Name: Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Leer corneale confocale microscopie voor niet-invasieve kwantificering van zenuwvezelbeschadiging bij perifere neuropathieën. Deze methode maakt vroege diagnose en stratificatie van neuropathische ernst mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Juvenile Diabetes Research Foundation International (subsidie ​​17-2008-1031) en de National Institutes of Health (subsidie ​​1R01DK077903-01A1).

Inleiding: De nauwkeurige kwantificering van perifere neuropathie is van belang om te definiëren op risicopatiënten, anticiperen op achteruitgang, en beoordelen van nieuwe therapieën. Conventionele methoden te bepalen neurologische tekorten en electrofysiologie en kwantitatieve sensorische tests kwantificeert functionele veranderingen op te sporen neuropathie. Echter, de eerste schade lijkt te zijn aan de kleine vezels en toch deze tests in de eerste plaats te beoordelen grote vezels dysfunctie en hebben een beperkte capaciteit om regeneratie en reparatie aan te tonen. De enige technieken die een rechtstreeks onderzoek van de niet-gemyeliniseerde zenuwvezel schade en herstel mogelijk zijn Sural zenuw biopsie met elektronenmicroscopie en huid-punch biopsie. Echter, beide zijn invasieve procedures en vereisen langdurige laboratorium procedures en aanzienlijke expertise. Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die in-vivo beeldvorming van het hoornvlies zenuwvezels biedt. HRT III-Rostock hoornvlies Module (RCM) Handleiding van operatie 1. Voorbereiding van de Camera De eerste stap in het onderzoek gebruik van HST is de voorbereiding van het objectief tip. <ol><li> Eerst op het doel buis van de laser scanning camera, zet de breking tot +12 dioptrie en pas vervolgens de camera naar de laagste stand. </li><li> Breng een grote homogene, bel gratis, erwt grootte, drop van Viscotears op de lens tip. </li><li> Verwijder een TomoCap uit de steriele verpakking en monteer het over de lens tip zodanig dat de gel een meniscus tussen het objectief en de dop vormen. Duw hem zo ver mogelijk over de houder. Wees voorzichtig dat u de voorzijde van TomoCap aanraken tijdens de montage. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Voorbereiding van het objectief tip (top) toe te passen viscotear gel (onder) Toepassing van de TomoCap. </li><li> Verplaats de laser scanning camera zo ver naar achteren mogelijk op de camera te monteren. </li><li> De binnenste en buitenste oppervlak van de TomoCap zowel verschijnen als een heldere laser reflectie. De focal plane aanpassing wiel moet worden aangepast tot een heldere reflectie wordt waargenomen, wat aangeeft dat de lens gericht is op de voorkant van de kap. De diepte waarde die in de focus positie display moet nu worden tussen -150 en +150 um um. </li><li> Stel de diepte-instelling op nul. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Aanpassing van het brandvlak. </li></ol> 2. Voorbereiden van de patiënt De ogen van zijn verdoofd met behulp van een daling van 0,4% benoxinate hydrochloride, en Viscotears wordt gebruikt op de voorkant van het oog voor smering. Het onderwerp is comfortabel zit, met de kin op de kin rust en gevraagd hun voorhoofd stevig drukken tegen het voorhoofd bar. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voorbereiden van de patiënt 3. Het uitlijnen van de camera Het maakt het onderzoek makkelijker als je de opdracht de patiënt op de buitenste fixatie licht vast met het oog niet wordt onderzocht. Het compacte formaat van de microscoop hoofd betekent dat het onderwerp contralaterale oog niet is verduisterd, waardoor het gebruik van de afstand doelen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Doelstelling lens van het hoornvlies module. <ol><li> Plaats de CCD camera zodanig dat de optische as loodrecht op de optische as van de laser scanning camera. De camera moet aan de rechterkant van de patiënt kant bij beeldvorming van de rechter oog en vice versa. Op deze positie, ziet u de voorzijde van de TomoCap in het midden van de CCD-camera live-beeld. </li><li> Verplaats de laser scanning camera op de patiënt tot de patiënt hoornvlies is op een afstand van ongeveer 5 tot 10 mm van de TomoCap, verplaats de laser scanning camera omhoog / omlaag en links / rechts met de zwarte knoppen op de camera monteren tot de TomoCap is gepositioneerd in het centrum van het hoornvlies van de patiënt. In dit stadium kunt u controleren of de rode laser licht is in het centrum van het hoornvlies en voor fijne afstelling, de reflectie van de laserstraal te observeren vanuit het hoornvlies, die zichtbaar is in de CCD-camera beeld. Deze reflectie moet exact plaatsvinden op de voorste paal van het hoornvlies. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Uitlijning van de laserstraal op de voorste paal van het hoornvlies van de centrale cornea beelden vast te leggen. </li><li> Vraag de patiënt om zijn / haar ogen te openen zo breed mogelijk. Verplaats de laser scanning camera langzaam vooruit naar de patiënt tot de TomoCap contacten van de patiënt hoornvlies. Als het nodig ishet corrigeren van de positie van de laser scanning camera, dan beweegt de camera uit de buurt van de patiënt eerst, doe de correctie, dan vooruit weer aan het hoornvlies te contacteren. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Demonstratie van de dunne gel brug tussen de TomoCap en het hoornvlies. </li><li> Minimaal contact tussen de camera en het hoornvlies is genoeg. In een optimale aanpassing, een dunne gel brug tussen de TomoCap en het hoornvlies is zichtbaar op de CCD-camera live-beeld. </li></ol> Als u op de TomoCap of beweeg het hoornvlies te dicht bij de camera dan zie je de druk op het hoornvlies met een afgeplatte verschijning in het hoornvlies via de CCD-camera live-beeld. Ook in de beelden verkregen een lijn met de druk zal verschijnen, dus niet te veel druk aan het hoornvlies toe te passen. Als het contact tot stand is gebracht, niet bewegen de positie van de headrestto te glijden het hoornvlies op de TomoCap. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7 (links) Uiterlijk van een straie vanwege de toepassing van hoge druk op het hoornvlies door de TomoCap;. (Rechts) Een beeld met een normaal uiterlijk zonder overdruk. 4. Het onderzoeken van de patiënt Na het gezichtsveld is geselecteerd, is de HRT III laser camera is ingeschakeld en het beeld overname venster verschijnt op het scherm. Gebruik de CCD afbeelding om de TomoCap en laser licht op het hoornvlies van de patiënt positie. Onderzoek naar het gebruik van de geselecteerde modus kan dan worden begonnen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. Beeldinstellingsmenu op de monitor tijdens het maken van beelden. De wijze van verwerving In de sectie mode, is een enkel beeld verkregen en opgeslagen iedere keer dat u op de voetschakelaar. Wij gebruiken deze modus voor het vastleggen van beelden van de gehele hoornlaag inclusief laag Bowman's in het centrum van het hoornvlies. En dan na het vastleggen van voldoende aantallen van beelden, kan men proberen de andere modi, inclusief volgorde en volume. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Figuur 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9. Scherm met de keuze voor verschillende beeldacquisitie modi. Met de Sequence scan, kan men een reeks van maximaal 100 beelden te verwerven met een verstelbaar frame rate. U kunt kiezen voor een frame rate van 30 frames en 1 frame per seconde (fps) en op basis van deze modus kun je een film te verwerven met een looptijd van 3 tot 100 seconden. In volume scannen, schakelt de camera krijgt automatisch een serie van 40 beelden bij opeenvolgende brandpunt vliegtuigen. Een totale diepte van 85 micrometer kunnen worden gescand met de "FOV 400 micrometer" veld lens en de brandpuntsafstand tussen twee opeenvolgende beelden zal ongeveer 2,1 micrometer. Na een paar scans de focus vlak van lens kan worden aangepast aan de diepte van een hoornvlies cellaag ten opzichte van het hoornvliesoppervlak door te brengen de epitheliale cellaag in beeld en vervolgens te klikken op de knop Herstellen om de diepte in te stellen op 0 te meten. In het kader van onze huidige studie, krijgen we beelden van de centrale cornea op verschillende diepten. Daarom hebben we niet de scanning laser camera bewegen rond het hoornvlies horizontaal of verticaal, we gaan achteruit en vooruit en afbeeldingen vastleggen van alle diepten van laag Bowman's op hetzelfde punt hoornvlies. De afstand tussen elke afbeelding is ongeveer 1 micrometer; dus als de diepte van Bowman is 10 micrometer, zullen we 10 beelden. Maar voor de uiteindelijke analyse, selecteren we beelden met een afstand van ongeveer 2-3 um tussen hen. Na het onderzoek voltooid is zet u de camera uit door te klikken op de camera knop in de overname venster. Maak de patiënt zich ervan bewust dat hij of zij niet mag zijn of haar ogen wrijven totdat de plaatselijke verdoving is uitgewerkt. Als voorzorgsmaatregel, wil je misschien een spleetlamp onderzoek van het hoornvlies van de patiënt uit te voeren na het onderzoek. Haal de TomoCap uit de camera en gooi en dan de microscoop lens met een katoenen schoon wattenstaafje bevochtigd met gedestilleerd water. 