium in elke cultuur fles en sluit de top van elke fles met een siliconen plug, bedekt met aluminiumfolie (zie ref. 14) d). </li><li> Bereid drie of vier beschikking platen met zoutoplossing e Tyrode's). </li></ol> 3. Anesthesie van de rat en het isolement van de baarmoeder <ol><li> Diep verdoven een timed-zwangere ratten met inhalatie-of parenterale anesthetica. </li><li> Maak de buik van de zwangere ratten verdoofd met 70% ethanol. </li><li> Pak de huid met een tang en exterioriseren de buikwand door het snijden van de huid met grote schaar f). </li><li> Pak de buikwand met een pincet en maak U-vormige grote longitudinale incisies op de buikwand met een grote schaar tot aan de thoracale niveau g). </li><li> Beer weg de darm naar de linkerkant met een pincet en bloot een uiteinde van de baarmoeder is aangesloten op de eierstok. </li><li> Pick-up aan het einde van de baarmoeder met een pincet en knip de positie tussen de baarmoeder en eierstokken met een grote schaar. </li><li> Haal de baarmoeder van de zwangere rat door het snijden van de vet rond de baarmoeder tot aan de andere kant van de baarmoeder. </li><li> Overdracht van de baarmoeder om een ​​petrischaal met Tyrode's zoutoplossing. </li><li> Euthanaseren de rat door overmatige toediening van anesthetica of cervicale dislocatie na het verwijderen van de baarmoeder. </li></ol> 4. Verwijdering van embryo's uit de baarmoeder <ol><li> Kort spoelen de baarmoeder in een zoutoplossing Tyrode en overbrengen naar het tweede petrischaal met een paar fijne tang h). </li><li> Onder een binoculaire microscoop, pak de baarmoederwand met een paar fijne pincetten en snijd de baarmoederwand aan de kant tegenover de mesometrium verbinden met bloedvaten met behulp van oogheelkundige rechte schaar. </li><li> Steek de punt van oogheelkundige rechte schaar in de ruimte tussen de baarmoederwand en de decidua. Snijd de baarmoederwand lengterichting langs de antimesometrial kant. </li><li> Clump de decidua aan de mesometrial zijkant en gescheiden conceptuses uit de baarmoeder gebruik van twee paar fijne tang i). </li><li> Overdracht conceptuses naar de derde petrischaal met een gesteriliseerde glazen pipet met een geschikte diameter. </li></ol> 5. Dissectie van de rat embryo's <ol><li> Steek een uiteinde van de microforceps in de decidua en maak een dwarse incisie op de decidua rond de conceptie met twee paar pincetten. </li><li> Steek de uiteinden van de tang in de decidua aan de placenta kant en maken twee longitudinale incisies op de decidua naar de top. </li><li> Verwijder de decidua aan de placenta kant door scheuren, dat met twee paar pincetten. Verwijder de resterende decidua met twee paar pincetten. </li><li> Pick-up Reichert's membraan, een horizontale incisie op, en scheiden de membraan van het bevruchte ei in de anti-placenta kant. </li><li> Maak een klein gaatje aan de dooierzak in de buurt van de kop van het embryo met de twee paren van forceps, en snijd de dooierzak met een paar van oogheelkundige gebogen schaar. Het is belangrijk om niet te beschadigen grote bloedvaten. </li><li> Pak de amnion op de site rond het hoofd van het embryo met de twee paren van fijne pincet, en trek uit het embryo van de dooierzak door het scheuren van de amnion h). Het lichaam van het embryo moet worden getrokken uit de dooierzak de levering van zuurstof voor het embryo te verhogen in de midgestation stadium. </li></ol> 6. Hele embryo cultuur <ol><li> Controleer schade aan de placenta, dooierzak en de toestand van de hartslag en de bloedsomloop. </li><li> Zich bewust zijn van het niet uitrekken van de navelstreng, de overdrachthet embryo tot een cultuur fles met een gesteriliseerde glazen pipet. Overdracht van een zoutoplossing Tyrode om cultuur van flessen moeten worden zo weinig mogelijk. </li><li> Verwijderen van een niet-gat silicium stekker uit de rotator