Testen Protozoacidal Activiteit van Ligand-lytische Peptiden Against Protozoa Termite Gut In vitro (Protozoa Cultuur) en In vivo (Micro-injectie in Termite einddarm)

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen dat een gesynthetiseerd ligand specifiek bindt aan de cellulose-verterende protozoën in de darm van ondergrondse termieten van de soort form mosen, en dat het ligand gekoppeld aan een lytisch peptide deze protozoën doodt in vitro in een anaerobe protozoëncultuur en in vivo door injectie in de achterdarm van de termiet. Dit wordt bereikt door eerst de protozoën uit de darm van worker-termieten te extraheren onder anaerobe omstandigheden. De tweede stap van de procedure is het bevestigen van de binding van een fluorescent gekoppeld ligand aan de darmprotozoën van de termiet in vitro.

De derde stap van de procedure is om aan te tonen dat het ligand-gekoppelde lytische peptide termite-darmprotozoa in vitro doodt. De laatste stap van de procedure is het injecteren van fluorescentie-gekoppeld ligand en ligand-gekoppeld lytisch peptide in de achterdarm van de termiet om de binding aan en de vernietiging van darmprotozoa in vivo te bevestigen. Middels injecties van protozoa-culturen in de achterdarm van de termiet en fluorescentiemicroscopie tonen we aan dat een ligand dat is gekoppeld aan een lytisch peptide bindt aan en efficiënt termite-darmprotozoa doodt, zowel in vitro als in vivo.

De koppeling van het ligand aan het lytische peptide verhoogde de toxiciteit voor protozoa in vergelijking met het lytische peptide alleen. Hoewel het de toxiciteit voor niet-doelorganismen zoals e coli verminderde, zeer waarschijnlijk omdat het ligand niet bond aan het bacteriële celmembraan, leidt het verlies van protozoa tot de dood van de termieten in minder dan twee weken. De gepresenteerde techniek om LIG lytische peptiden te gebruiken om de symbiotische protozoa in de darm van ondergrondse termieten te doden, maakt deel uit van de inspanning om alternatieve technieken voor termietenbestrijding te ontwikkelen.

Termieten sterven wanneer zij minder afhankelijk zijn van chemicaliën zonder de symbionten in hun darmen. We extraheren protozoa uit de darm van de termiet om aan te tonen dat het ligand bindt aan de protozoa en dat het lytische peptide-ligand de protozoa doodt. Houtdeeltjes binnen de protozoa vertonen autofluorescentie. Daarom is het belangrijk om de resultaten van protozoa die behandeld zijn met het fluorescente ligand te vergelijken met de onbehandelde protozoa.

Om fout-positieven te voorkomen, injecteren we peptiden direct in de achterdarm, omdat de protease zich in de middendarm bevindt en de voordarm ze zou verteren als de peptiden aan de termieten worden gevoerd. Met behulp van phage display-bibliotheken van New England Bio Labs hebben we 19 hep-peptidensequenties geïdentificeerd die binden aan protozoa. We hebben gekozen voor een van de liganden met een peptidensequentie die gelijkenissen vertoonde met vermeende glycoproteïnen die bekend zijn van het membraan van Trypanosoma brucei.

Na de peptidesynthese hebben we het gesynthetiseerde peptide via een peptide-synthese in vaste fase, gebruikmakend van E-D-A-N-S novatech-hars, gekoppeld aan een fluorescerende probe aan de C-terminus om de lytische eigenschappen van peptideconjugaten te beoordelen. In deze procedure maken we gebruik van een conjugaat van het gesynthetiseerde ligand en het lytische peptide ate, dat één dag vóór de experimenten was gesynthetiseerd in de LSU-proteinfaciliteit. Gebruik sigma coat voor alle gebruikte materialen om adsorptie van protozoa of peptiden aan oppervlakken te voorkomen.