5. Het analyseren van een onderzoeksbureau a. Het selecteren van de frames Het herzien en analyseren van de bestaande onderzoeken, moet de juiste patiënt record (s) worden geselecteerd in de database venster. Het beeld kijkvenster geeft een overzicht van bestaande hoornvlies examens voor de geselecteerde patiënt. Examens uitgevoerd op verschillende dagen worden opgeslagen in aparte tabbladen te bezoeken. De drie verschillende scan-types worden vertegenwoordigd door drie verschillende pictogrammen in de HRT III hoornvlies bezoek aan het tabblad van de beeldkwaliteit van foto's venster van de Heidelberg Eye Explorer. Naar overzicht het hoornvlies afbeelding, dubbelklikt u op het juiste imago pictogram en de "Show"-functie opent het volgende venster: <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Figuur 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 10"> Figuur 10. Weergave van alle gemaakte foto's na het onderzoek. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Figuur 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 11"> Figuur 11. Weergave van de geselecteerde afbeelding voorafgaand aan de uitvoer met CCD-camera uitzicht op het oog om de juiste afstemming te tonen. Tot uitvoer van het juiste beelden voor verdere analyse, klik op "Export" op de werkbalk en selecteer vervolgens de map waarin u de afbeeldingen wilt opslaan. We verkrijgen en vast te leggen beelden uit alle lagen van het hoornvlies voor elke patiënt, maar als de belangrijkste focus van dit onderzoek is op de layer Bowman en het hoornvlies zenuwen, wordt alleen de beelden van deze laag worden geanalyseerd. Wij selecteren 5-6 frames van laag Bowman's voor elk onderwerp op verschillende diepten van het hoornvlies. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Figuur 12" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 12"> Figuur 12. Weergave van alle lagen hoornvlies van een gezonde onderwerp. Op gemiddeld 5-6 frames van laag Bowman's in het centrum van het hoornvlies op verschillende diepten worden willekeurig geselecteerd voor kwantitatieve metingen en analyse. b. Het analyseren van beelden Voor het analyseren van de opnamen van laag Bowman's van het centrale hoornvlies met HST III, gebruiken wij gespecialiseerde software die is ontwikkeld binnen onze groep met de naam "CCM Image Analysis Tools v 0.6". Vier belangrijkste parameters voor het hoornvlies zenuwen worden gemeten met deze software: <ul><li> Zenuwvezeldichtheid (NFD), die wordt gedefinieerd als het aantal van de belangrijkste zenuwen / frame. </li><li> Zenuw tak dichtheid (NBD) aantal van de belangrijkste branches / frame. </li><li> Zenuwvezel lengte (NFL), dat is de totale lengte van alle zenuwen / frame. </li><li> Zenuwvezel tortuositeit (NFT) van de belangrijkste zenuwen / frame. </li></ul> Voor het openen van CCM beeld, ga naar het bestand&gt; openen. <ul><li> Zodra de afbeelding is geladen, wordt de grootte en het type weergegeven in de beeldinformatie Box op de linker-kant van het Control Panel. </li><li> De standaard schaal wordt weergegeven in de lijn van de te bewerken afbeelding Informatie. Als de schaal is anders, wijzig het aantal in het bewerkingsvenster lijn. </li><li> Om te beginnen met het analyseren van de foto, kies de parameter die u wilt meten van de Metric Box in de top rechts van het bedieningspaneel. </li><li> Het resultaat vak aan de onderkant van de pagina het aantal NFD, is NBD gepresenteerd in werkelijke aantal, NFL in mm en tortuositeit als een tortuositeit Coëfficiënt (TC). </li><li> Maar na het exporteren van de resultaten naar een Excel-sheet, zullen de resultaten worden gepresenteerd in een mum van / mm 2 voor NFD en NBD-en mm / mm 2 voor NFL. </li><li> Voor dit doel na het beëindigen van de metingen klikt u op Toevoegen metingen, ga dan naar Bestand&gt; Opslaan als en open de opgeslagen resultaten met Excel. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Figuur 13" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 13"> Figuur 13. Weergave van het hoornvlies zenuw beeld met tracing in analyse-instrument met "CCM Image Analysis Tool". 6. Representatieve resultaten: We hebben aangetoond dat een progressieve toe in het hoornvlies zenuwdegeneratie met de toenemende ernst van de diabetische neuropathie een en vroege schade aan de zenuwen in diabetes, die het verlies van intra zenuwvezels in de huid biopten voorafgaat aan 2 samen met de gelaagdheid van neuropathische ernst en reparatie na pancreastransplantatie 3 bij diabetespatiënten. We hebben ook aangetoond schade aan de zenuwen in idiopathische kleine vezels neuropathie 4 en 5 de ziekte van Fabry. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Figuur 14" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 14"> Figuur 14. Cornea confocale microscopie beelden met HST III van de laag van de hoornvlies Bowman's (a) controle worden ten opzichte van (b) Patiënt met neuropathie en ernstige schade aan de zenuwen.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Figuren 4 - 6: Met dank aan Heidelberg Techniek

