Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis

Autoimmuunhypofysitis wordt gekenmerkt door een vergroting van de hypofyse en een tekort aan een of meer hypofysehormonen. De veroorzakende autoantigenen zijn nog onbekend. Hier wordt een protocol gedemonstreerd voor het bereiden van eiwitten uit de muizenhypofyse voor gebruik bij het bestuderen van deze ziekte.

Eerst worden de hypofysen geïsoleerd uit geëuthanasieerde muizen. De hypofysen worden vervolgens gehomogeniseerd om de cellen mechanisch te breken en cytosolische eiwitten vrij te maken. De homogenaat wordt verduidelijkt door middel van centrifugatie met lage snelheid en de hoeveelheid wordt bepaald met behulp van een colorimetrische BCA-test en de kwaliteit wordt beoordeeld door polyacrylamidegelelektroforese.

Ten slotte wordt het eiwithomogenaat in water gemengd met een olieachtig adjuvant. Dit mengsel wordt vervolgens in muizen geïnjecteerd om een muismodel te creëren dat lijkt op autoimmuunhypofysitis. Zoals te zien is in de bijbehorende video, zijn er vier technieken beschreven om hypofysitis te induceren in proefdieren.

De techniek die in dit artikel wordt gepresenteerd, dat wil zeggen de injectie van een mix van hypofyse-eiwitten met influenza-adjuvant, is de oudste en dateert uit de jaren 1960. Andere benaderingen zijn de injectie van oplosbare glycoproteïnen van het rubellavirus in 1992, de stereotactische injectie van een adenovirus rechtstreeks in de hypofyse in 2002 en de transplantatie van een hypofyse van een rattenstam onder de niercapsule van een andere rattenstam in 2010. Het grote voordeel van de adjuvantaanpak van Florence is dat deze tegenwoordig minder invasief is, consistenter en vooral nauwkeuriger in het induceren van een ziekte die sterk lijkt op de menselijke tegenhanger.

Hoewel deze techniek al sinds de jaren 1960 wordt gerapporteerd, presteerde de buitenlandse adjuvanttechniek slecht voor het induceren van hypofysitis. Toen ik aan mijn promotieonderzoek begon, kon ik slechts matige voorbeelden en ernst van hypofysitis verkrijgen met behulp van het gepubliceerde buitenlandse adjuvantprotocol. De zaken verbeterden aanzienlijk toen ik het idee kreeg om de hoeveelheid pitu-eiwitten in de EM-emotiek tien keer te verhogen.

Hoewel deze methoden inzichten kunnen bieden in de pathogenese van autoimmuunhypofysitis, kunnen ze ook worden gebruikt om andere auto-immuunziekten te bestuderen waarvoor de auto-antigenen nog moeten worden geïdentificeerd. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methoden vooral worstelen met de laatste stap, de bereiding van de marge, omdat het handmatige vaardigheden, tijd en toewijding vereist. Visuele demonstratie is daarom van cruciaal belang om te begrijpen hoe een goede emulsie moet worden bereid.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit over het gebied van auto-immuniteit. Weten hoe je het antigeen moet bereiden voor immunisatie kan ook worden gebruikt voor de productie van monoklonale antilichamen of voor het testen van nieuwe vaccins. Het demonstreren van deze techniek zal S Zoo heroic Ura en Mayland al gato uit mijn laboratorium zijn.

De hypofyse van de muis is een cilindrische klier die zich aan de basis van de schedel bevindt in een verdieping van het sphenoidale bot, de terica. De klier wordt lateraal begrensd door de nervi trigemini en anterieur door het chiasma opticum. Het bestaat uit een grotere voorkwab en kleinere, intermediaire en achterste kwabben.

Gebruik schaar om de geëuthaniseerde muis te onthoofden en maak vervolgens evenwijdige sneden van achter naar voren in de schedel. Til de hersenen op en draai ze naar achteren om de hypofyse bloot te leggen, die eruitziet als een cilinder in de context van een gelijkbenige driehoek. Met de hypofyse als basis, de nervi trigemini als zijden en het chiasma opticum als toppunt.

Cirkelaar de klier met de punten van gesloten pincetten om de omringende meningea te breken. Pak vervolgens met behulp van fijne pincetten de hypofyse uit de cel van Turca en plaats deze in een plastic buisje op droog ijs. Verzamel voor één bereiding 300 muizenhypofysen.

Deze verzameling vereist ongeveer negen persoon-uren. Zodra de verzameling is voltooid, bewaar de hypofysen op minus 80 graden Celsius totdat ze nodig zijn. Plaats een Falcon-buisje van 15 milliliter in een ijsbad.

Voeg aan de buis 250 microliter homogenisatiebuffer toe. Voeg voor elke 100 verzamelde hypofysen vlak voor homogenisatie de muizenhypofysen toe aan de buffer. Plaats vervolgens de punt van de polytron-homogenisator met een diameter van vijf millimeter aan de onderkant van de Falcon-buis die de muizenhypofysen en buffer bevat en homogeniseer 30 seconden op maximale snelheid.

Beweeg de buis voorzichtig op en neer terwijl u deze op ijs houdt. Laat het homogenaat vervolgens een minuut op ijs rusten. Herhaal de homogenisatie- en koelstappen nog twee keer.

Deze zachte homogenisatie zou de cellen moeten breken en de eiwitten moeten vrijmaken zonder de kern te breken. Centrifugeer het homogenaat bij lage snelheid, ongeveer 1000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om de kernen, ongebroken weefsel en onoplosbare materialen zoals bindweefsel en gedenatureerde eiwitcomplexen te sedimenteren. Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.

Breng de SNA, nu postnucleair sataat of PNS genoemd, over naar een nieuwe Falcon-buis. Het PNS op ijs trekt de pellet terug met behulp van hetzelfde volume homogenisatiebuffer als voorheen, homogeniseert en centrifugeert zoals eerder. Na het samenvoegen van de twee PNS-monsters, wordt de oplossing in talrijke microcentrifugebuisjes geëlueerd.

Bewaar de microcentrifugebuisjes op minus 80 graden Celsius totdat ze nodig zijn. Deze eiwitbereiding is stabiel op minus 80 graden Celsius, maar verliest geleidelijk aan kracht. Daarom wordt aanbevolen om het binnen zes maanden na de bereiding te gebruiken.

Bewaar een kleine aliquot van PNS om de eiwitopbrengst en -concentratie te bepalen met behulp van de biy-zuurtest. Bepaal vervolgens de eiwitkwaliteit door middel van