Name: Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Leer de CFC-test voor humane hematopoëtische stamcellen met CD34+ cellen en methylcellulose-medium. Deze methode toont proliferatie en differentiatie voor leukemogenese-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine en Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, voor het gebruik van de High Speed ​​Cell Sorter Core, die flow cytometrie apparatuur en sorteren van diensten. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Subsidies R01 HL082549 en K02 HL084179 (NRY). De Siteman Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door een NCI Cancer Center Support Grant P30 CA91842.

1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid steriele 1000x stamoplossingen van FMS-gerelateerde tyrosine kinase 3 (FLT-3)-ligand, granulocyt / macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), stamcel factor (SCF), trombopoëtine (TPO), interleukine (IL) -3 , en IL-6 volgens de instructies van de fabrikant. Bereid steriele Retronectin stamoplossing (1mg/ml) ook volgens de instructies van de fabrikant. Verdeel deze voorraad oplossingen in kleine porties en bewaar bij -20 ° C tot herhaalde vries-dooi te vermijden. </li><li> Bereid 2% FBS in IMDM. </li><li> Bereid compleet IMDM medium met eindconcentraties van 20% FBS, 2 mM glutamine, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine (PS). Voeg de volgende cytokines vlak voor gebruik: 100 ng / ml FLT-3-ligand, 20 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml IL-3, en 100 ng / ml IL-6. </li><li> Bereid 1% BSA in HBSS (Ca en Mg-vrij, zonder fenol rood) en 2% BSA in D-PBS (Ca en Mg-vrij). Steriliseer de oplossingen door het passeren door middel van 0,22 micrometer spuitfilters en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid 0,02% EDTA in HBSS en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid galv-pseudogetypeerde retrovirus dat codeert voor het DNA van belang en op te slaan in gelijke fracties bij -80 ° C. Deze procedure valt buiten het bestek van dit artikel, maar is elders beschreven (1-3). </li></ol> Voor de Giemsa kleuring <ol start="7"><li> Net voor gebruik, twee keer de filter Wright / Giemsa kleuring oplossing door een urn filter papieren in een schoon glazen fles. </li><li> Vlak voor het gebruik, voor te bereiden Wright / Giemsa buffer pH 6.4, door het mengen van 50 ml van de gefilterde Wright / Giemsa kleuring oplossing en 200 ml fosfaatbuffer pH 6,4 - Giordano formule. </li><li> Bereid fosfaat-bufferoplossing, pH 6,0 door het oplossen van 27,3 g KH 2 PO 4 en 4,62 g Na 2 HPO 4 in 3,5 LH 2 O. </li><li> Bereid 50% methanol in H 2 O. </li></ol> 2. PROCEDURE Ontdooien en pre-activatie van CD34 + cellen <ol><li> Snel Thaw een flacon van bevroren CD34 + cellen bij 37 ° C door voorzichtig schudden tot er een laatste kleine ijskristallen is links en overdracht van de celsuspensie (1 ml) tot een 50 ml conische buis. Voorzichtig afspoelen de resterende cellen van de flacon met 1 ml op kamertemperatuur 2% FBS / IMDM en het drop-verstandig om de 50 ml buis tijdens het zwenken toe te voegen. Wacht 3 minuten. Vervolgens langzaam voeg 2 ml van 2% FBS / IMDM, terwijl voorzichtig te mengen, en wacht 3 minuten. Herhaal de procedure door toevoeging van 2% FBS / IMDM dat hetzelfde volume als de verdunde celsuspensie op 3 min. intervallen, voorzichtig te zwenken tussen toevoegingen, tot het uiteindelijke volume bereikt 32 ml. </li><li> Centrifugeer op 250 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant met achterlating van ongeveer 0,5 ml. </li><li> Was de pellet door de schorsing in 20 ml 2% FBS / IMDM en centrifugeren bij 200 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en schorten de cellen in volledige IMDM medium ongeveer 0,5 x 10 6 cellen / ml. Neem 10 pi van de celsuspensie in een microbuisjes, meng met hetzelfde volume van trypan blauw-oplossing (0,4%) en te tellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Verdunnen van de cellen met 0,1-0,15 X 10 6 cellen / ml door het toevoegen van volledige IMDM medium aangevuld met cytokines (zie 1.3) </li><li> Cultuur van de cellen in een vochtige 37 ° C incubator met 5% CO 2 voor 2 dagen. </li></ol> Retrovirale transductie door virus pre-loading <ol start="7"><li> Op de dag van transductie, tellen cellen voordat virus voorbelasting van het aantal putten te bereiden vast te stellen. </li><li> Verdun de Retronectin stamoplossing tot 25 ug / ml en voeg 400 ul aan elke well van een 24-well niet-behandelde weefselkweek plaat. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur in de laminaire flow bioveiligheid kap aan pre-coat. </li><li> Verwijder de Retronectin oplossing en voeg 400 ul van 2% BSA in D-PBS aan elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Dooi virus stockoplossingen en blijf op ijs. Verwijder de BSA-oplossing, voeg 0,5 ml van het virus voorbereiding op elk putje, en centrifugeer bij 2200 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder het virus oplossing uit putten en herhaal het virus geladen in 2.10 nog drie keer. </li><li> Spoel elk putje met koud 0,5 ml HBSS (+ Ca en Mg) of IMDM. </li><li> Verzamel de pre-geactiveerde CD34 + cellen door centrifugeren bij 200 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de cellen op 0.1-0.15 x 10 6 cellen per ml in 1,5 compleet IMDM medium met cytokinen. </li><li> Voeg 1,5 ml celsuspensie aan elk putje en incubeer deze in een vochtige 37 ° C incubator met 5% CO 2 voor 2 dagen. </li></ol> Celsortering en het verzamelen van getransduceerde cellen <ol start="16"><li> Grondig, maar voorzichtig te schorten van de cellen in de bovenstaande virus geladen plaats en filtreer door een 50 um CellTrics cel filter in een conische buis. Neem 10 pi van de celsuspensie in een microbuisjes, mengen met een gelijk volume van trypan blauwe oplossing en tellen met behulp van een hemocytometer. Spoel elk putje met 0,8 ml koud 0,02% EDTA / HBSS (Ca en Mg-vrij zonder fenol rood) en toevoegen aan dezelfde collectie buis door een 50 um CellTrics cel filter. </li><li> Centrifugeer de cellen op 200 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C, en was het pellet met koud HBSS (Ca en Mg-vrij zonder fenol rood) door centrifugeren bij 200 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1% BSA / HBSS (Ca en Mg-vrij zonder fenol rood) tot een concentratie van 15 X 10 6 / ml of een minimaal volume van 0.250 ml voor celsortering. Houd de cellen op ijs in het donker. Bereid een buis met koude 20% FBS / IMDM / Glutamine / PS medium voor het verzamelen van de gesorteerde cellen. Sorteren is uitgevoerd in de High Speed ​​Cell Sorter Kern van het Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine met behulp van een MoFlo high-speed sorteerder (Dako, Glostrup, Denemarken). </li></ol> CFK-test <ol start="19"><li> Ontdooi het vereiste aantal van 3 ml monsters van CFK-assay media. Vortex krachtig te mengen en laat de buizen staan ​​minstens vijf minuten te laten bellen aanwezig om naar de oppervlakte stijgen voor het toevoegen van cellen. </li><li> Voor het verkrijgen van de cel concentratie voor elke gesorteerde monster, delen het aantal cellen door de sortering faciliteit door de geschatte celsuspensie volume. Neem 3.000 virus-getransduceerde, gesorteerd cellen in een steriele microbuisjes met koud 2% FBS / IMDM. Pre-het volume van 2% FBS / IMDM, zodat het uiteindelijke schorsing volume zal ongeveer 0,3 ml zijn. </li><li> Hang de cellen en de overdracht van de gehele 0,3 ml celsuspensie aan een 3 ml van Methocult GF + H4435, die bestaat uit 1% methylcellulose, 30% FBS, 1% BSA, 10 -4 M 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml G-CSF, en 3 eenheden / ml erytropoëtine in IMDM. Human Methylcellulose Verrijkt Media (R &amp; D Systems), dat bestaat uit 1,3% methylcellulose, 25% FBS, 1% BSA, 5 x 10 -5 M 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml G-CSF, en 3 eenheden / ml erytropoëtine in IMDM kan ook worden gebruikt. </li><li> Vortex krachtig om het mengsel volledig stijgen en dalen 3-4 keer. Laat de buis nog steeds staan ​​voor 3 minuten. </li><li> Bevestig een 16 gauge stompe einde van de naald op een 3 ml spuit en het opstellen van 2,2 ml. Niet het opstellen van grote luchtbellen; verdrijven ze bij het begin door op een paar keer. Duw elk van 1,1 ml in twee 30 mm niet-behandelde schotel en verspreid het mengsel gelijkmatig door het draaien. </li><li> Plaats dubbele platen in een 100 mm plaat, samen met een water-schotel met 3 ml steriel water. Cultuur voor 14 - 17 dagen. </li><li> Karakteriseren en de koloniën score op basis van hun morfologie met een omgekeerde microscoop bij 40x vergroting in een cultuur schotel gemarkeerd met een score grid. Voor de toepassing van onze test worden de kolonies ingedeeld in 3 categorieën: pure erytroïde, myelomonocytische, en gemengd. Zie instructies van de fabrikant voor verdere kolonie subclassificatie. </li><li> De hele CFK