trommel. Sluit de cultuur fles met een stekker met een gat om de rotator trommel van de WEC-systeem loodrecht. Wees voorzichtig niet te dwingen op de trommel in ongeschikte richtingen, omdat de rotator trommel is een zeer fijn materiaal. De flessen met de opengesneden embryo worden overgedragen aan de cultuur een voor een openen van de voordeur van de incubator moet worden beperkt om de temperatuur van de incubator te voorkomen is verlaagd j). </li><li> Na 10 uur van de cultuur, te verhogen van de doorstroming van gasmengsel tot 75 cc en tot 100 cc na 24 uur (tabel 1). </li><li> Het kweekmedium moet worden veranderd rond 24 uur door de overdracht van de gekweekte embryo in een nieuwe cultuur fles met vers bereide medium. Verhoog de flow volume tot 125 cc na 34 uur en tot 150 cc na 48 uur (tabel 1) </li><li> Af en toe controleert de toestand van de gekweekte embryo's door het tellen van hartslag-tarief (dwz, 120-150/min is optimaal) en door het observeren van de bloedcirculatie. Indien nodig tellen het aantal somieten om de groei van embryo's in zoutoplossing Tyrode's te beoordelen. In de normale ontwikkeling, is een somiet toegevoegd in twee uur. </li><li> Wanneer WEC klaar is, stop levering van gas mengsel en verwijder de inlaat buis en het membraan filter om te voorkomen terugstromen in de inlaatbuis van de bruisende fles. </li></ol> 7. Opmerkingen <ol class="lalpha"><li> De temperatuur in de WEC-systeem wordt constant gehouden op 37,0-37,5 ° C. </li><li> 100% rat IC serum wordt routinematig gebruikt in onze WEC voor rat en muis embryo's en bewaard bij -20 ° C voor gebruik. </li><li> Wij kopen rat IC serum, dat is verzameld van ratten die zijn verdoofd met isofluraan. </li><li> Wegwerpflessen zijn ook verkrijgbaar bij Ikemoto Rika. Flessen en silicium stekkers moet worden geautoclaveerd. </li><li> Dissectie van embryo's moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, omdat handhaving van embryo's bij lage of hoge temperaturen tijdens de dissectie van invloed zijn verdere ontwikkeling in de WEC. </li><li> Tools voor dissectie worden gesteriliseerd door droge hitte. </li><li> De huid en buikwand dienen afzonderlijk te worden teruggebracht tot verontreiniging van haren te voorkomen in een schaal mogelijk te maken. Veranderen we een paar grote schaar en pincet met een nieuw paar van hen als we snijden de huid en de baarmoeder te isoleren, respectievelijk. </li><li> Met behulp van een tang die tips zijn prima is zeer belangrijk om zeker ontleden weefsels. We handmatig slijpen de uiteinden van pincet met een steen en machine-olie. </li><li> We maken gebruik van een kant van de pincet als een mes om overdruk te vermijden om embryo's. </li><li> Wanneer de temperatuur binnen in de WEC-systeem vermindert door het openen van de deur herhaaldelijk blijven we zetten het licht op temperatuur te houden binnen het systeem. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Figuur 1 toont de procedures van dissectie van de rat embryo en gekweekte rat embryo's. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Hele embryo cultuur van de E12.5 rat embryo. (A) Een conceptus ontleed uit de baarmoeder van de zwangere rat. (B) Afschaffing van de decidua aan de placenta kant. (C) Afschaffing van membraan Reichert's. (D) openen van de dooierzak. (E) De rat embryo kweken in de fles gedurende 6 uur na het begin van de WEC. (F) De rat embryo gekweekt voor 42 uur. d, decidua, R; Reichert's membraan, p, placenta, ys, dooierzak, e, embryo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 uur </td><td> 12 uur </td><td> 24 uur </td><td> 36 uur </td><td> 48 uur </td></tr><tr><td> E12.5 rat embryo </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 uur) </td><td> 95% 100 cc </td><td> 95% 125 cc (34 uur) </td><td> 95% 150 cc </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Optimale zuurstof conditie.

