Name: Voorbereiding van de Rat Tail Pezen voor Biomechanische en Mechanobiological Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Leer de voorbereiding van rattenstaartpezen voor biomechanische en mechanobiologische studies. Deze methode omvat extractie, dwarsdoorsnede-meting, spoelen en inladen in een bioreactor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit artikel werd ondersteund door NSERC Grant # 299280, IRSST als een beurs aan G. Ouder en FRSQ als een undergraduate student onderzoek toe te kennen aan M. Cyr. Wij danken Yoan Lemieux-Laneville voor het uitvoeren van de manipulaties opgenomen op video.

Voorafgaand aan elke manipulatie, moet je identificeren van de groep van pezen om te worden gebruikt, afhankelijk van het experiment dat u voert en het apparaat tot uw beschikking. Voor ons doel, werden ventrale pezen gekozen omdat ze kleiner en dus makkelijker te manipuleren bij het meten van de doorsnede en passend ze in de bioreactor kamer. Houdt u er rekening mee dat alle instrumenten worden geautoclaveerd of gesteriliseerd met 70% ethanol. Bovendien is een spray fles met 70% ethanol geplaatst naast elk werk station naar de onderzoekers handschoenen steriliseren voor elke operatie. Deel 1: Extraction Na resectie, is de staart zorgvuldig gemanipuleerd door de uiteinden om te voorkomen dat schade aan de weefsels. Ook te behouden levensvatbaarheid van de cellen, worden alle manipulaties uitgevoerd in koude zoutoplossing. 1A) Materialen: <ul><li> Koude zoutoplossing (D-PBS) </li><li> Crushed ijs </li><li> Oppervlak beschermer </li><li> Snijplank </li><li> Individuele manipulatie platen </li><li> 2 500 ml gerechten </li><li> 2 2L glazen schalen </li><li> Plakband </li><li> Een pincet </li><li> Een pincet </li><li> Een pincet stand </li><li> Een Paar van de chirurgische schaar </li><li> 1 Scalpel </li><li> Een paar chirurgische schaar <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Individuele manipulatie met oriëntatie identificatie ("P" voor "proximale") </li></ul> 1B) Werk station: <ol><li> Spreid het oppervlak beschermer en plaats de snijplank op de top. </li><li> Vul elke twee grotere glazen schalen tot halverwege met crushed ijs en leg ze op het papier. </li><li> Plak een stukje plakband op een hoek van de manipulatie plaat en zich identificeren met een brief aan het proximale uiteinde aan te geven. </li><li> Vul de twee kleine glazen schalen tot halverwege en alle groeven van de manipulatie platen met koude zoutoplossing. Plaats ze in de grote glazen schalen met ijs. </li><li> Organiseren van alle steriele instrumenten op het oppervlak beschermer. </li><li> Breng de staart in een van de glazen schaaltje met zoutoplossing. </li></ol> 1C) Manipulaties: <ol><li> Let op de anatomie aan het proximale uiteinde van de staart aan de buikzijde te onderscheiden van de rugzijde. De buikzijde heeft een groter aantal pezen en een bloedvat dat kan worden geverifieerd door zachtjes knijpen de staart om kleine druppels bloed te produceren. </li><li> Met behulp van de chirurgische schaar, knip de huid langs de dorsale zijde van de staart als je wilt het ventrale pezen (of langs de buikzijde als u de dorsale pezen nodig hebben) extract. </li><li> Open de incisie aan het proximale uiteinde en verwijder de huid met behulp van een tang of met uw vingers en door zorgvuldig het manipuleren van de staart eindigt. </li><li> Afspoelen van het bloed en het haar in de zoutoplossing en breng het monster in de resterende glazen schaaltje met verse oplossing. Veranderen handschoenen. Een dwarsdoorsnede bekeken onder lichtmicroscopie toont de zes pees groepen. Een pees van elke groep is verbonden aan het caudale einde van elke wervel, dus we snijden in de tussenwervelschijf om nieuwe pezen bloot te leggen langs de snede. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Dwarsdoorsnede van de rattenstaart bekeken onder een lichtmicroscoop. </li><li> Snijd het distale uiteinde door het kraakbeen 2-3 wervels korter met chirurgische schaar. Plaats de staart op de snijplank op de zachte weefsels met behulp van een scalpel en dan onmiddellijk te vervangen in de oplossing te snijden. </li><li> Met een pincet, trek een pees van het distale staart. </li><li> Met een zachte vasthouden aan beide kanten, plaats de pees in de individuele manipulatie plaat. Herhaal de laatste twee stappen tot er geen meer pezen kunnen worden ontward en snijd een wervel korter wanneer er nieuwe weefsels moeten worden blootgesteld. </li></ol> Deel 2: Cross-sectional area meting 7 Wanneer het weefsel mechanische karakterisatie of stimulatie ondergaat, zijn de mechanische eigenschappen beschreven door het normaliseren van de kracht in de pees op stress. Dit is waarom we evalueren doorsnede. 2A) Materialen: <ul><li> Optic Micrometer </li><li> Stereomicroscoop </li><li> Digitale camera </li><li> Edge erkenning en Profile reconstructie-algoritmen 5,6 </li><li> Koude zoutoplossing (D-PBS) </li><li> Een 20-200μL Micro volume pipet </li><li> Een Hex sleutel voor optische micrometer aanpassingen </li><li> 2 pincet / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "/&gt; Figuur 3. Optic Micrometer </li></ul> 2B) Werk station: <ol><li> Open de software (met digitale camera en algoritmen). </li><li> Plaats de optische micrometer, zodat er genoeg ruimte is om de pees belasting in het apparaat. </li><li> Het organiseren van de instrumenten en glazen schaaltje met de geëxtraheerde pezen dicht bij de hand. </li></ol> 2C) Manipulaties: <ol><li> Vul het meten van compartiment met koude zoutoplossing totdat beide anker systemen worden ondergedompeld. </li><li> Breng de pees in het compartiment door houden de uiteinden met een pincet. </li><li> Met behulp van afzuiging via de micro-volume pipet, trek een uiteinde op een moment in het silicium buis. Zuigen tot het einde reikt verder dan de as kragen. </li><li> Draai de as kragen om de buizen te comprimeren en het apparaat te installeren onder de stereomicroscoop. </li><li> Bij 105x vergroting, rek de pezen met inachtneming van het weefsel totdat de plooien zijn niet meer waarneembaar. Stretch door extra 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Tendon projectie op 105x vergroting voor en na het rekken. </li><li> Stel de positie en focus om een ​​duidelijk beeld van de pees over een 180 ° rotatie te behouden. </li><li> Maak een foto bij elke 10 ° rotatie zonder wijziging van spanning, focus of positie. Gebruik alleen de roterende as het uitvoeren van de rotatie. Door zijn kegelvorm, kunnen deze stappen worden herhaald op verschillende punten langs de pees. </li><li> Activeer de rand van erkenning en het profiel reconstructie algoritmen om de database die u hebt geregistreerd te analyseren. </li><li> Gratis de pees door het losdraaien van de as kragen en blazen lucht in de silicone buizen met behulp van de micro-volume pipet. </li><li> Plaats de pees op de manipulatie plaat, wederom behandeling door de uiteinden. </li><li> Controleer of de vorm van het verkregen profiel wederopbouw en de waarde van de doorsnede. </li></ol> Deel 3: Spoelen Voor het verwijderen van verontreinigingen die zich hebben voorgedaan tijdens de vorige manipulaties, worden de weefsels gespoeld onder bioveiligheid kast. 3A) Materialen: <ul><li> Koude zoutoplossing (D-PBS) </li><li> Multiple-groef manipulatie plaat </li><li> Individuele Manipulatie platen </li><li> Plakband </li><li> 2 pincet </li><li> Een pincet stand </li></ul> 3B) Werk station: <ol><li> Zet de ventilator in de bioveiligheid kabinet 15 minuten van te voren en reinig de binnenkant met 70% ethanol. </li><li> Breng alle instrumenten in de bioveiligheid kast. </li><li> Stok stukjes plakband op een hoek van iedere individuele plaat om het proximale uiteinde te identificeren. </li><li> Vul alle groeven met een steriele zoutoplossing. </li></ol> 3C) Manipulaties: <ol><li> Introduceer de manipulatie plaat met daarin de uitgepakte pees in de kast. </li><li> Met behulp van een pincet, verwijder dan de pees van zijn plaat met een zachte greep op elk uiteinde. </li><li> Dompel en roer voorzichtig de pees in de zoutoplossing van elk compartiment van de meervoudige-groef manipulatie plaat, uitgaande van de dichtstbijzijnde en over te gaan tot de verste