assay plaat kan worden gescand zonder vergroting met een gewone scanner op 600 dpi, en de low-power (40x) microfoto van kolonies kunnen worden genomen met behulp van een omgekeerde microscoop is uitgerust met een kleurencamera. </li><li> Voor verdere analyse van differentiatie en proliferatie, worden de cellen van de gehele CFK testplaat teruggevorderd door schorsing in verschillende delen van de ruimtetemperatuur 2% FBS / IMDM. Na centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C worden de cellen geresuspendeerd in 2% FBS / IMDM, geteld, en ofwel gekleurd met antilichamen voor flowcytometrie of overgedragen om dia's met behulp van een Cytospin centrifuge voor de Giemsa kleuring. </li></ol> Antilichaam kleuring en flowcytometrie <ol start="28"><li> Centrifugeer cellen op 200 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C en resuspendeer in een koude 50% normale muis serum in HBSS (Ca en Mg-vrij zonder fenol rood). </li><li> Plaats ongeveer 5 x 10 5 cellen in 80 ul per buis (12 x 75 mm ronde bodem buizen) en blijf op ijs. Voeg antilichaam mengsel (ongeveer 20 ui mengsel of negatieve controle oplossing voor de no-antilichaam controles) en meng door licht te tikken de buizen. Bereid de kalibratiefunctie te regelen buizen met geen antilichaam of met een anti-CD45 antilichaam voor elk fluorchroom. Plaats de buisjes op ijs in het donker en incubeer gedurende 20 minuten. Meng door zachtjes te tikken buizen na de eerste 10 minuten. Na de 20 minuten incubatie, vul de buizen met koude HBSS en centrifugeer op 200 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in koude 0,5% paraformaldehyde / HBSS. De volgende mengsels van antilichamen worden doorgaans gebruikt voor onze analyse. Voor myeloïde differentiatie: CD11b (phycoerythrin-geconjugeerd kloon ICRF44) / CD33 (allophycocyanin-geconjugeerde kloon WM53) / CD45 (phycoerythrin-Cy7-congjugated kloon HI30). Voor erytroïde differentiatie: CD71 (phycoerythrin-geconjugeerd kloon M-A712) / CD235a (allophycocyanin-geconjugeerd kloon GA-R2) / CD45 (phycoerythrin-Cy7-congjugated kloon HI30). </li><li> Flowcytometrie is uitgevoerd in de High Speed ​​Cell Sorter Kern van het Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine op een FACScan flowcytometer opgewaardeerd tot 5 kleuren en twee lasers (BD Biosciences) en geanalyseerd met behulp van CellQuest (BD Biosciences) of FlowJO v7.2.4 (Tree Star, Inc, Ashland, OR, USA) software. </li></ol> Giemsa kleuring <ol start="31"><li> Ongeveer 30.000 cellen hersteld van CFK-assay platen hierboven beschreven zijn gesuspendeerd in 0,3 ml 2% FBS / IMDM en overgebracht naar een dia met behulp van een Cytospin centrifuge bij 1000 rpm gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Stel negen kleuren van vaten met oplossingen in de volgende volgorde. <ol><li> Absolute Methanol </li><li> Wright / Giemsa voorraad-oplossing </li><li> Wright / Giemsa-buffer, pH 6,4 </li><li> 50% methanol in H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> Fosfaatbuffer, pH 6,0 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li></ol></li><li> Plaats de dia's in een dia vervoerder en duik in absolute methanol (# 1) gedurende 2 minuten en dep het overtollige methanol. </li><li> Onmiddellijk, dip de schuif vervoerder in Wright / Giemsa stamoplossing (# 2) gedurende 5 minuten. </li><li> Overdracht van de vervoerder in Wright / Giemsa-buffer, pH 6.4 (# 3) en incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Twee keer Dompel de vervoerder in 50% methanol (# 4), 10 keer in H 2 O (# 5), nog eens 10 keer in H 2 O (# 6), en vervolgens 5 keer in fosfaatbuffer, pH 6.0 (# 7) . </li><li> Breng de drager in H 2 O (# 8) en incubeer gedurende 2 minuten. Herhaal het wassen in H 2 O (# 9). </li><li> Laat de dia's volledig aan de lucht drogen in de drager. Verwijder elke dia en veeg de achterkant van de dia met methanol gedrenkte Kimwipes om vlekken te verwijderen. Breng een druppel Cytoseal 60 en een dekglas te dichten. </li><li> Een 500-cellen differentiële telling is uitgevoerd voor elke Giemsa-gekleurde glijbaan met behulp van een Olympus BX51 microscoop. Cellen zijn onderverdeeld in vijf categorieën: primitieve cellen bevatten ontploffing en promyelocyten; intermediaire myeloïde cellen bevatten myelocyten en metamyelocyten; volwassen myeloïde cellen omvatten bands, gesegmenteerde neutrofielen, monocyten en macrofagen, intermediaire erythroïde cellen omvatten cellen met intermediaire hemoglobinization, en