Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën

Deze video demonstreert een procedure voor het in beeld brengen van corneale C-vezels met behulp van de niet-invasieve techniek van corneale confocale microscopie (CCM), waarmee kwantificering van zenuwvezelschade mogelijk is. Eerst wordt het brandvlak van de lens op de CCM ingesteld en wordt er visco tear gel op de lens aangebracht voordat de wegwerpkap wordt geplaatst. Vervolgens worden anesthetische druppels en visco tear gel in het oog aangebracht.

Vervolgens wordt de camera zo afgesteld dat de gel aan de voorzijde van de lens contact maakt met het hoornvlies van de patiënt. Ten slotte wordt de diepte van het brandvlak aangepast en worden er beelden van de cornea-zenuwen uit het centrale deel van de laag van Bowman vastgelegd. Morfologische veranderingen in de cornea-zenuwvezels kunnen worden waargenomen om neuropathie te kwantificeren.

Dit is een zeer innovatieve techniek die oorspronkelijk is gebruikt in de wereld van de optometrie en de oogheelkunde, maar gedurende de afgelopen acht jaar hebben wij deze zeer effectief ingezet om diabetische neuropathie en andere perifere neuropathieën te bestuderen en te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om schade aan kleine zenuwvezels in een zeer vroeg stadium te kwantificeren en vervolgens de ernst van de neuropathie bij patiënten volledig non-invasief te stratificeren. Dit kan zeer snel gebeuren met een scan van twee minuten, die vervolgens kan worden gekwantificeerd op basis van de ernst van de neuropathie; we hopen daarom dat dit enkele andere, veel invasievere technieken, zoals huidbiopten en zenuwbiopten, zal vervangen. Hoewel het in het algemeen een eenvoudige techniek lijkt, vereist het in werkelijkheid specifieke stappen om het beeld optimaal vast te leggen en vervolgens te kwantificeren.

We willen dit gehele proces duidelijk en begrijpelijk maken voor iedereen die deze techniek wil gebruiken. De eerste stap bij onderzoek met de HRT corneaal confocale microscoop is de voorbereiding van de lenspunt van het objectief bij de objectiefbuis van de laser-scanningcamera. Stel de refractie in op plus 12 dioptrieën, breng vervolgens de camera naar de laagste positie en vergrendel de lens door deze tegen de klok in te draaien.

Breng een grote, homogene en belvrije druppel visco tears van P-grootte aan op de lenstip. Verwijder een tomo-cap uit de steriele verpakking en plaats deze over de lenstip, zo ver mogelijk over de houder, zodat de gel een meniscus vormt tussen de objectieflens en de cap. Let erop dat u tijdens het plaatsen het vooroppervlak van de tomo-cap niet aanraakt.

Verplaats nu de laserscankamera op de camerahouder zo ver mogelijk naar achteren richting het binnen- en buitenoppervlak van de tomo-cap. Beide oppervlakken verschijnen als een heldere laserreflectie op de beeldschermmonitor. Draai aan het instelwiel voor het brandvlak totdat een heldere reflectie zichtbaar is, wat aangeeft dat de lens is scherpgesteld op de voorzijde van de cap.

De dieptewaarde die wordt weergegeven in het display van de focuspositie moet nu tussen minus 150 micrometers en plus 150 micrometers liggen. Zet de diepte-instelling terug naar nul. Laten we nu kijken hoe de patiënt moet worden voorbereid.

Nadat de ogen van de proefpersoon zijn verdoofd met een druppel 0,4% tetracaine hydrochloride, wordt het voorvlak van het oog gesmeerd met viscotranen. Plaats de proefpersoon comfortabel met de kin op de kinsteun, waarbij wordt gecontroleerd of het voorhoofd stevig tegen de voorhoofdssteun is gedrukt. Het onderzoek wordt vergemakkelijkt door de patiënt te instrueren om te fixeren op het externe fixatielicht.