groove. </li><li> Tot slot, dompel de pees in een individuele manipulatie plaat. </li></ol> Deel 4: Laden in de bioreactor kamer Om te voorkomen dat verdere besmetting, worden de volgende manipulaties ook uitgevoerd in de bioveiligheid kast. 4A) Materialen: <ul><li> Bioreactor kamer 4 </li><li> Steriel ankers </li><li> Een steriele petrischaal </li><li> Koude cel gekweekte Medium (DMEM) </li><li> Cyanoacrylaat </li><li> 2 pincet </li><li> Pincet stand </li><li> 0,5-10μl Micro-volume pipet </li><li> 1 Liniaal <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Bioreactor kamer </li></ul> 4B) Werk station: <ol><li> Sinds de vorige stap werd ook gerealiseerd in bioveiligheid kabinet, het verwijderen van onnodige tools geeft je meer werkruimte. </li><li> Breng alle andere instrumenten in de kast. </li></ol> 4C) Manipulaties: <ol><li> Plaats een anker op de manipulatie plaat met de spoel gecentreerd over de pees extremiteit en wond het weefsel op en rond de spoel. </li><li> Rol het anker op en houd het losse uiteinde, terwijl ervoor te zorgen dat het weefsel blijft verbonden aan het anker. Stop na ¾ draai. </li><li> Voer dezelfdestappen met het andere uiteinde. </li><li> Rol beide ankers dan even tot er 6 cm tussen de centers 1. </li><li> Draai de pees om het onder te dompelen in de oplossing en de verankerde secties kort drogen om de mechanische eigenschappen te verbeteren 2-3 mogelijk te maken. </li><li> Giet cyanoacrylaat in de petrischaal en trek 2.5μL in de micro volume pipet. </li><li> Breng een druppel van cyanoacrylaat op de wond-up weefsel, zonder te laten vallen geen lijm in de zoutoplossing. Herhaal dit tot 2 druppels zijn toegepast op elk anker. </li><li> Met de pees nog geheel ondergedompeld, 5 minuten wachten voor de lijm volledig droog is. </li><li> Gedurende deze tijd, vult de kamer compartiment met zoutoplossing. </li><li> Hydrateren alle weefsel met een zoutoplossing om beschadigingen te voorkomen. </li><li> Door het manipuleren van alleen de ankers, de overdracht van de pees in de bioreactor kamer en sluit deze om lekkage en vervuiling tijdens overdracht te voorkomen. </li></ol> Deel 5: representatieve resultaten: De uitkomst van het protocol laat zien dat wanneer correct uitgevoerd, onze weefsels strenge isolatie-en voorbereiding van de procedure maakt het mogelijk om weefsel steriliteit, leefbaarheid en integriteit te behouden. De eerste, met behulp van de eenvoudige en repetitieve extractiemethode, we zijn in staat om de staart pezen halen zonder beschadiging van het collageen-netwerk als het kan worden waargenomen door een microscopische analyse van H &amp; E besmet secties gerealiseerd na de extractie. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Tendon collageen netwerk na extractie (5 urn langsdoorsnede gekleurd met H &amp; E). We dan gekweekt pezen tot tien dagen en uitgevoerd steriliteit tests. Elke dag, we plated gebruikt kweekoplossing op agar en geïncubeerd het voor 24 uur. Aangezien er geen bacteriële groei werd waargenomen, concluderen we dat onze manipulaties niet leiden tot besmetting. Met het profiel reconstructie-algoritme en de optische micrometer, zijn wij in staat om de cross-sectional area schatten binnen een 2% foutmarge van 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Profile reconstructie van een RTT. Ten slotte hebben we onderzocht met behulp van de levensvatbaarheid Live / DEAD de levensvatbaarheid / cytotoxiciteit Kit voor cellen van zoogdieren na het spoelen stap en na een twaalf-dagen cultuur periode. Aangezien een grote meerderheid van de groene fluorescerende levende cellen zichtbaar waren, kunnen we bevestigen dat onze isolatie procedures succesvol zijn in het behoud van levend weefsel. Dezelfde test werd uitgevoerd twee uur na het bevestigen van de pees in de bioreactor kamer. We geverifieerd dat de uitdroging en lijm aan het anker niet had verspreid in het weefsel tussen de beide ankers. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. Levensvatbaarheid van het weefsel op het anker (groen = levende cellen, rood = dode cellen)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

