Name: Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer hoe muizenhypofyse-eiwitten worden geïsoleerd en gehomogeniseerd voor onderzoek naar auto-immuun hypophysitis. Dit protocol omvat centrifugatie, BCA-bepaling en emulsiebereiding met adjuvans.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​DK080351 naar de PC.

Experimentele Protocol De eerste stap in deze experimentele protocol is het verzamelen van een groot aantal van de muis hypofyse. De tweede stap is om de klieren homogeniseren om een ​​proteïne-extract te bereiden. De derde stap is om deze eiwitten emulgeren met een vette mix. Stap 1: Verzameling en opslag van de muis hypofyse klieren De muis hypofyse zit aan de basis van de schedel in een depressie van het sphenoïd bot genaamd de sella turcica, zijdelings omgeven door de nervus zenuwen en naar voren door de optische chiasma. De klier bestaat uit een grotere voorkwab en kleinere posterior en intermediair lobben, en weegt gemiddeld 1,9 mg. Hypofyse worden verzameld van muizen van gemengde stammen, geslachten en leeftijden, bestemd om te worden gedood door het dier zorginstelling. Het isoleren van de hypofyse, wordt de muis gedood, de huid boven ontleed de schedel, en de schedel bot opengesneden met een schaar. De hersenen zijn opgeheven om de hypofyse, die vervolgens wordt geïsoleerd van de omringende dura mater bloot te leggen, schepte uit de sphenoïd bot en opgeslagen in een plastic buisje op droog ijs. In het algemeen gebruiken we 300 muis hypofyse voor een eiwit voorbereiding, een aantal dat kan worden verzameld door een persoon in 9 uur. Zodra de collectie is voltooid, wordt de buis met de hypofyse opgeslagen bij -80 ° C tot klaar voor de volgende stap. Stap 2. Extractie van de muis hypofyse eiwitten <ol><li> Voeg de homogenisering buffer om een ​​15 ml Falcon buis (catalogus geen 352.059), bewaard in een ijsbad, met behulp van 250 ul buffer voor elke 100 verzamelde hypofyse. Gebruik een buffer van ionische sterkte vergelijkbaar met degene die is fysiologisch aanwezig is in het cytoplasma van de cel (0,2 M) en van de fysiologische pH (7.4). We maken gebruik van fosfaat gebufferde zoutoplossing (0,161 M, pH 7,4), aangevuld met een proteaseremmer cocktail (Sigma-Aldrich, catalogus geen P8340-1 ml). </li><li> Voeg de hypofyse om de buffer vlak voor homogenisering en plaats van de generator (5-mm diameter) van de Polytron homogenisator op de bodem van de Falcon buis. Homogeniseren op maximum toerental gedurende 30 seconden voorzichtig het verplaatsen van de Falcon buis op en neer terwijl het in het ijsbad. Dan rest de homogenaat op ijs gedurende 1 minuut. Herhaal de homogenisering en koeling stappen nog twee keer. Deze zachte homogenisering zou breken van de cellen en laat cytosolische eiwitten zonder verstoring van de kernen. </li><li> Voor het verwijderen van kernen, ononderbroken weefsel en onoplosbare materialen (zoals bindweefsel en gedenatureerd eiwit-complexen), centrifuge de homogenaat bij lage snelheid (1000g) gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Breng het supernatans (nu genoemd Post-Nuclear supernatant, PNS) om een ​​nieuw Falcon buis, zorg om te vertrekken van de pellet ongestoord, en opslaan van de PNS op het ijs. </li><li> Resuspendeer de pellet in het oorspronkelijke volume van homogenisering buffer (250 ul buffer voor elke 100 verzamelde hypofyse), meng zoals hierboven, centrifuge zoals hierboven, en deze vervolgens samen de tweede PNS met de eerste. </li><li> Aliquot de twee samengevoegde PNS monsters in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C tot aan de volgende stap. Dit eiwit preparaat kan worden opgeslagen bij -80 ° C, maar langzamerhand verliest zijn kracht, dus we raden om het te gebruiken binnen 6 maanden na de voorbereiding. Gebruik een kleine hoeveelheid aan het eiwit opbrengst en concentratie door de BCA assay (Pierce catalogus zonder. 23.225) en het eiwit kwaliteit door gelelektroforese te bepalen. In het algemeen krijgen we ongeveer 60 mg van het eiwit van 300 muis hypofyse in 1,5 ml van homogenisering buffer, bij een concentratie ongeveer 40 mg / ml. </li></ol> Stap 3. Voorbereiding van de emulsie voor immunisatie <ol><li> Ontdooi snel de bevroren eiwit fracties die nodig zijn voor het experiment en stel de eiwit concentratie tot 20 mg / ml. Dit eiwit extract wordt geëmulgeerd 1:1 met Compleet Freund&#39;s adjuvans (CFA, Sigma F-5881) met 5 mg / ml van de warmte gedode Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141). Elke muis krijgt 1 mg van de hypofyse-extract in 100 ul van de emulsie. </li><li> Het voorbeeld dat hier gegeven wordt voor het immuniseren 10 muizen, waarbij elke muis zal worden geïnjecteerd met 100 pi van de emulsie met 1 mg van de hypofyse eiwitten. Laat twee extra muizen voor materiële schade tijdens de voorbereiding, dus gebruik 12 mg van de hypofyse eiwitten. Aspire 600 pi van de 20 mg / ml hypofyse eiwitextract beschrijven boven met behulp van een 2,5 mL Hamilton gasdicht spuit. Resuspendeer de CFA door schudden, en streven 600 pi van de CFA in de andere 2,5 ml Hamilton spuit. Hechten en zorgen voor een 22-gauge micro-emulgerende naald aan de spuit gevuld met CFA. Duw de zuiger langzaam van de CFA spuit zodanig dat de naald is gevuld met CFA, bevestig vervolgens en zet de andere uiteinde vande naald aan de spuit vol met hypofyse-extract. </li><li> Duw de zuiger van de CFA spuit om de olie component duwen in de waterige hypofyse-extract, zodanig dat slechts een kleine hoeveelheid wordt gemengd. Duw de zuiger van de hypofyse extract spuit in de CFA spuit. Herhaal deze handeling geleidelijk verhogen van de hoeveelheid materiaal gemengd. Ga verder tot de gehele inhoud van de twee spuiten worden gemengd. U krijgt een witachtige en gelijkmatig verdeeld oplossing die de water-in-olie emulsie vertegenwoordigt. </li><li> Nadat de emulsie is gevormd, herhaalt u de heen-en-weer gaande beweging van ten minste 500 keer om ervoor te zorgen de emulsie wordt grondig gemengd. Na de laatste mengen cyclus, de 1:1 water-in-olie emulsie is klaar voor gebruik en bevat een hypofyse eiwit concentratie van 10 mg / ml. De emulsie zal worden geïnjecteerd op dezelfde dag subcutaan in verdoofde SJL muizen, zoals beschreven in de metgezel Jupiter artikel. </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