Corneale confocale microscopie (CCM) is een niet-invasieve klinische techniek die kan worden gebruikt om vroegtijdig schade aan de zenuwen detecteren en kwantificeren van kleine vezels pathologie in perifere neuropathie met inbegrip van diabetes, de ziekte van Fabry en idiopathische kleine vezels neuropathieën (ISFN). De directe klinische impact van deze techniek betekent een enorme sprong voorwaarts op het vlak van ons vermogen te diagnosticeren, te volgen progressie en beoordelen therapeutische respons bij patiënten m...

<table><tbody><tr><td>HRT III CCM Machine - De Rostock Cornea Module</td><td></td><td></td><td> Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>CCM beeldanalyse-software v0.6 </td><td></td><td></td><td>University of Manchester</td></tr></tbody></table>

corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de small fibre pathologie kwantificeren perifere neuropathieën

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

De nauwkeurige kwantificering van perifere neuropathie is van belang om te definiëren op risicopatiënten, anticiperen op achteruitgang, en beoordelen van nieuwe therapieën. Conventionele methoden te bepalen neurologische tekorten en electrofysiologie en kwantitatieve sensorische tests kwantificeert functionele veranderingen op te sporen neuropathie. Echter, de eerste schade lijkt te zijn aan de kleine vezels en toch deze tests in de eerste plaats te beoordelen grote vezels dysfunctie en hebben een beperkte capaciteit om regeneratie en reparatie aan te tonen. De enige technieken die een rechtstreeks onderzoek van de niet-gemyeliniseerde zenuwvezel schade en herstel mogelijk zijn Sural zenuw biopsie met elektronenmicroscopie en huid-punch biopsie. Echter, beide zijn invasieve procedures en vereisen langdurige laboratorium procedures en aanzienlijke expertise. Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die in-vivo beeldvorming van het hoornvlies zenuwvezels biedt. We hebben aangetoond dat vroege schade aan de zenuwen, die het verlies van intra zenuwvezels vooraf in de huid biopten samen met de gelaagdheid van neuropathische ernst en reparatie na pancreas-transplantatie bij diabetespatiënten. We hebben ook aangetoond schade aan de zenuwen in idiopathische kleine vezels neuropathie en de ziekte van Fabry.

Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die kan worden gebruikt om C vezels schade te kwantificeren diagnosticeren en patiënten stratificeren met toenemende neuropathische ernst.

Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën

De nauwkeurige kwantificering van perifere neuropathie is belangrijk om risicopatiënten te identificeren, achteruitgang te voorzien en nieuwe therapieën te beoordelen.