Door de toepassing van deze experimentele procedures, kunnen we een breed scala van gedrag in vitro studies op dit soort van weefsels. Zoals bijvoorbeeld, was een studie over weefseldegeneratie uitgevoerd door de toepassing van de onder-stimulatie tot laboranten voor een periode van tien dagen. Elke dag hebben we geëvalueerd weefsel mechanische eigenschappen in niet-destructieve spanningsrelaxatie tests. Aan het einde waren we in staat om RTT spanning variatie dus observeren en de progressie van de mechanische ...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Reagens</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Zoutoplossing</td></tr><tr><td>Glucose </td><td>Reagens</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Zoutoplossing&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibiotica-antimycotica </td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Zoutoplossing&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Kweekoplossing</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Reagens</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Kweekoplossing&lt;br/&gt;3.7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagens</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Kweekoplossing&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibiotica-antimycotica</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Kweekoplossing&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Optische micrometer</td><td>Instrument</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulatieplaat</td><td>Instrument</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactorkamer</td><td>Instrument</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de rat tail pezen voor biomechanische en mechanobiological studies

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rattenstaart pezen (RTO&#39;s) zijn een veel voorkomende biologisch model gebruikt in de experimentele in vitro studies op het gebied van pees fysiologie en tendinopathie. Het werken met de weefsels is een uitdaging, want ze zijn erg kwetsbaar, en tot nu toe was er geen rigoureus gedetailleerd protocol voor de isolatie. Geconfronteerd met deze uitdagingen, hebben we methoden en instrumenten voor manipulatie van de RTO&#39;s en controle levensvatbaarheid van het weefsel, steriliteit en integriteit te vergemakkelijken. Dit artikel beschrijft de experimentele procedures gebruikt om de laboranten voor te bereiden op biomechanische en mechanobiological studies. Ons werk is onderverdeeld in vier stappen: extractie, doorsnede meten, spoelen en laden in de bioreactor kamer. Bij elke stap worden alle procedures, materialen en manipulaties in detail gepresenteerd, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gereproduceerd. Bovendien zijn de ontwikkelde specifieke instrumenten gepresenteerd: een manipulatie plaat gebruikt om de laboranten te scheiden, een optische micrometer tot het weefsel positie tijdens de doorsnede meet-en een verankering systeem om de laboranten hechten op een bioreactor. Tot slot beschrijven we de resultaten die zijn verkregen na meerdere tests om onze werkwijze te valideren. De levensvatbaarheid, de steriliteit en integriteit evaluaties tonen aan dat onze procedures zijn streng genoeg voor de manipulaties van de kwetsbare weefsels, zoals rattenstaart pezen.

Dit artikel beschrijft de experimentele procedures gebruikt om de rattenstaart pezen voor te bereiden op biomechanische en mechanobiological studies. Verschillende functies van de belangrijkste stappen in voorbereiding worden gedemonstreerd, te beginnen met afzuiging, doorsnede meten, spoelen en laden in de bioreactor kamer.