<ol><li>New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNew%2C+DAT+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).</li>
<li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Essential+Developmental+Biology+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).</li>
<li>Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujinaga%2C+M+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).</li>
<li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Genet.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li>
<li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li>
<li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li>
<li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6%3A%3AEGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li>
<li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens%2C+but+does+not+arrest%2C+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Fabp7%2C+a+downstream+gene+of+Pax6%2C+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li>
</ol>

Er zijn twee belangrijke stappen in het knaagdier WEC voor het succes. Ten eerste moet de dissectie procedure nauwkeurig niet te beschadigen embryo&#39;s, in het bijzonder de bloedvaten. Ten tweede moet de procedure worden zo snel mogelijk, omdat zuurstof en voedingsstoffen worden niet meer gevoed via de placenta na isolatie uit de baarmoeder. Dit is essentieel voor oudere embryo&#39;s. In het geval van rat WEC na E12.5, moeten we overdragen ontleed embryo&#39;s in de cultuur flessen binnen 30 minuten. <p class="jov...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td colspan="5"> Het opzetten van WEC </td></tr><tr><td> WEC-systeem (10-+0.310) </td><td> Gereedschap </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Een ander klein model is ook beschikbaar. </td></tr><tr><td> Silicium stekker zonder gat </td><td> Gereedschap </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Gasmengsel cilinder </td><td> Gereedschap </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Met 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Op maat te bestellen. </td></tr><tr><td> Gasregelaar </td><td> Gereedschap </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 urn filter Millex GS </td><td> Gereedschap </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anesthesie en isolatie van de baarmoeder </td></tr><tr><td> Grote schaar </td><td> Gereedschap </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Pincet </td><td> Gereedschap </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Verwijdering petrischaal (90 mm x 15 mm) </td><td> Gereedschap </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Deep-type schotel is het beste voor dissectie. </td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> Reagens </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Voor anesthesie </td></tr><tr><td> Pentobarbital natrium </td><td> Reagens </td><td> Schering-Plough Animal Health </td><td> - </td><td> Voor anesthesie </td></tr><tr><td> Tyrode&#39;s zout </td><td> Reagens </td><td> - </td><td> - </td><td> Naarmate het protocol in Ref. 2. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Timed-zwangere Sprague-Dawley rat </td><td> Dier </td><td> Charles Rivers Laboratories in Japan </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> De voorbereiding van kweekmedium </td></tr><tr><td> Cultuur glazen fles </td><td> Gereedschap </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Verwijdering cultuur fles </td><td> Gereedschap </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Siliconen plug met gat </td><td> Gereedschap </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumfolie </td><td> Gereedschap </td><td> Elk bedrijf </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Autoclaaf tas </td><td> Gereedschap </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Voor cultuur flessen </td></tr><tr><td> Autoclaaf tas </td><td> Gereedschap </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Voor silicium stekkers </td></tr><tr><td> 0,45 pm filter Millex HA </td><td> Gereedschap </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische buis </td><td> Gereedschap </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Bekerglas van 100 ml </td><td> Gereedschap </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC serum </td><td> Reagens </td><td> Charles Rivers Laboratories in Japan </td><td> - </td><td> Verwijzen naar: De heer Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336, Fax: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-glucose </td><td> Reagens </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica-antimyotic vloeistof </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissectie van embryo&#39;s </td></tr><tr><td> Oogheelkundige rechte schaar </td><td> Gereedschap </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Voor het snijden van de baarmoederwand </td></tr><tr><td> Oogheelkundige gebogen schaar </td><td> Gereedschap </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Voor het snijden van de dooierzak </td></tr><tr><td> Pincet # 5 </td&gt; <td> Gereedschap </td><td> Kracht </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Pincet # 5F </td><td> Gereedschap </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen pipet </td><td> Gereedschap </td><td> - </td><td> - </td><td> Met de hand gemaakt met behulp van Pasteur pipet. </td></tr><tr><td> Autoclaaf tas </td><td> Gereedschap </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Voor glas pipetten </td></tr><tr><td> Binoculaire microscoop </td><td> Gereedschap </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Licht </td><td> Gereedschap </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Olie steen </td><td> Gereedschap </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Voor het scherpen van de tang </td></tr><tr><td> Machine-olie </td><td> Gereedschap </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Voor het scherpen van de tang </td></tr></tbody></table>