Deze video demonstreert een procedure voor het in beeld brengen van corneale C-vezels met behulp van de niet-invasieve techniek van corneale confocale microscopie (CCM), waarmee kwantificering van zenuwvezelschade mogelijk is. Eerst wordt het brandvlak van de lens op de CCM ingesteld en wordt er visco tear gel op de lens aangebracht voordat de wegwerpkap wordt geplaatst. Vervolgens worden anesthetische druppels en visco tear gel in het oog aangebracht.Vervolgens wordt de camera zo afgesteld dat de gel aan de voorzijde van de lens contact maakt met het hoornvlies van de patiënt. Ten slotte wordt de diepte van het brandvlak aangepast en worden er beelden van de cornea-zenuwen uit het centrale deel van de laag van Bowman vastgelegd. Morfologische veranderingen in de cornea-zenuwvezels kunnen worden waargenomen om neuropathie te kwantificeren.Dit is een zeer innovatieve techniek die oorspronkelijk is gebruikt in de wereld van de optometrie en de oogheelkunde, maar gedurende de afgelopen acht jaar hebben wij deze zeer effectief ingezet om diabetische neuropathie en andere perifere neuropathieën te bestuderen en te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om schade aan kleine zenuwvezels in een zeer vroeg stadium te kwantificeren en vervolgens de ernst van de neuropathie bij patiënten volledig non-invasief te stratificeren. Dit kan zeer snel gebeuren met een scan van twee minuten, die vervolgens kan worden gekwantificeerd op basis van de ernst van de neuropathie; we hopen daarom dat dit enkele andere, veel invasievere technieken, zoals huidbiopten en zenuwbiopten, zal vervangen. Hoewel het in het algemeen een eenvoudige techniek lijkt, vereist het in werkelijkheid specifieke stappen om het beeld optimaal vast te leggen en vervolgens te kwantificeren.We willen dit gehele proces duidelijk en begrijpelijk maken voor iedereen die deze techniek wil gebruiken. De eerste stap bij onderzoek met de HRT corneaal confocale microscoop is de voorbereiding van de lenspunt van het objectief bij de objectiefbuis van de laser-scanningcamera. Stel de refractie in op plus 12 dioptrieën, breng vervolgens de camera naar de laagste positie en vergrendel de lens door deze tegen de klok in te draaien.Breng een grote, homogene en belvrije druppel visco tears van P-grootte aan op de lenstip. Verwijder een tomo-cap uit de steriele verpakking en plaats deze over de lenstip, zo ver mogelijk over de houder, zodat de gel een meniscus vormt tussen de objectieflens en de cap. Let erop dat u tijdens het plaatsen het vooroppervlak van de tomo-cap niet aanraakt.Verplaats nu de laserscankamera op de camerahouder zo ver mogelijk naar achteren richting het binnen- en buitenoppervlak van de tomo-cap. Beide oppervlakken verschijnen als een heldere laserreflectie op de beeldschermmonitor. Draai aan het instelwiel voor het brandvlak totdat een heldere reflectie zichtbaar is, wat aangeeft dat de lens is scherpgesteld op de voorzijde van de cap.De dieptewaarde die wordt weergegeven in het display van de focuspositie moet nu tussen minus 150 micrometers en plus 150 micrometers liggen. Zet de diepte-instelling terug naar nul. Laten we nu kijken hoe de patiënt moet worden voorbereid.Nadat de ogen van de proefpersoon zijn verdoofd met een druppel 0,4% tetracaine hydrochloride, wordt het voorvlak van het oog gesmeerd met viscotranen. Plaats de proefpersoon comfortabel met de kin op de kinsteun, waarbij wordt gecontroleerd of het voorhoofd stevig tegen de voorhoofdssteun is gedrukt. Het onderzoek wordt vergemakkelijkt door de patiënt te instrueren om te fixeren op het externe fixatielicht.Omdat het oog dat niet wordt onderzocht vrij blijft, zorgt de compacte