Voorbereiding van de Rat Tail Pezen voor Biomechanische en Mechanobiological Studies

Rattenstaartpezen (RTT's) zijn een veelgebruikt biologisch model in experimentele in vitro studies op het gebied van peesfysiologie en peesdegeneratie (tendinopathie). Werken ...

De video die u gaat zien bevat de experimentele procedures die worden gebruikt om staartpezen van ratten te isoleren en voor te bereiden voor biomechanische en mechanisch-biologische studies. Het doel van dit artikel is om de methoden en instrumenten te demonstreren die zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd om de levensvatbaarheid, steriliteit en integriteit van het weefsel tijdens de preparatieprocedure te behouden. We bespreken verschillende kenmerken met betrekking tot de belangrijkste stappen van de preparatie, beginnend met de extractie, gevolgd door de meting van het dwarsdoorsnede-oppervlak, het spoelen en tot slot het laden in de bioreactorkamer.Laten we beginnen. De extractie is de eerste stap van de preparatie om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Alle handelingen worden uitgevoerd in koude seline-oplossing.Nadat de rat is geëuthanaseerd, wordt de staart geresecteerd, afgespoeld met 70% ethanol, overgebracht naar een schaal met celoplossing en op ijs bewaard. Om de extractie van de pees te vergemakkelijken, moet de huid worden verwijderd. Houd er rekening mee dat we werken met ventrale pezen.Omdat ze kleiner zijn en gemakkelijker te manipuleren zijn met onze apparatuur, wordt er een incisie gemaakt langs de gehele dorsale zijde van de staart. De juiste oriëntatie van de staart wordt vervolgens geverifieerd door de anatomie aan het proximale uiteinde te observeren. Zoals we kunnen zien, vertoont de ventrale zijde een groter aantal pezen en de aanwezigheid van een bloedvat kan worden bevestigd door de verkregen bloeddruppels.Terwijl de staart voorzichtig wordt ingedrukt, wordt de incisie gemaakt. Begin bij het proximale uiteinde en gebruik hiervoor een chirurgische schaar. Let erop dat de staart alleen bij de uiteinden wordt vastgehouden.Zodra de incisie is voltooid, wordt de huid verwijderd, beginnend vanaf het proximale uiteinde met behulp van vingers of een pincet. Er wordt opnieuw zorgvuldig gehandeld om de staart bij de uiteinden te manipuleren. Vervolgens wordt de staart afgespoeld in de oplossing om haren en bloed te verwijderen.Het preparaat wordt vervolgens overgebracht naar een schaal met verse oplossing en op ijs bewaard. Op dit punt wisselt de onderzoeker van handschoenen om de pees bloot te leggen. Het distale uiteinde van de staart wordt twee tot drie wervels korter geresecteerd.De wervels zijn de zichtbare bundels tussen de peesbundels en kunnen ook gevoeld worden door met de vingers langs de staart te glijden. Een weergave van de lichtmicroscopie van een transversale doorsnede gemaakt langs de wervel. Het uiteinde laat zien dat er zes verschillende peesgroepen zijn, aangezien de pees van elk van hen aan de wervel is bevestigd en dat we enkel de ventrale weefsels gebruiken.Bij elke snede worden vier pezen verwijderd, twee uit de onderste groepen en twee uit de laterale groepen. Voor de resectie kunt u een chirurgische schaar gebruiken om de tussenwervelschijf door te snijden en een scalpel op een snijplank voor de weke delen. Op dit punt is de ventrale zijde te herkennen aan de aanwezigheid van grotere peesbundels.Zodra de oriëntatie is geverifieerd, worden de pezen voorzichtig met een pincet uit het distale uiteinde geëxtraheerd; wanneer er geen weefsels meer kunnen worden losgemaakt, wordt de staart geresecteerd op de vertebrale schouder zoals eerder getoond. Na de extractie wordt het weefsel onmiddellijk in de oplossing ondergedompeld en wordt de pees, door beide uiteinden vast te houden, overgebracht naar een manipulatieplaat die ook