Breng een gelijkmatige laag aan en laat deze een nacht drogen voordat het de volgende dag wordt gebruikt. Bereid een ventilatorbox in een glovebox voor om de lucht bij kamertemperatuur constant te laten circuleren door een droogmiddel en type D katalysatorstapelpacks om de luchtvochtigheid en het zuurstofgehalte gedurende meer dan één uur te verlagen. Vul de glovebox gedurende 20 tot 30 minuten met een continue stroom stikstof en gebruik indien nodig extra stikstof om anaerobe condities te handhaven.

Bereid vervolgens Traeger U-medium voor en stel de pH in op zeven. Filter het gesteriliseerde medium in de glovebox via een 200 µL tip die is verbonden met een buis met een mengsel van 2,5% waterstof, 5% kooldioxide en 92,5% stikstof gedurende één uur om zuurstofresten in de glovebox te verwijderen. Zodra de materialen gereed zijn, gebruik dan een pincet om een termietwerker uit een Petrischaal te halen en dompel het hele lichaam voorzichtig in een bekerglas gevuld met 70% ethanol, terwijl de termiet ongeveer 10 seconden met het pincet wordt vastgehouden. Om oppervlakteverontreinigingen te verwijderen, haal je de werker uit de ethanol en laat je deze ongeveer 20 seconden drogen op een schone Kimwipe.

Bereid in de glovebox een gesilicatiseerde objectglas voor met 100 µL Trager U-medium voor het opvangen van het termite-darmkanaal en een buisje met 900 µL Trager U-medium voor het opvangen van protozoa. Houd vervolgens met een dissectiemicroscoop en een steriele fijne pincet het abdomen van de worker vast en pak de punt van het abdomen met een andere pincet om het darmkanaal voorzichtig in een hoek van 45 graden omhoog of omlaag te trekken. Probeer vier darmkanalen te verzamelen waarbij de midgut en hindgut in één stuk blijven. Plaats de termite-darmkanalen in een druppel van 100 µL Trager U-medium op een objectglas.

Ga door naar de volgende dia. Doorboor de achterdarmen met een paar steriele fijne dissectieprikkers om de protozoa vrij te maken en breng de darminhoud voorzichtig over met een 200 µL pipette in een microcentrifugebuisje van 1 mL met 900 µL Traeger medium. Wacht vijf seconden tot de fragmenten van de darmwand zijn bezonken en breng 900 µL van het supernatant over naar een nieuw buisje. Breng 10 µL van de protozoa-cultuur over naar een sigma-gecoate microscoopdia.

Plaats het preparaat en controleer de conditie van de protozoën onder een microscoop bij een vergroting van 200 keer. Bereid direct na ontvangst van de protozoën controleculturen voor van aerobe protozoën, tetra piriformis, amoeba, ug, gleaner en paramecium, evenals een overnight-cultuur van e coli in het door de leverancier aanbevolen kweekmedium. Fixeer de protozoën uit de termietentermidarm, alle overige protozoöen-controles en e coli met 10% formaldehyde gedurende 12 uur bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de protozoënenoplossing bij 30 ×g gedurende 10 minuten.

Gooi het supernatant weg en was het pellet met de gefixeerde protozoa tweemaal met één milliliter Trager U media reus, resuspendeer het pellet in één milliliter Traeger Edia en incubeer de gefixeerde micro-organismen gedurende één tot twee uur met 100 µL van een oplossing van gesynthetiseerde ligand gekoppeld aan de fluorescerende kleurstof E-D-A-N-S, met een uiteindelijke concentratie van 50 µM ligand opgelost in water. Observeer de met liganden behandelde micro-organismen en onbehandelde controles onder een fluorescentiemicroscoop bij 400-maal vergroting bij een absorptiemaximum van 341 nm en een emissie in het blauwe gebied bij 471 nm.