afmeting van de microscoopkop ervoor dat het contralaterale oog van het subject niet wordt belemmerd. Dit maakt het gebruik van afstandstargets mogelijk. Positioneer de CCD-camera zodanig dat de optische as loodrecht staat op de optische as van de laser-scanningcamera.De camera moet zich aan de rechterkant van de patiënt bevinden bij het beeldvormen van het rechteroog en vice versa. In deze positie is het voorvlak van de tomo-cap zichtbaar in het centrum van de CCD-camera. Live-beeld.Beweeg de laser-scancamera naar de patiënt toe totdat het hoornvlies van de patiënt zich op een afstand van ongeveer vijf tot 10 millimeter van de tomo-cap bevindt. Gebruik vervolgens de verticale en horizontale afstelknoppen op de camerahouder om de laser-scancamera omhoog en omlaag en naar links en rechts te bewegen totdat de tomo-cap in het midden van het hoornvlies van de patiënt is gepositioneerd. Vraag de patiënt nu om de ogen zo wijd mogelijk te openen.Beweeg de laser-scanningscamera langzaam naar de patiënt toe totdat de tomo-cap het hoornvlies van de patiënt raakt. Controleer in dit stadium of het rode laserlicht zich in het centrum van het hoornvlies bevindt en of de reflectie van de laserstraal vanaf het hoornvlies precies op de anterieure pool van het hoornvlies plaatsvindt. Bij een optimale afstelling is er minimaal contact tussen de lens en het hoornvlies.Op het live-beeld van de CCD-camera is een dunne gelbrug tussen de tomo-cap en het hoornvlies zichtbaar. Als er te veel druk tussen de tomo-cap en het hoornvlies staat, vertoont het hoornvlies een afgeplatte aanblik via de CCD-camera. Het live-beeld en de strooilichtreflecties zijn zichtbaar op het CCM-beeld.Nadat de patiënt is gepositioneerd, schakelt u de HR three laser camera in, waarna het venster voor beeldacquisitie op het scherm verschijnt. Gebruik het CCD-beeld om de tomo-cap en het laserlicht op het hoornvlies van de patiënt te positioneren. De CCM biedt drie opties voor het vastleggen van beelden.Met de sequentiescan kunnen tot 100 beelden worden vastgelegd met een instelbare beeldsnelheid. Er wordt een beeldsnelheid tussen 30 en één beeld per seconde geselecteerd. Op basis hiervan kan een film worden opgenomen met een duur van drie tot 100 seconden.In de volumenscanmodus legt de camera automatisch een reeks van 40 beelden vast op opeenvolgende brandvlakken. Er kan een totale diepte van 85 micrometers worden gescand, waarbij de brandpuntsafstand tussen twee opeenvolgende beelden ongeveer 2,1 micrometers bedraagt. De laatste optie is de sectiemodus, die voor dit experiment zal worden gebruikt.Deze modus maakt optimale beeldvorming mogelijk, waarbij telkens wanneer de voetbediening wordt ingedrukt, heldere enkelvoudige beelden worden vastgelegd en opgeslagen. Deze modus wordt gebruikt voor het vastleggen van beelden van de gehele cornea-laag, inclusief de laag van Bowman in het centrum van de cornea. Nadat er een voldoende aantal beelden is vastgelegd, kunnen andere modi worden gebruikt, waaronder sequentie- en volumemodi.Na enkele scans kan het brandvlak van de lens worden gewijzigd om de diepte van een hoornvliescellaag ten opzichte van het hoornvliesoppervlak te meten door de epitheellaag in focus te brengen en vervolgens op de resetknop te klikken om de dieptewaarde op nul te zetten. Nadat het onderzoek is voltooid, schakelt u de camera uit door op de aan/uitknop van de camera in het acquisitievenster te klikken. Wijs de patiënt erop dat hij of zij de ogen niet mag wrijven totdat de lokale anesthesie is uitgewerkt.Verwijder de tomo-cap van de camera, gooi deze weg en reinig vervolgens de microscooplens met een wattenstaafje dat is bevochtigd met gedestilleerd