de methode van knaagdieren hele embryo cultuur met behulp van de rotator-type bottle cultuur system

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Hele embryo cultuur (WEC) techniek is ontwikkeld in 1950 is door de New en zijn collega&#39;s, en toegepast voor ontwikkelingsbiologie 1. Hoewel de ontwikkeling en groei van zoogdieren embryo&#39;s zijn sterk afhankelijk van de functie van de placenta, WEC-techniek stelt ons in staat om de cultuur muizen en ratten embryo&#39;s ex vivo conditie tijdens een beperkte periode die overeenkomt met midgestation etappes tijdens de embryonale dag (E) 6.5-E12.5 in de muis of E8.5-E14.5 in de rat 2, 3, 4. In de WEC, kunnen we direct richten gewenste gebieden van embryo&#39;s met behulp van fijne glazen capillairen, omdat embryo&#39;s kunnen worden gemanipuleerd onder de microscoop. Daarom, knaagdier WEC is erg nuttige techniek als we willen dynamische ontwikkelingsprocessen van postimplanted zoogdieren embryo&#39;s te bestuderen. Tot op heden hebben verschillende types van WEC systemen ontwikkeld: 1. Onder hen, de rotator-type fles cultuur-systeem is het meest populair en geschikt voor de lange termijn de cultuur van embryo&#39;s op midgestation, dat wil zeggen, na E9.5 en E11.5 in de muis en rat, respectievelijk 1. In deze video protocol, tonen wij onze standaard procedures van de rat WEC na E12.5 met behulp van een verfijnd model van de oorspronkelijke rotator systeem, dat werd ontworpen door nieuwe en Cockroft 5, 6, en de invoering van de verschillende toepassingen van WEC techniek voor studies in zoogdieren ontwikkeling biologie.

Hele embryo cultuur techniek stelt ons in staat om de cultuur muis en rat embryo&#39;s<em&gt; Ex vivo</em&gt; Conditie tijdens een beperkte periode die overeenkomt met midgestation fasen. In deze video protocol, tonen wij onze standaard procedures van de rat gehele embryo cultuur na E12.5 het gebruik van de rotator-type fles cultuur-systeem.

De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System

De techniek van hele embryo-kweek (WEC) is in de jaren 50 ontwikkeld door New en zijn collega's en toegepast voor de ontwikkelingsbiologie 1. Hoewel de ontwikkeling ...