Ondanks het feit dat de eerste patiënt met een auto-hypophysitis werd gemeld in 1962 vier, de pathogene hypofyse autoantigenen nog moeten worden geïdentificeerd 5. Diermodellen kan heel nuttig zijn om deze autoantigenen identificeren, medeplichtigheid aan de ontdekking van biomarkers die vertaalbaar zijn naar de patiëntenzorg. Dit artikel heeft aangetoond een eenvoudige procedure voor het bereiden van hypofyse eiwitten in een vorm die geschikt is voor het induceren van auto-immune hypophysitis bij ...

<table><tbody><tr><td>15-ml Falcon-buisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homogenisatiebuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteaseremmercocktail</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenisator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA-assay</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Complete Freund&amp;rsquo;s Adjuvans (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mL Hamilton gastichte spuit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22-gauge micro-emulgerende naald</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de muis hypofyse immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune hypophysitis

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Auto-immuun hypophysitis is een chronische ontsteking van de hypofyse veroorzaakt of vergezeld door auto-immuniteit 1. Het is van oudsher beschouwd als een zeldzame ziekte, maar de verslaglegging is sterk toegenomen in de afgelopen jaren. Hypophysitis, in feite, ontwikkelt zich niet zelden als een &quot;side-effect&quot; bij patiënten met kanker die behandeld worden met antilichamen die remmende receptoren tot expressie gebracht op T-lymfocyten, zoals CTLA-4 2 en PD-1-receptoren te blokkeren. Auto-immune hypophysitis kan experimenteel worden veroorzaakt door het injecteren van muizen met hypofyse eiwitten gemengd met een adjuvans 3. In deze video artikel zullen we laten zien hoe eiwitten uit de muis hypofyse en hoe u hen voor te bereiden in een vorm die geschikt is voor het induceren van auto-immune hypophysitis in SJL muizen extract.