water. Laten we nu bekijken hoe een beeld wordt geanalyseerd en zenuwvezelparameters worden gekwantificeerd om bestaande onderzoeken te beoordelen en te analyseren. Selecteer eerst het juiste patiëntendossier in het databasevenster.Het venster voor beeldweergave biedt een overzicht van de bestaande cornea-onderzoeken voor de geselecteerde patiënt. Onderzoeken die op verschillende dagen zijn uitgevoerd, worden bewaard in afzonderlijke bezoektabbladen. De drie verschillende scantypen worden weergegeven door drie verschillende iconen. In het HRT three cornea bezoektabblad van het venster voor beeldweergave van de Heidelberg Eye Explorer.Om de afbeelding van het hoornvlies te inspecteren, dubbelklikt u op het betreffende afbeeldingsicoon en drukt u vervolgens op 'show now' om de juiste afbeeldingen voor verdere analyse te exporteren; klik op 'export' in de werkbalk en selecteer daarna de map waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Aangezien de hoofdfocus van dit onderzoek ligt op de laag van Bowman en de hoornvlieszenuwen, worden alleen de afbeeldingen van deze laag geanalyseerd. Voor elk subject worden vijf tot zes frames van de laag van Bowman geselecteerd op verschillende diepten van het hoornvlies.Beeldanalyse wordt uitgevoerd met gespecialiseerde software die door onze groep is ontwikkeld, genaamd CCM Image Analysis Tools, versie 0.64. Met de software worden de belangrijkste parameters voor hoornvlieszenuwen gemeten: de zenuwvezeldichtheid, die wordt gedefinieerd als het aantal hoofdzenuwen per frame, en de zenuwtakdichtheid, wat het totale aantal hoofdtakken per frame is.De zenuwvezellengte is de totale lengte van de hoofdzenuwen en de belangrijkste vertakkingen per frame zenuwvezel. Tortuositeit is de kronkeligheid van de hoofdzenuwen per frame. Om een CCM-afbeelding te openen, gaat u naar het bestand en selecteert u openen.Zodra de afbeelding is geladen, worden de grootte en het type weergegeven in het informatievenster voor afbeeldingen aan de linkerbovenzijde van het bedieningspaneel; de standaard schaal wordt weergegeven in de bewerkingsregel van de afbeeldingsinformatie. Indien de schaal afwijkt, kan het getal in de bewerkingsregel worden gewijzigd. Om de analyse van de afbeelding te starten, selecteert u de te meten parameter uit het metriekvak aan de rechterbovenzijde van het bedieningspaneel.In het resultatenvak onderaan de pagina worden NFD en MBD weergegeven als een feitelijk getal. NFL wordt weergegeven in millimeters en de tortuositeit als een tortuositeitscoëfficiënt. De resultaten kunnen worden geëxporteerd naar een Excel-blad.Wanneer u de Excel-pagina opent, worden de resultaten weergegeven in aantal per vierkante millimeter voor NFD, millimeters per vierkante millimeter voor NFL en de tortuositeitscoëfficiënt voor NFT. Om deze metingen uit te voeren, begint u met het markeren van elke hoofdzenuw, waarna u elke hoofdzenuwtak markeert. Traceer tot slot elke zenuw in het frame.Een digitale pen kan worden gebruikt voor een betere nauwkeurigheid. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in een minuut worden uitgevoerd mits de procedure correct wordt nageleefd. Het is belangrijk om de gedetailleerde instructies op te volgen.Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed begrip heeft van hoe u beelden vastlegt van de bewegingslaag van het hoornvlies met behulp van corneale confocale microscopie, en hoe u deze beelden kwantificeert en analyseert bij patiënten met perifere neuropathie, in het bijzonder diabetische neuropathie. Vergeet niet dat werken met CCM expertise vereist en dat is geadviseerd dat professionals die zijn opgeleid in oogonderzoek de procedure uitvoeren.

