Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis

Auto-immuun hypofyisitis wordt gekenmerkt door een vergroting van de hypofyse en een tekort aan één of meer hypofysehormonen. De veroorzakende auto-antigenen zijn nog onbekend. Hier wordt een protocol gedemonstreerd voor het prepareren van eiwitten uit de hypofyse van muizen voor gebruik bij het bestuderen van deze ziekte.

Eerst worden de hypofysen geïsoleerd uit geëuthanaseerde muizen. De hypofysen worden vervolgens gehomogeniseerd om de cellen mechanisch af te breken en cytosolische eiwitten vrij te maken. Het homogenaat wordt geklaard door middel van centrifugatie bij lage snelheid en beoordeeld op kwantiteit via een colorimetrische BCA-assay en op kwaliteit via polyacrylamidegelelektroforese.

Ten slotte wordt het waterige proteïnehomogenaat gemengd met een oliehoudend adjuvans. Dit mengsel wordt vervolgens in muizen geïnjecteerd om een muismodel te creëren dat lijkt op auto-immuun hypofysitis. Zoals getoond in de begeleidende video, zijn er vier technieken beschreven om hypofysitis bij proefdieren te induceren.

De in dit artikel gepresenteerde techniek, namelijk de injectie van een mengsel van hypofyse-eiwitten als influenzadjuvans, is de oudste methode en dateert uit de jaren 1960. Andere benaderingen waren de injectie van oplosbare glycoproteïnen van het rubellavirus in 1992, de stereotactische injectie van een adenovirus direct in de hypofyse in 2002, en de transplantatie van de hypofyse van de ene ratstam onder het nierkapsel van een andere ratstam in 2010. Het belangrijkste voordeel van de adjuvansmethode van Florence is dat deze tegenwoordig minder invasief is, consistenter en bovenal nauwkeuriger bij het opwekken van een ziekte die sterk lijkt op de menselijke tegenhanger.

Hoewel deze sinds de jaren 60 wordt beschreven, bleek de techniek met vreemd adjuvans weinig effectief voor de inductie van hypofysitis. Toen ik aan mijn PhD-onderzoek begon, kon ik met het gepubliceerde protocol voor vreemd adjuvans slechts een bescheiden aantal gevallen en een geringe ernst van hypofysitis bereiken. De resultaten verbeterden aanzienlijk nadat ik het idee kreeg om de hoeveelheid pitu-eiwitten in de EM-emulsie tienvoudig te verhogen.

Hoewel deze methoden inzicht kunnen bieden in de pathogenese van auto-immuunhypofyisitis, kunnen ze ook worden gebruikt om andere auto-immuunziekten te bestuderen waarvan de auto-antigenen nog moeten worden geïdentificeerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden vooral moeite hebben met de laatste stap, de bereiding van de marge, omdat dit handmatige vaardigheden, tijd en toewijding vereist. Een visuele demonstratie is daarom essentieel om te begrijpen hoe een juiste emulsie moet worden bereid.

De implicaties van deze techniek reiken verder dan het vakgebied van auto-immuniteit. Kennis over het voorbereiden van het antigeen voor immunisatie kan ook worden toegepast bij de productie van monoclonale antilichamen of voor het testen van nieuwe vaccins. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door S Zoo heroic Ura en Mayland al gato uit mijn laboratorium.

De hypofyse van de muis is een cilindervormige klier die zich aan de basis van de schedel bevindt in een verdieping van het spiekenbeen, genaamd de sella turcica. De klier wordt lateraal begrensd door de nervus trigeminus en anterieur door het chiasma opticum. De klier is opgebouwd uit een grotere voorlob en kleinere intermediaire en achterlobben.

Om de hypofyse te isoleren, gebruikt u een schaar om de geëuthanaseerde muis te onthoofden en maakt u vervolgens parallelle sneden van de achterkant naar de voorkant van de schedel. Til de hersenen op en klap deze naar achteren om de hypofyse bloot te leggen; deze verschijnt als een cilinder in de vorm van een gelijkbenige driehoek, waarbij de hypofyse de basis vormt, de nervi trigeminae de zijden zijn en het chiasma opticum de top vormt.

Omcirkel de klier met de punten van gesloten pincetten om de omliggende meninges door te breken. Pak vervolgens met fijne pincetten de hypofyse uit de sella turcica en plaats deze in een plastic buisje op droogijs. Verzamel voor één preparatie 300 muizenhypofyses.

Voor deze collectie is ongeveer negen personuren nodig. Zodra de collectie is voltooid, worden de hypofysen bewaard bij -80 °C tot ze nodig zijn. Plaats een Falcon-buis van 15 ml in een ijsbad.

Voeg 250 microliters homogenisatiebuffer toe aan de buis. Voeg voor elke 100 hypofysen die vlak voor de homogenisatie zijn verzameld, de muizenhypofysen toe aan de buffer. Plaats vervolgens de tip van de polytron-homogenisator, een generator met een diameter van vijf millimeter, op de bodem van de Falcon-buis met de muizenhypofysen en buffer, en homogeniseer op maximale snelheid gedurende 30 seconden.

Beweeg de buis voorzichtig op en neer terwijl deze op ijs blijft. Laat het homogenisaat vervolgens één minuut op ijs rusten. Herhaal de homogenisatie- en koelstappen nog twee keer.