rijpe erythroid cellen bevatten cellen met volledige hemoglobinization. Microfoto's worden genomen met een Olympus DP71 camera met een 60x olie doelstelling. </li></ol> 3.0) representatieve resultaten: <ol><li> CFC test: Sommige van de input cel bevolking zal verspreiden, differentiëren, en vormen kolonies op de semi-solid medium tijdens de 14-17-dagen incubatieperiode. In dit experiment, is het duidelijk dat de expressie van de NUP98-HOXA9 oncogen de vorming van prominente rood (erytroïde kolonies) (figuur 1) (3) veroorzaakt. </li><li> Antilichaam kleuring en Flow cytometrie: Flow cytometrische immunofenotypering van cellen verzameld uit CFK-assay platen geeft informatie over de differentiatie van de cel bevolking. Door het gecombineerd gebruik van antilichamen tegen bepaalde differentiatie merkers kunnen de afstamming en de mate van rijping van de cellen worden beoordeeld. In dit geval CD235a werd gebruikt om erythroïde cellen te identificeren. Zoals getoond in Figuur 2A, NUP98-HOXA9 veroorzaakt een toename van het percentage van de CD235a + erythroid cellen, maar de helderheid van CD235a expressie door deze cellen was verminderd vergeleken met controles, met vermelding van remming van de erythroid rijping. In figuur 2B zijn myeloïde cellen geïdentificeerd op grond van hun CD33 positiviteit. NUP98-HOXA9 veroorzaakte een afname in het aantal CD33 + cellen, met een afname van de helderheid van CD11b expressie, in overeenstemming met de remming van myeloïde rijping (3). Dus de flow-cytometrie resultaten tonen aan dat NUP98-HOXA9 een erytroïde hyperplasie met een remming van zowel de myeloïde en erytroïde rijping veroorzaakt. </li><li> Giemsa kleuring: Morfologische onderzoek van de cellen verzameld uit CFK-assay platen geeft informatie over de afstamming en de mate van rijping van de cel bevolking. De conclusies morfologisch verkregen kunnen afwijken van die verkregen door flowcytometrische studies, en dus deze methoden zijn complementair aan elkaar (3). Het experiment wordt herhaald ten minste 3 keer, en elke keer een 500-cellen differentiële telling is uitgevoerd om vijf categorieën van cellen te onderscheiden, zoals hierboven beschreven. Voorbeelden van deze cellen zijn aangegeven in figuur 3. De resultaten worden in tabelvorm en geanalyseerd om te bepalen of er statistisch significante verschillen tussen het oncogen-getransduceerde monster en de controle. In dit geval, de resultaten bleek dat NUP98-HOXA9 een algehele stijging van het aantal veroorzaaktes van de cellen, met erytroïde hyperplasie en remming van zowel de erytroïde en myeloïde rijping (3) (niet afgebeeld). </li></ol> FIGUUR LEGENDS <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: De effecten van NUP98-HOXA9 op de menselijke CFK morfologie. Primaire menselijke CD34 + cellen werden retrovirally getransduceerde met ofwel controle MSCV-IRES-GFP vector-of vector die NUP98-HOXA9, en de cellen werden gesorteerd voor GFP positiviteit. Een duizend cellen werden uitgezet in elk van twee dubbele platen voor CFK-test en het experiment werd herhaald 3 4 onafhankelijke keer. Vertegenwoordiger van platen zonder vergroting (links) en een laag stroomverbruik microfoto's van representatieve erytroïde kolonies (rechts) worden weergegeven (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: Flow cytometrie toont verstoring van het menselijke primaire CD34 + cellen differentiatie door NUP98-HOXA9. (A) Flowcytometrie voor erytroïde differentiatie: Cellen van het CFK platen (zie figuur 1) werden geoogst en gekleurd met antilichamen tegen CD45 en CD235a. De CD235a + poort was uitgezet op een histogram (rechter paneel) om de expressie van CD235a ten opzichte van controle cellen vertonen (B) Flowcytometrie voor myeloïde differentiatie: Cellen van de CFK-platen werden geoogst en gekleurd met CD45 en CD33. De CD33 + poort was uitgezet op een histogram om CD11b expressie vergeleken met de controlegroep (rechter paneel) te tonen. De percentages van de cellen binnen elke poort worden weergegeven (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Cell morfologie toont verstoring van differentiatie door NUP98-HOXA9 in vergelijking met vector controle. Cytospin uitstrijkjes werden bereid uit CFK-platen en gekleurd met Giemsa. Microfoto's werden genomen van de vertegenwoordiger van velden met een 60x olie doelstelling. B: blast; MM: volwassen myeloïde, IM: intermediate myeloïde, ME: volwassen erytroïde, IE: intermediate erytroïde (3).