de celoplossing bevat en waarop tape wordt gebruikt om het proximale uiteinde te identificeren. Een microscopische analyse van een met H&amp;E gekleurde longitudinale sectie laat zien dat door het gebruik van deze eenvoudige en repetitieve methode het geëxtraheerde weefsel een goed uitgelijnd en dichtgepakt collageennetwerk heeft.Na manipulatie, wanneer weefsels worden onderworpen aan mechanische stimulatie, beschrijven we hun mechanische eigenschappen door de interne kracht te normaliseren tot spanning. Daarom moeten we hun dwarsdoorsnede evalueren. Om dit te doen, wordt het profiel van het monster gereconstrueerd met behulp van een stereomicroscoop die is uitgerust met een digitale camera.Met deze methode blijft de integriteit van de weefsels behouden, aangezien de sneeuwbelasting of spanning er direct op wordt uitgeoefend. De digitale camera maakt foto's van de projectie van de tenant over een gezichtsveld van 180°. Binnen een referentiekader lokaliseert een vision assistant-algoritme de boven- en onderranden van het specimen.Vervolgens wordt een algoritme met MATLAB-software gebruikt om de profielreconstructie uit te voeren. Er is een optische micrometer ontworpen om het weefsel in de focuszone te houden. Buiten dit gebied is de projectie namelijk wazig en zou herfocussen het lokale referentiekader verschuiven.De micrometer bevat een meetcompartiment om dehydratatie van het weefsel te voorkomen. Twee positioneringssystemen met een roteerbare tafel maken rotatie van het specimen mogelijk, samen met twee verankeringsmechanismen bestaande uit siliconenbuizen die tegen de schachtkleuren zijn gecomprimeerd. Ten eerste wordt het meetcompartiment gevuld met koude celoplossing totdat de openingen van de siliconenbuizen ondergedompeld zijn.Vervolgens wordt het ruimtevaartmannetje met een pincet naar het meetcompartiment overgebracht, waarbij alleen de extremiteiten worden vastgehouden. Met behulp van een micropipette worden de extremiteiten van de pees via een doorsnede in de siliconen buisjes getrokken. Er wordt vervolgens geaspireerd totdat het uiteinde voorbij de kleuren van de schacht steekt.Zodra beide zijden zijn voltooid, worden de schachtkleuren vastgezet door een neksleutel te gebruiken om de buis samen te drukken. Nu de pees is gefixeerd, wordt het apparaat onder het stereomicroscoopglas geïnstalleerd. De pees kan direct op het computerscherm worden waargenomen bij een vergroting van 105.Om consistentie te waarborgen, wordt de pees uitgerekt totdat de plooien niet langer waarneembaar zijn, gevolgd door een extra vervorming van 0,4%. Aangezien het specimen van 0 tot 170 graden wordt gefotografeerd, zijn een beginpositie en focusaanpassing vereist om over de gehele omtrek een helder beeld te verkrijgen. In totaal worden er 18 foto's gemaakt, waarbij de rotatie van het specimen tussen elk beeld met 10 graden wordt verhoogd.Met deze methode is het mogelijk om de dwarsdoorsnede van een staartpees van een rat te schatten zonder het weefsel te beschadigen. Aan het einde wordt een profielreconstructie verkregen met een foutmarge van 0,5 tot 2%. Na de meting worden de weefsels gespoeld om contaminatie te voorkomen die tijdens de eerdere handelingen kan zijn ontstaan.Steriele manipulatieschalen met verse fixeeroplossing worden in de kast geplaatst, waarbij de ene wordt gebruikt voor de spoelprocedure en de andere de gespoelde pees zal ontvangen. De onderzoeker wast zijn handschoenen met 70% ethanol voordat de geëxtraheerde pees in de veiligheidskast wordt gebracht. Door alleen de uiteinden vast te houden, wordt de pees voorzichtig van putje naar putje overgebracht.Ten slotte wordt het overgebracht naar een individuele manipulatieplaat die ook een steriele cellooplossing bevat. Voor de validatie van het protocol hebben we een levensvatbaarheids- en steriliteitstest