Omdat het oog dat niet wordt onderzocht vrij blijft, zorgt de compacte afmeting van de microscoopkop ervoor dat het contralaterale oog van het subject niet wordt belemmerd. Dit maakt het gebruik van afstandstargets mogelijk. Positioneer de CCD-camera zodanig dat de optische as loodrecht staat op de optische as van de laser-scanningcamera.

De camera moet zich aan de rechterkant van de patiënt bevinden bij het beeldvormen van het rechteroog en vice versa. In deze positie is het voorvlak van de tomo-cap zichtbaar in het centrum van de CCD-camera. Live-beeld.

Beweeg de laser-scancamera naar de patiënt toe totdat het hoornvlies van de patiënt zich op een afstand van ongeveer vijf tot 10 millimeter van de tomo-cap bevindt. Gebruik vervolgens de verticale en horizontale afstelknoppen op de camerahouder om de laser-scancamera omhoog en omlaag en naar links en rechts te bewegen totdat de tomo-cap in het midden van het hoornvlies van de patiënt is gepositioneerd. Vraag de patiënt nu om de ogen zo wijd mogelijk te openen.

Beweeg de laser-scanningscamera langzaam naar de patiënt toe totdat de tomo-cap het hoornvlies van de patiënt raakt. Controleer in dit stadium of het rode laserlicht zich in het centrum van het hoornvlies bevindt en of de reflectie van de laserstraal vanaf het hoornvlies precies op de anterieure pool van het hoornvlies plaatsvindt. Bij een optimale afstelling is er minimaal contact tussen de lens en het hoornvlies.

Op het live-beeld van de CCD-camera is een dunne gelbrug tussen de tomo-cap en het hoornvlies zichtbaar. Als er te veel druk tussen de tomo-cap en het hoornvlies staat, vertoont het hoornvlies een afgeplatte aanblik via de CCD-camera. Het live-beeld en de strooilichtreflecties zijn zichtbaar op het CCM-beeld.

Nadat de patiënt is gepositioneerd, schakelt u de HR three laser camera in, waarna het venster voor beeldacquisitie op het scherm verschijnt. Gebruik het CCD-beeld om de tomo-cap en het laserlicht op het hoornvlies van de patiënt te positioneren. De CCM biedt drie opties voor het vastleggen van beelden.

Met de sequentiescan kunnen tot 100 beelden worden vastgelegd met een instelbare beeldsnelheid. Er wordt een beeldsnelheid tussen 30 en één beeld per seconde geselecteerd. Op basis hiervan kan een film worden opgenomen met een duur van drie tot 100 seconden.

In de volumenscanmodus legt de camera automatisch een reeks van 40 beelden vast op opeenvolgende brandvlakken. Er kan een totale diepte van 85 micrometers worden gescand, waarbij de brandpuntsafstand tussen twee opeenvolgende beelden ongeveer 2,1 micrometers bedraagt. De laatste optie is de sectiemodus, die voor dit experiment zal worden gebruikt.

Deze modus maakt optimale beeldvorming mogelijk, waarbij telkens wanneer de voetbediening wordt ingedrukt, heldere enkelvoudige beelden worden vastgelegd en opgeslagen. Deze modus wordt gebruikt voor het vastleggen van beelden van de gehele cornea-laag, inclusief de laag van Bowman in het centrum van de cornea. Nadat er een voldoende aantal beelden is vastgelegd, kunnen andere modi worden gebruikt, waaronder sequentie- en volumemodi.

Na enkele scans kan het brandvlak van de lens worden gewijzigd om de diepte van een hoornvliescellaag ten opzichte van het hoornvliesoppervlak te meten door de epitheellaag in focus te brengen en vervolgens op de resetknop te klikken om de dieptewaarde op nul te zetten. Nadat het onderzoek is voltooid, schakelt u de camera uit door op de aan/uitknop van de camera in het acquisitievenster te klikken. Wijs de patiënt erop dat hij of zij de ogen niet mag wrijven totdat de lokale anesthesie is uitgewerkt.