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

De CFK&#39;s test is uitgebreid gebruikt om de proliferatie en differentiatie van hematopoietische voorlopercellen patronen te bepalen en om de effecten van oncogenen (4, 5) te bestuderen. Het heeft het voordeel ten opzichte van vloeibare culturen van het zijn een klonale test, zodanig dat de kolonies de nakomelingen van een enkele progenitor vertegenwoordigen en kan afzonderlijk worden verwijderd voor verdere analyse. De beperking van de CFK-test is dat het niet voldoende is voor de detectie van meer onrijpe voorloperc...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FLT-3 ligande</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Retronectine</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw-oplossing (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>Met methylcellulose verrijkt medium voor mensen</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>Wright/Giemsa-kleuring</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing, pH 6,4 - Giordano-formule</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>Normaal serum van muis</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD11b phyc&amp;#8211;erythrine-geconjugeerd</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD33 allophycocyanine-geconjugeerd</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD45 phyc&amp;#8211;erythrine-Cy7-geconjugeerd</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD71 phyc&amp;#8211;erythrine-geconjugeerd</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD235a allophycocyanine-geconjugeerd</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD45 phyc&amp;#8211;erythrine-Cy7-geconjugeerd</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Niet-behandelde weefselkweekplaten met 24 putjes</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>Niet-behandelde schaal van 30 mm</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>Weefkweekschaal van 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Geradereerde tel-schalen</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen van 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen van 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>Spuiten van 3 ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Stomp-uiteinde naald, 16 gauge, 1&amp;frac12; inch</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m CellTrics celfilter</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>TPX monsterkamers</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost/Plus microscopische objectglazen, vooraf gereinigd</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Shandon filterkaarten</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Shandon cytospin-objectglaashouder</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m filterpapier</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekincubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>Waterzuiveringssysteem</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