uitgevoerd. Eerst werd de cellevensvatbaarheid beoordeeld met een live-dead viability cytotoxicity kit voor zoogdiercellen.Na een kweekduur van 12 dagen werd een grote meerderheid van groen fluorescerende levende cellen gevisualiseerd, wat bevestigt dat de isolatieprocedures succesvol zijn in het behoud van levend weefsel. Vervolgens werden onderzoeken uitgevoerd om de gebruikte kweek op contaminatie te controleren. Omdat er geen bacteriegroei werd waargenomen, werd het medium op agar geplaatst en gedurende 10 dagen geïncubeerd.We hebben vastgesteld dat onze manipulaties steriel zijn. Het gebruikte verankeringssysteem maakt gebruik van het voordeel van weefseldehydratatie en lijm voor kleine specimens zoals rattenstaarten en pezen, waarbij de lijm in het weefsel dringt. Dit is gefixeerd in alle subeenheden, terwijl dehydratatie de mechanische eigenschappen verbetert om verdere contaminatie te voorkomen.De gehele laadprocedure wordt uitgevoerd in een veiligheidskast waarbij alle instrumenten en kamercomponenten steriel zijn. Voor de laadoperatie wordt de bioreactorkamer op een positioneringsmal bevestigd. Twee beweegbare armen worden ingesteld om de peesankers op te vangen.Een dop sluit de kamer om contaminatie te voorkomen. Eerst worden de ankers op de uiteinden van de manipulatieplaat geplaatst. Hun spoelen worden gecentreerd met de longitudinale as van de groef en boven de pees.De pees wordt vervolgens opgewonden en rond één anker bevestigd. Het anker wordt ongeveer driekwartslag gedraaid, terwijl het lichaam van het weefsel in de oplossing blijft. Door het losse uiteinde vast te houden, waarborgen we de bevestiging van het weefsel aan het anker.Dezelfde procedure wordt vervolgens herhaald voor het andere uiteinde. Zodra beide zijden zijn gefixeerd, worden de ankers gelijkmatig afgerold of uitgerold totdat er 6 cm tussen de twee uiteinden zit. Vervolgens worden twee druppels van 2,5 µL ocreate aangebracht op het gewonde deel van de pezen.Er is zorgvuldig gehandeld bij het aanbrengen van de adhesie. Om te voorkomen dat er lijm in de celoplossing terechtkomt, is een minimale droogtijd van vijf minuten vereist voor de lijm. Om ons protocol te valideren, hebben we tests uitgevoerd om de invloed van de lijm en de dehydratie van het ankerpunt op de levensvatbaarheid van het weefsel te verifiëren.Na twee uur stelden we vast dat de conditie van de extremiteit zich niet buiten het weefsel had verspreid. In feite is er een duidelijk gedefinieerde kleurgrens die de overgang markeert tussen de rood fluorescerende dode cellen bij het ankerpunt en de meerderheid van de groene levende cellen van het weefsellichaam. Ondertussen wordt de bioreactorkamer gevuld met vers cultuurmedium.Zodra de wond van een deel van de pees droog is, wordt deze gerehydrateerd met celoplossing. Vervolgens wordt het verankerde weefsel met een pincet in de kamer overgebracht. De afdekking wordt gesloten om verdere contaminatie te voorkomen.De positioneringsmal wordt verwijderd zodra de kamer in de bioreactor is geïnstalleerd. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe een ratstaartpees kan worden voorbereid voor biomechanische en mechanisch-biologische studies. Door deze procedures toe te passen, kunnen we een breed scala aan in vitro studies op deze weefsels uitvoeren.Bijvoorbeeld, een studie naar weefseldegeneratie werd uitgevoerd door middel van stimulatie gedurende een periode van 10 dagen. Elke dag evalueerden we het weefsel, de mechanische eigenschappen en een niet-destructieve stressrelaxatietest. Aan het eind konden we variaties in de spanning waarnemen.We hebben aangetoond dat onze strikte isolatie- en preparatieprocedures het mogelijk maken om de weefsellevensvatbaarheid, ity en anti te behouden. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw eigen experimenten.