Auto-immune hypophysitis kan worden gereproduceerd bij muizen door het injecteren van een uittreksel van de muis hypofyse eiwitten.

Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis

Auto-immuun hypofysitis is een chronische ontsteking van de hypofyse die wordt veroorzaakt door of gepaard gaat met auto-immuniteit1. Traditioneel werd het beschouwd als een ...

Auto-immuun hypofyisitis wordt gekenmerkt door een vergroting van de hypofyse en een tekort aan één of meer hypofysehormonen. De veroorzakende autoantigenen blijven onbekend. Hier wordt een protocol gedemonstreerd voor het prepareren van eiwitten uit de hypofyse van muizen voor gebruik bij het bestuderen van deze ziekte.Eerst worden de hypofysen geïsoleerd uit geëuthanaseerde muizen. De hypofysen worden vervolgens gehomogeniseerd om de cellen mechanisch af te breken en cytosolische eiwitten vrij te maken. Het homogenaat wordt geklaard door middel van centrifugatie bij lage snelheid en beoordeeld op kwantiteit via een colorimetrische BCA-assay en op kwaliteit via polyacrylamidegelelektroforese.Ten slotte wordt het waterige eiwithomogenaat gemengd met een oliehoudend adjuvans. Dit mengsel wordt vervolgens in muizen geïnjecteerd om een muismodel te creëren dat lijkt op auto-immuun hypofysitis. Zoals getoond in de begeleidende video, zijn er vier technieken beschreven om hypofysitis bij proefdieren op te wekken.De in dit artikel gepresenteerde techniek, namelijk de injectie van een mengsel van hypofyse-eiwitten als influenzajuvans, is de oudste methode en stamt uit de jaren 1960. Ander

preparation-mouse-pituitary-immunogen-for-induction-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video laat zien hoe u auto-immune hypophysitis induceren in SJL muizen en hoe u de ernst ervan te beoordelen door de histopathologie.

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

This video demonstrates an efficient homogenization technique to generate an antigen-adjuvant emulsion to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in a murine model. The emulsion contains an autoantigen — myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) — in the water phase, surrounded by a continuous oil phase comprising an inactivated pathogenic bacteria. The emulsion ensures a sustained release of antigens for a prolonged immune response.

Preparing an Antigen-Adjuvant Emulsion to Induce Autoimmune Encephalomyelitis

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

In dit rapport presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker een muismodel van intraoculaire uveïtis kan genereren. Meer algemeen aangeduid als experimentele auto-immune uveïtis (EAU), dit gevestigde model legt vele aspecten van de menselijke ziekte vast. Hierin zullen we beschrijven hoe de progressie van de ziekte kan worden geïnduceerd en gevolgd met behulp van verschillende uitlezingen.

Experimentele auto-immune uveïtis: een intraoculair inflammatoir muismodel

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Verschillende soorten diermodellen van Hashimoto's thyroiditis zijn vastgesteld, net als spontane auto-immune thyroiditis bij de NOD-muis. H-2h4-muizen zijn een eenvoudig en betrouwbaar model voor HT-inductie. Dit artikel beschrijft deze aanpak en evalueert het pathologische proces voor een beter begrip van het SAT-muizenmodel.

Generatie van een muis Spontane auto-immuun thyroiditis model

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis is een van de meest gebruikte muizenmodellen van multiple sclerose. In het huidige protocol worden C57BL/6J-muizen van beide geslachten geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide, wat voornamelijk resulteert in oplopende parese van de staart en ledematen. Hier bespreken we het protocol van EAE-inductie en -evaluatie.

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Leer hoe muizenhypofyse-eiwitten worden geïsoleerd en gehomogeniseerd voor onderzoek naar auto-immuun hypophysitis. Dit protocol omvat centrifugatie, BCA-bepaling en emulsiebereiding met adjuvans.

Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis

Meer video's verkennen