In de ontwikkelingsbiologie worden verschillende dieren gebruikt voor experimenten. De techniek voor het kweken van embryo's is in de jaren 50 ontwikkeld en was al gevestigd voordat moderne genetische manipulatie in de landbouw werd geïmplementeerd. Specifieke gebieden van het embryo kunnen direct worden getarget door middel van micro-injectie of transfectie van genen, aangezien embryo's gemanipuleerd kunnen worden en onder een microscoop kunnen worden geobserveerd; daarom is het kweken van complete embryo's een zeer nuttig instrument.Wanneer we het dynamische ontwikkelingsproces van maorian-embryo's willen bestuderen na de post-implantatieontwikkeling. De groei van maorian-embryo's is kritisch afhankelijk van de functionele presenter, wat de cultuurperiode beperkt. In het algemeen kunnen we embryo's cultiveren tijdens de periode van embryonale dag 8.5 tot 14.5 bij de rat, en E 6.5 tot 12.5 bij de muis.In het laboratorium kweken we ratten- en muizenembryo's met behulp van een roterend kweeksysteem. Dit kweeksysteem is het meest gangbaar en geschikt voor de kweek van ratten- en muizenembryo's tijdens de late dracht. Dit is na E 11.5 bij ratten en E 9.5 bij muizen.In deze video introduceren we ons standaardprotocol voor de kweek van E 12.5 RU-embryo's. Onder deze omstandigheden kan het embryo gedurende twee dagen worden gekweekt, wat voldoende is om diverse effectieve manipulaties in de kweek te onderzoeken. Er zijn twee kritieke stappen voor het succes hiervan.Ten eerste moet de dissectieprocedure accuraat worden uitgevoerd om beschadiging van het embryo te voorkomen, in het bijzonder van de staafvaten. Ten tweede moet de procedure zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Dit geldt met name voor de oudere embryo's.Voorbeelden hiervan zijn muizembryo's van E 10.5, die binnen 30 minuten overgeplaatst moeten worden. We hebben de techniek van hele-embryo-kweek toegepast voor embryo's van de pack six-mutant. Zo analyseren we het migratiepatroon van neurore-cellen in de mutant door een klein aantal cellen met kleurstof te labelen of door cellen te transplanteren in embryo's met een wild-type of mutante achtergrond.Bovendien hebben we een methode ontwikkeld voor genoverdracht in gecultiveerde muizen- en rattenembryo's via elektroporatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van elektrische schokken. We kunnen op eenvoudige wijze constructen van exogene genen, dominant-negatieve vormen en siRNAs introduceren in het gebied van de ontwikkelende hersenen. Hierdoor kunnen we genfuncties gemakkelijk analyseren door middel van loss-of-function en gain-of-function experimenten.We onderzoeken ook het gedrag van cellen die zijn gelabeld met GFP of RFP met behulp van orgaancultuur of slice-cultuur na transplantatie of cultivatie. U kunt dus diverse experimenten uitvoeren met Lio-cultuur in combinatie met andere technieken.

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

In dit artikel presenteren we een eenvoudige methode om op lange termijn in staat...

Een Ex-ovo Chicken Embryo Cultuur systeem geschikt voor Imaging en microchirurgie toepassingen

Een methode waardoor de directe farmacologische manipulatie van muis embryo's tijdens neurulatie dat maternale metabolisme omzeilt wordt beschreven. De techniek kan worden aangepast aan de verschillende aspecten van de neurulatie studie door het variëren van het tijdstip en farmacologische agent.

Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

Cultuur van het hele embryo van zoogdieren (WEC) wordt veel gebruikt in de teratology en ontwikkelingsbiologie. Direct gecentrifugeerd rattenserum wordt vaak geleverd als medium voor zowel muis- als ratten-WEC. In deze video demonstreren we ons standaardprotocol voor de bereiding van hoogwaardig rattenserum dat geschikt is voor zoogdier-WEC.

Voorbereiding van de Rat Serum Geschikt voor zoogdieren Hele Embryo Cultuur

We demonstreren een methode voor het enten van gekweekte cellen in specifieke delen van vroege muis-embryo's om hun in vivo potentieel te bepalen. We introduceren ook een geoptimaliseerde elektroporatiemethode die glazen capillairen van bekende diameter gebruikt, waardoor de nauwkeurige levering van exogeen DNA in een paar cellen in de embryo's mogelijk wordt.

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo's maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo's gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Dit protocol beschrijft methodologieën om een eenvoudig en efficiënt in-vitromodel voor embryo-implantatie op te zetten voor het evalueren van de relevante moleculen die het embryo-implantatieproces beïnvloeden.

Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro

Leer de hele embryocultuurtechniek voor rattenembryo's na E12.5 met een roterend flessysteem. Deze methode maakt ex vivo-kweek mogelijk tijdens cruciale midgestatieperiodes voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System

Meer video's verkennen