Om de lytische eigenschappen van het ligand-geconjugeerde peptide te beoordelen, pipetteer zes aliquots van 198 µL protozoëncultuur, bereid zoals beschreven in sectie drie, in 0,5 mL Eppendorf-buisjes. Voeg twee µL van een 100 µM oplossing van een ligand-lytisch peptide toe aan de helft van de aliquots van de termieten Darm-protozoëncultuur. Voeg voor een eindconcentratie van 1 µM twee µL steriel water toe als controle aan de andere helft van de aliquots.

Breng na één uur 10 µL van elke protozoënkweek over op een objectglas. Vergelijk onder een microscoop bij een vergroting van 200× de overleving van protozoën behandeld met ligand-geconjugeerde lytische peptiden met die van de controles. Trek naalden met een NGI PC 10 micropipet-puller met een tweetraps verwarmingsniveau. Om een puntgrootte van 20 tot 30 µm te verkrijgen, dient de puntgrootte te worden bevestigd door deze onder een microscoop te meten.

Vul met behulp van een micrometer één naald met ongeveer 30 µL van een 50 µM fluorescent gemarkeerd ligand gesuspendeerd in water. Vul met een aangekoppelde spuit een andere naald met water voor de controle. Bevestig een micropipet aan een houder en een micromanipulator. Bevestig een naald aan de houder van het injectiesysteem in een tweede micromanipulator.

Stel de initiële injectieparameters in op een impulslengte van ongeveer één seconde en een injectiedruk van 10 tot 12 PSI. Voer vervolgens de naald langzaam in de micropipet in en injecteer de oplossing met behulp van een voetpedaal na de injectie. Verwijder de micropipet en noteer de lengte van de geïnjecteerde oplossing.

Bereken met een schuifmaat het geïnjecteerde volume op basis van de bekende parameters van de micropipet en stel de druk en pulslengte in om 0,3 µL oplossing uit te stoten. Bereid vervolgens 20 termieten per behandeling voor op injectie. Knijp eerst met een zachte pincet het uiteinde van het abdomen samen om eventuele uitscheiding in het rectum te verwijderen.

Immobiliseer vervolgens de termietenarbeiders door ze vijf minuten op ijs te koelen totdat ze geïmmobiliseerd zijn. Maak opvangbakjes voor de termietenarbeiders door 100 µL pipetpunten af te knippen. Snijd met een scalpelblad de punt tot een lengte van 10 tot 12 mm, pas deze aan op de grootte van de termieten en plaats ze in een vial.

Bevestig de ontvanger met een schroefdop aan de micromanipulator. Plaats een worker op een Petri-schaal op de rugzijde en aspireer de worker met het hoofd eerst in de ontvanger met behulp van een stikstofzuigpomp, zodat het uiteinde van de worker uit de ontvanger steekt. Terwijl de termiet voorzichtig in de ontvanger wordt vastgehouden, wordt de gevulde naald met de micromanipulator naar voren bewogen om deze in de anus van de worker in te brengen. Injecteer 0,3 µL van het fluorescentiegemarkeerde ligand of water als controle.

Plaats de werkers die zijn geïnjecteerd met ligand of water in afzonderlijke Petrischalen met vochtig filterpapier en houd ze gedurende de nacht bij 26 degrees Celsius met 78% relative humidity. Extubeer na 24 uur de darmen van de geïnjecteerde termieten en verzamel de protozoa zoals eerder beschreven. Observeer de ligandbinding in protozoa van geïnjecteerde termieten met fluorescentiemicroscopie om de lytische eigenschappen van ligand-geconjugeerde lytische peptiden in levende termieten te beoordelen.

Bereid de injectiematerialen, apparatuur en termieten voor zoals eerder gedaan voor injecties en injecteer 0,3 µL van een 500 µM ligand lytisch peptide-oplossing of water als controle in de achterdarm van 20 termietenwerksters. Na 24 uur worden de darmen van verschillende werksters uitgenomen en wordt de darminhoud onder de microscoop bij een vergroting van 200x geobserveerd, zodra de dood van alle protozoa in de darm van de behandelde termiet is bevestigd. Bewaar de resterende behandelde termieten en controles in petrischalen met vochtig filterpapier en observeer de mortaliteit dagelijks. We bevestigen dat het ligand, gekoppeld aan een fluorescente probe, bindt aan alle drie de soorten protozoa: p. grassi, h. heartmani en s. la.