preparation-rat-tail-tendons-for-biomechanical-mechanobiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de chirurgische voorbereiding en procedures die nodig zijn om de contractiele responsen van de rat mediale gastrocnemius spier voorbereiding...

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor...

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

We beschrijven een in vivo protocol om dorsiflexie van de voet te meten na stimulatie van de peroneale zenuw en contractie van het anterieure crurale compartiment van de achterpoot van de rat. Dergelijke metingen zijn een onmisbaar translationeel hulpmiddel voor het evalueren van skeletspierpathologie en weefselengineeringbenaderingen voor spierreparatie en -regeneratie.

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Dit protocol beschrijft het evaluatieproces van genezing van pezen bij ratten die zijn ingespoten met allogene platelet rich plasma (PRP) of zoutoplossing na het verwijderen van deel van de achillespees. De voortgang van de genezing van de pees wordt geëvalueerd op verschillende tijdstippen met behulp van verschillende types van analyses.

Effecten van allogene Platelet-Rich Plasma (PRP) op het genezingsproces van verdeelde Achilles pezen voor ratten: een methodologische beschrijving

Deze paper beschrijft de voorbereiding en de evaluatie van de navelstreng mesenchymale stamcellen matrix afkomstige spheroïden met een bilaterale Patellaire pees defect model in een rat. Dit model werd werd geassocieerd met een aanvaardbaar morbiditeit en gevonden voor het detecteren van de verschillen tussen onbehandelde en behandelde pezen, en tussen de twee behandelingen getest.

Evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale Patellaire pees letsel Model bij ratten

In dit artikel presenteren we een in vitro en in situ protocol om een peesspleet van maximaal 1,5 cm te herstellen door deze te vullen met gemanipuleerd collageentransplantaat. Dit werd uitgevoerd door een aangepaste hechttechniek te ontwikkelen om de mechanische belasting te nemen totdat het transplantaat in het gastheerweefsel rijpt.

Een nieuwe tenorrfaphy hechttechniek met weefselmanipulatie collageentransplantaat om grote peesdefecten te repareren

Het protocol beschrijft efficiënte en reproduceerbare Trek-biomechanische testmethoden voor muriene pezen door het gebruik van Custom-Fit 3D-gedrukte armaturen.

Biomechanische beproeving van Muriene pezen

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van het hele heupzenuwweefsel van ratten voor ex vivo elektrofysiologische stimulatie en registratie in een milieugereguleerd, tweecompartimenten, doordrenkt zoutoplossingsbad.

Voorbereiding van de heupzenuw van de rat voor ex vivo neurofysiologie

We presenteren een op maat gemaakt experimenteel platform en weefselkweekprotocol dat fibrokraakbeenachtige verandering nabootst die wordt aangedreven door impingement van de achillespeesinsertie in explantaten van de achterpoten van muizen met aanhoudende cellevensvatbaarheid, en biedt een model dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanobiologie van peesimpingement.

Muizen achterpoot explantatiemodel voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespees impingement

Hier presenteren we een assembloid-modelsysteem om peescellulaire overspraak na te bootsen tussen het dragende peeskernweefsel en een extrinsiek compartiment met celpopulaties die worden geactiveerd door ziekte en letsel. Als belangrijke use case laten we zien hoe het systeem kan worden ingezet om ziekterelevante activering van extrinsieke endotheelcellen te onderzoeken.

Engineering Tendon Assembloids om cellulaire overspraak bij ziekte en reparatie te onderzoeken

Leer de voorbereiding van rattenstaartpezen voor biomechanische en mechanobiologische studies. Deze methode omvat extractie, dwarsdoorsnede-meting, spoelen en inladen in een bioreactor.

Voorbereiding van de Rat Tail Pezen voor Biomechanische en Mechanobiological Studies

Meer video's verkennen