Verwijder de tomo-cap van de camera, gooi deze weg en reinig vervolgens de microscooplens met een wattenstaafje dat is bevochtigd met gedestilleerd water. Laten we nu bekijken hoe een beeld wordt geanalyseerd en zenuwvezelparameters worden gekwantificeerd om bestaande onderzoeken te beoordelen en te analyseren. Selecteer eerst het juiste patiëntendossier in het databasevenster.

Het venster voor beeldweergave biedt een overzicht van de bestaande cornea-onderzoeken voor de geselecteerde patiënt. Onderzoeken die op verschillende dagen zijn uitgevoerd, worden bewaard in afzonderlijke bezoektabbladen. De drie verschillende scantypen worden weergegeven door drie verschillende iconen. In het HRT three cornea bezoektabblad van het venster voor beeldweergave van de Heidelberg Eye Explorer.

Om de afbeelding van het hoornvlies te inspecteren, dubbelklikt u op het betreffende afbeeldingsicoon en drukt u vervolgens op 'show now' om de juiste afbeeldingen voor verdere analyse te exporteren; klik op 'export' in de werkbalk en selecteer daarna de map waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Aangezien de hoofdfocus van dit onderzoek ligt op de laag van Bowman en de hoornvlieszenuwen, worden alleen de afbeeldingen van deze laag geanalyseerd. Voor elk subject worden vijf tot zes frames van de laag van Bowman geselecteerd op verschillende diepten van het hoornvlies.

Beeldanalyse wordt uitgevoerd met gespecialiseerde software die door onze groep is ontwikkeld, genaamd CCM Image Analysis Tools, versie 0.64. Met de software worden de belangrijkste parameters voor hoornvlieszenuwen gemeten: de zenuwvezeldichtheid, die wordt gedefinieerd als het aantal hoofdzenuwen per frame, en de zenuwtakdichtheid, wat het totale aantal hoofdtakken per frame is.

De zenuwvezellengte is de totale lengte van de hoofdzenuwen en de belangrijkste vertakkingen per frame zenuwvezel. Tortuositeit is de kronkeligheid van de hoofdzenuwen per frame. Om een CCM-afbeelding te openen, gaat u naar het bestand en selecteert u openen.

Zodra de afbeelding is geladen, worden de grootte en het type weergegeven in het informatievenster voor afbeeldingen aan de linkerbovenzijde van het bedieningspaneel; de standaard schaal wordt weergegeven in de bewerkingsregel van de afbeeldingsinformatie. Indien de schaal afwijkt, kan het getal in de bewerkingsregel worden gewijzigd. Om de analyse van de afbeelding te starten, selecteert u de te meten parameter uit het metriekvak aan de rechterbovenzijde van het bedieningspaneel.

In het resultatenvak onderaan de pagina worden NFD en MBD weergegeven als een feitelijk getal. NFL wordt weergegeven in millimeters en de tortuositeit als een tortuositeitscoëfficiënt. De resultaten kunnen worden geëxporteerd naar een Excel-blad.

Wanneer u de Excel-pagina opent, worden de resultaten weergegeven in aantal per vierkante millimeter voor NFD, millimeters per vierkante millimeter voor NFL en de tortuositeitscoëfficiënt voor NFT. Om deze metingen uit te voeren, begint u met het markeren van elke hoofdzenuw, waarna u elke hoofdzenuwtak markeert. Traceer tot slot elke zenuw in het frame.

Een digitale pen kan worden gebruikt voor een betere nauwkeurigheid. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in een minuut worden uitgevoerd mits de procedure correct wordt nageleefd. Het is belangrijk om de gedetailleerde instructies op te volgen.

Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed begrip heeft van hoe u beelden vastlegt van de bewegingslaag van het hoornvlies met behulp van corneale confocale microscopie, en hoe u deze beelden kwantificeert en analyseert bij patiënten met perifere neuropathie, in het bijzonder diabetische neuropathie. Vergeet niet dat werken met CCM expertise vereist en dat is geadviseerd dat professionals die zijn opgeleid in oogonderzoek de procedure uitvoeren.