Uit de achterdarm van vier ondergrondse termieten van de soort Mosson werden detecteerbare dichtheden aangetroffen; ligandbinding vindt plaats op het gehele celoppervlak en is geconcentreerd in de anterieure regio van de protozoa op de as, nog steeds een vel microtubuli en de nucleus MP grass eye. We detecteerden ook fluorescentie in alle geteste vrijlevende aerobe protozoasoorten, wat suggereert dat het ligand bindt aan structuren die generiek zijn voor protozoa. Hoewel er geen ligandbinding werd waargenomen voor e coli, doodde één micromolair ligand lytisch peptide alle drie de protozoasoorten uit de darm van omo en ondergrondse termietenarbeiders, alsofook de vrijlevende tea piriformis in vitro in minder dan 10 minuten, terwijl de controle levend bleef.

Deze afbeelding toont het progressieve verlies van membraanintegriteit van protozoa uit de termietendarm die zijn behandeld met een ligand-lytisch peptide. Er werd geen verschil waargenomen in het aantal E. coli-kolonies tussen de behandelingen met het ligand-lytisch peptide en water. Het lytisch peptide zonder ligand verminderde het aantal E. coli-kolonies echter aanzienlijk. Dit suggereert dat het koppelen van een ligand aan het lytisch peptide in zekere mate niet-doelwitmicro-organismen beschermt tegen lysis. Injectie van 0.3 µL 500 µM ligand-lytisch peptide doodde alle drie de soorten protozoa in de darm van zowel boven- als ondergrondse termieten binnen 24 uur, en de termieten stierven na 10 dagen nadat het ligand-gekoppelde lytisch peptide was geïnjecteerd.

Protozoa en termieten stierven drie keer sneller dan wanneer niet-ligandgeconjugeerde lytische peptiden werden geïnjecteerd, zoals aangetoond in husen en Colia 2009, wat suggereert dat het ligand de cydale efficiëntie van lytische peptiden bij protozoa onder optimale kweekcondities verhoogt. Alle drie de proa-soorten die uit de darm van Omo. subterranean termieten zijn geëxtraheerd, moeten gedurende ten minste drie dagen in leven en gezond blijven.

Echter, als er zuurstofresiduen in het medium achterblijven, stopt de beweging van de protozoa onmiddellijk. Als het verkeerde medium wordt gebruikt en de osmotische druk in de cellen te hoog wordt, zwellen de membranen van de protozoa op en knappen de protozoa. Als de osmotische druk in de cellen te laag wordt of de membranen zijn beschadigd, rimpelen de protozoa en krimpen ze. Het fixeren van protozoa maakt het gemakkelijker om de binding van fluorescent gekoppelde liganden aan de protozoa te detecteren.

Het is moeilijk om fluorescentie te detecteren en te onderscheiden van de autofluorescentie van houtdeeltjes wanneer de protozoën vrij bewegen. Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen er met hulp van een assistent ongeveer 30 termieten per uur worden geïnjecteerd. Hoewel het ligand colitisch peptide is ontwikkeld om protosome symbiose in de darm van ondergrondse termieten te doden en dus voor termietenbestrijding, zou het ook nuttig kunnen zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen protosome parasieten zoals slash mania, ponoma, te en odium, die vele ziekten bij mensen veroorzaken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u protozoa die uit de termietendarm zijn geëxtraheerd in cultuur kunt verkrijgen en behouden, hoe u de specifieke binding van een ligand aan protozoa via fluorescentiemicroscopie kunt aantonen en hoe u de proto-suïcidewerking van het ligand colitisch peptide in vitro kunt demonstreren. En tot slot hoe u peptiden in de termietendarm kunt injecteren voor in vivo bevestiging.