corneal-confocal-microscopy-novel-non-invasive-technique-to-quantify

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

De neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gewijzigd in een verscheidenheid aan omstandigheden die soms kunnen resulteren in synaptische falen. Dit rapport beschrijft op fluorescentiemicroscoop gebaseerde methoden om dergelijke structurele veranderingen te kwantificeren.

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

We beschrijven het gebruik van full-field optische coherentiemicroscopie als een methode voor een hoogwaardige beoordeling van corneadonorstroma. Dit protocol kan worden gebruikt om kenmerken te identificeren die wijzen op gezondheid of ziekte, en is gericht op het verbeteren van de screening en selectie van donorweefsels, en dus de resultaten van keratoplastiek.

Full-field optische coherentiemicroscopie voor histologie-achtige analyse van stromale kenmerken in hoornvliestransplantaten

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Hoornvliesgevoeligheidstesten geven inzicht in de gezondheid van de hoornvlieszenuwen en helpen bij het diagnosticeren van aandoeningen van het oogoppervlak. We presenteren een beknopt protocol om de gevoeligheid van het hoornvlies kwalitatief te beoordelen en dat gemakkelijk kan worden gebruikt door oogzorgverleners in verschillende klinische omgevingen.

Testprocedure voor hoornvliesgevoeligheid voor oogheelkundige en optometrische patiënten

Capillulatoscopie is een toegankelijk hulpmiddel voor directe, goedkope en niet-invasieve visualisatie van microvasculatuur. Het doel van dit protocol is om onderzoekers in staat te stellen capilloscopie te gebruiken voor de visualisatie van perifere microvasculaire morfologie in de nagelbedden van muizen.

Niet-invasieve visualisatie van microvasculaire morfologie van nagelbedden bij muizen met behulp van capilloscopie

Dit artikel demonstreert de werking en het effect van in vivo confocale microscopie bij de diagnose en behandeling van droge ogen en onderzoekt de toepassing en resultaten van in vivo confocale microscopie om een basis te bieden voor toekomstig onderzoek.

In vivo Confocale microscopie bij de diagnose en behandeling van droge ogen: een focus op beeldvormingsprotocollen en interpretatie

Leer corneale confocale microscopie voor niet-invasieve kwantificering van zenuwvezelbeschadiging bij perifere neuropathieën. Deze methode maakt vroege diagnose en stratificatie van neuropathische ernst mogelijk.

Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën (Video) | JoVE Journal

Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën

Meer video's verkennen