Deze milde homogenisatie moet de cellen openbreken en de eiwitten vrijmaken zonder de kernen te beschadigen. Centrifugeer het homogenisaat op lage snelheid, ongeveer 1000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om de kernen, onbeschadigd weefsel en onoplosbare materialen, zoals bindweefsel en gedenatureerde eiwitcomplexen, te laten bezinken. Let erop dat het pellet niet wordt verstoord.

Breng de SNA, nu het post-nucleaire supernatant of PNS genoemd, over naar een nieuwe Falcon-buis voor bewaring. Houd de PNS op ijs, resuspendeer het pellet met hetzelfde volume homogenisatiebuffer als voorheen, en homogeniseer en centrifugeer zoals eerder beschreven. Verdeel de oplossing, na het samenvoegen van de twee PNS-monsters, over verschillende microcentrifugebuisjes.

Bewaar de microcentrifugebuisjes bij -80 °C tot ze nodig zijn. Deze eiwitpreparatie is stabiel bij -80 °C, maar verliest geleidelijk haar potentie. Daarom wordt aanbevolen om de preparatie binnen zes maanden na bereiding te gebruiken.

Bewaar één klein aliquot van het PNS om de eiwitopbrengst en -concentratie te bepalen met de biy-zuurmethode. Bepaal vervolgens de eiwitkwaliteit via gelelektroforese vanaf 300 muizenhypofysen, met een gemiddeld totaalgewicht van ongeveer 570 milligram. Er wordt een opbrengst verwacht van 60 milligram hypofyseeiwitten of één milligram eiwit per 10 milligram weefsel.

De proteïneconcentratie is doorgaans ongeveer 40 mg/mL. Het hier gegeven voorbeeld is bedoeld voor het immuniseren van 10 muizen. Er wordt gepland om elke muis 100 µL emulsie toe te dienen die 1 mg hypofyseproteïne bevat; rekening houdend met twee extra muizen voor materiaalverlies tijdens de bereiding, worden er in dit geval 12 mg proteïne-emulsie geprepareerd.

Begin met het snel ontdooien van de bevroren proteïne-aliquots door ze in de handen op te warmen. Pas de proteïneconcentratie aan naar 20 mg/mL met PBS. Trek vervolgens 600 µL van het hypofyse-proteïne-extract, overeenkomend met 12 mg, op in een 2,5 mL Gas Tite Hamilton-spuit en resuspendeer dit in compleet FRONS-adjuvans of CFA dat 5 mg/mL hitte-gedode mycobacterium tuberculosis bevat door het handmatig te schudden.

Trek vervolgens 600 µL van de CFA op in een andere Hamilton-spuit van 2,5 ml. Bevestig een micro-emulgerende naald van 22 gauge aan de met CFA gevulde spuit. Duw de zuiger langzaam in zodat de naald met CFA is gevuld.

Bevestig vervolgens het andere uiteinde van de naald aan de andere spuit die gevuld is met hypofyse-proteïne-extract en zet deze vast. Voorkom dat er luchtbellen in de spuiten achterblijven. Duw de zuiger van de CFA-spuit langzaam in om het oliecomponent in het waterige hypofyse-extract te drukken, zodat er slechts een kleine hoeveelheid wordt gemengd.

Duw vervolgens de zuiger van de spuit met hypofyse-extract terug in de CFA-spuit. Herhaal deze handeling om de hoeveelheid gemengd materiaal geleidelijk te vergroten totdat de volledige inhoud is gemengd. Dit witachtige en gelijkmatig verdeelde materiaal vormt de water-in-olie-emulsie.

Zodra de emulsie is gevormd, wordt de volledige heen-en-weergaande cyclus ten minste 500 keer herhaald; na de laatste cyclus bevatten de spuiten een een-op-een water-olie-emulsie waarbij de concentratie van het hypofyse-eiwit nu 10 mg/mL is. De emulsie is nu klaar voor gebruik. Om de kwaliteit van de emulsie te testen, wordt een druppel ervan in een bekerglas met water gedaan. Als de emulsie correct is bereid, blijft de druppel compact en strak aan het oppervlak.

Als de emulsie van slechte kwaliteit is, zal deze uitspreiden en splitsen in kleinere druppels. De emulsie wordt op de dag van bereiding geïnjecteerd in SJL-muizen om experimentele auto-immuunhypofysitis op te wekken. Dit protocol wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende jo of vertical.

Zodra de hypofyse is verzameld en de technieken worden beheerst, kan de proteïne-instructie in één uur worden uitgevoerd, waarbij dient te worden onthouden dat er snel en op ijs gewerkt moet worden. Tijdens deze stap, tijdens de bereiding van de immersie, wat ongeveer één uur in beslag neemt. Denk eraan om langzaam en geduldig te werken in de initiële mengfase na de ontwikkeling.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van autoimmuniteit om de mechanismen te onderzoeken waarlangs autoreactieve lymfocyten het doelorgaan herkennen en infiltreren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een eiwitextract van de hypofyse van muizen bereidt en hoe u dit mengt met Complete Freund's adjuvans om een emulsie te maken die klaar is voor gebruik als immunogeen. Vergeet niet dat het werken met spuiten en Complete Freund's adjuvans, dat geïnactiveerde en gedroogde Mycobacterium tuberculosis bevat, gevaarlijk kan zijn als u zichzelf per ongeluk prikt.

Gebruik daarom altijd handschoenen en voer de naalden op de juiste wijze af tijdens het uitvoeren van deze procedure.