colony forming cell (cfc) test voor humane hematopoietische cellen

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Humane hematopoietische stamcellen / progenitorcellen worden meestal verkregen uit beenmerg, navelstrengbloed of perifeer bloed en worden gebruikt om hematopoiese en leukemie te bestuderen. Ze hebben het vermogen om te differentiëren in de lymfoïde en myeloïde geslachten. De kolonievormende cel (CFC) test wordt gebruikt om de proliferatie en differentiatie patroon van hematopoietische voorlopercellen door hun vermogen om kolonies vormen in een halfvaste medium te bestuderen. Het aantal en de morfologie van de kolonies gevormd door een vast aantal van de input-cellen geven voorlopige informatie over het vermogen van voorouders om te differentiëren en zich vermenigvuldigen. Cellen kunnen worden geoogst uit afzonderlijke kolonies of van de hele plaat verder te beoordelen hun aantallen en differentiatie staten met behulp van flowcytometrie en morfologische evaluatie van de Giemsa-gekleurde dia&#39;s. Deze test is nuttig voor de beoordeling van myeloïde maar niet lymfoïde differentiatie. De term myeloïde in deze context wordt gebruikt in ruimere zin te granulocytaire, monocytische, erytroïde, en megakaryocytaire lijnen omvatten. We hebben gebruik gemaakt van deze test om de effecten van oncogenen te beoordelen op de differentiatie van primaire menselijke CD34 + cellen afkomstig uit het perifere bloed. Voor dit doel cellen getransduceerd met ofwel controle retrovirale construct of een constructie uiting van de oncogen van belang, in dit geval NUP98-HOXA9. Wij werken met een algemeen gebruikte retrovirale vector, MSCV-IRES-GFP, dat een bicistronische mRNA dat het gen van interesse en een GFP marker produceert uitdrukt. Cellen zijn vooraf geactiveerd door te groeien in de aanwezigheid van cytokinen voor twee dagen voorafgaand aan de retrovirale transductie. Na nog twee dagen, zijn GFP + cellen geïsoleerd door middel van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) en gemengd met een methylcellulose-bevattend halfvaste medium aangevuld met cytokines en geïncubeerd tot kolonies op de oppervlakte, meestal 14 dagen. Het aantal en de morfologie van de kolonies zijn gedocumenteerd. Cellen worden vervolgens verwijderd van de platen, gewassen, geteld, en onderworpen aan flowcytometrie en morfologische onderzoek. Flowcytometrie met antilichamen die specifiek zijn voor het celoppervlak markers die tijdens hematopoiese geeft informatie over de afstamming en rijping podium. Morfologische studies van individuele cellen onder een microscoop na Wright-Giemsa kleuring nadere informatie met betrekking tot afstamming en rijping. Vergelijking van cellen getransduceerd met controle lege vector die getransduceerd met een oncogen onthult de effecten van het oncogen op hematopoietische differentiatie.

De kolonievormende cel (CFC) assay is een in vitro assay waarin hematopoietische voorlopercellen vormen kolonies in een semi-vast medium. Een combinatie van kolonie morfologie, celmorfologie en flowcytometrie worden gebruikt om het vermogen van de voorouders te laten groeien en differentiëren langs de verschillende hematopoietische lijnen te beoordelen.

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Menselijke hematopoëtische stam-/progenitorcellen worden gewoonlijk verkregen uit beenmerg, navelstrengbloed of perifeer bloed en worden gebruikt om hematopoëse en ... te bestuderen.

Deze procedure beoordeelt in een semi-solide medium het vermogen van hematopoëtische progenitoren om te prolifereren en te differentiëren langs verschillende hematopoëtische lijnen aan het begin van de cultuur. Vers ontdooide CD 34 positieve cellen worden gedurende twee dagen gekweekt in de aanwezigheid van cytokinen om activatie te bevorderen. Voer vervolgens een retrovirale transductie uit van een GFP-expresserend testconstruct door de geactiveerde CD 34 positieve cellen toe te voegen aan een plaat die vooraf is geladen met virus.Isoleer na 48 uur de GFP-positieve cellen via FACS en zaai deze cellen vervolgens uit in een semi-solide methylcellulosemedium aangevuld met groeifactoren; incubeer gedurende ongeveer twee weken totdat er kolonies op het oppervlak verschijnen. Oogst tot slot de kolonies, immobiliseer de cellen op objectglazen met cytosine en kleur deze met Wright-Giemsa voor microscopische bepaling van de hematopoëtische lijn en het rijpingsstadium. Deze methode kan mechanisch inzicht verschaffen in studies naar leukemogenese, in het bijzonder de effecten van oncogenen op de hematopoëtische differentiatie.Om een cultuur te starten, ontdooi snel een vial met bevroren CD 3

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te...

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

This video describes the protocol for methyl cellulose-based colony formation unit or CFU assay, which helps identify and count the number of colonies formed by leukemic cells in response to the treatment with anticancer compounds.

Methyl Cellulose-Based CFU Assay: A Method to Determine the Effect of Anti-cancer Compounds on Colony Formation in Leukemic Cells

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Dit protocol beschrijft een procedure voor het induceren van differentiatie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen afkomstig van het beenmerg en perifere bloed mononucleaire cellen. De assay gebruikt een halfvaste kweekmedium ter ondersteuning van erythroïde en myeloïde lijnbinding en bevat gestandaardiseerde metrics voor reproduceerbare kolonieclassificatie voor preklinische geneesmiddelkarakterisering.

Colony-Forming Unit assay aangepast voor door patiënten afgeleide beenmerg- en perifere bloedmononucleaire cellen

Leer de CFC-test voor humane hematopoëtische stamcellen met CD34+ cellen en methylcellulose-medium. Deze methode toont proliferatie en differentiatie voor leukemogenese-onderzoek.

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Meer video's verkennen