Protocol voor Mosquito Opfok (A. gambiae)

Mijn naam is Shish en ik ben postdoc in het laboratorium van Dr. George OU aan de John Hopkins School of Public Health. In de afdeling Moleculaire Microbiologie en Immunologie zal ik laten zien hoe men muskieten van de soort Anopheles gambiae kweekt. In het laboratorium houden we ze in de insectarierkamer, die gewoonlijk op 27 °C en een luchtvochtigheid van 80% wordt gehouden.

De insectarierkamer wordt tevens beheerd in een dag-nachtcyclus van 12 uur, zodat we de natuurlijke omstandigheden kunnen nabootsen. Dit is de insectarierkamer die we hebben, wat hier een kernfaciliteit is voor het houden van deze insecten. Zoals u kunt zien, zijn hier alle verschillende trays aanwezig met muggen in alle diverse stadia: het ei, de verschillende stadia van de larven en de pop.

Deze trays bevatten larven van ongeveer 11 of 12 dagen oud, en dit is een kooi waarin we de volwassen muggen verzamelen en in stand houden met een 10%sucrose-oplossing. Om te beginnen met het fokken van de muggen moeten we de muggen bloed voeren, omdat de muggen het eiwit uit het bloed nodig hebben om eieren te leggen. Dag één is dus nadat de volwassenen in een kooi zijn verzameld en in stand worden gehouden op 10%sucrose.

Op de eerste dag worden de muggen gevoed met bloed, waarvoor het kunstmatige membraan-bloedvoedingsysteem wordt gebruikt. Dit is een glazen voederapparaat dat we gebruiken voor de membraanvoeding van de muggen. We vullen het bloed via het kleine gat dat u ziet, waarna het in het apparaat wordt opgevangen.

Aan de onderzijde aan de zijkant bevinden zich twee nozzles, die zijn verbonden met een waterbad dat op 37 °C wordt gehouden. Om het bloed op 37 °C warm te houden en de feeder voor te bereiden op de voeding, nemen we een klein stukje Parafilm. We rekken dit aan beide uiteinden en vanaf alle vier de zijden uit, en plaatsen dit vervolgens op de open zijde van de glazen feeder om een dun membraan te creëren dat de huid nabootst.

Dit is wat men de membraanvoeding noemt. Dit is een circulerend waterbad, dat het water op 37 °C houdt en het water tevens door de glazen voeder circuleert, zodat het bloed constant warm blijft op 37 °C. We verbinden de glazen voeder via de kleine capillairen met het circulerende waterbad en schakelen het waterbad in, zodat het water circuleert; het water en het bloed mengen nooit, aangezien ze zich in twee gescheiden kamers bevinden.

Dit is een kooi met volwassen Phis Gambi muggen. Dit is de glazen voeder, die is aangesloten op het circulerende bad; we plaatsen een klem bovenop de kooi en voegen 200 µL bloed toe. In de kooi bevinden zich zowel mannelijke als vrouwelijke muggen.

Alleen het vrouwtje komt om zich te voeden met bloed. De voeding gaat ongeveer 30 minuten door. Twee dagen na de bloedmaaltijd plaatsen we eierbekers in de kooi van de muggen zodat ze hun eieren kunnen leggen.

Dit is hoe het wordt uitgevoerd. We nemen een klein bekerglas en vullen dit gedeeltelijk met gedestilleerd water, nemen een stuk filterpapier en maken dit nat, vouwen het vervolgens in een kegelvorm en plaatsen dit in het bekerglas met het gedestilleerde water, waarbij we ervoor zorgen dat het papier vochtig blijft. Vervolgens openen we langzaam de muskiettenkooi, waarbij we er zorg voor dragen dat er geen muskietten ontsnappen, en plaatsen we de eierbekers binnenin.

De volgende dag nadat de bekers in de kooi zijn geplaatst, dus op de vierde dag, worden ze langzaam uit de kooi gehaald. Dit zijn de eitjes, de zwarte, waarbij ook enkele dode muggen aanwezig zijn. Zodra de eitjes gereed zijn, plaatst u ze op een plastic plateau.

Vervolgens wordt de plastic tray gevuld met gedestilleerd water. Neem het filterpapier met de eitjes en plaats deze erin. We voegen ook een snufje voer A toe, wat bestaat uit gemalen visvoer, en plaatsen de tray in het rek.

We moeten de tray waterpas maken op de dag dat we met de tray beginnen en ook bepalen om welke soorten het hier gaat. Dit gebeurt de dag nadat de eieren in de tray zijn geplaatst. Dat wil zeggen dat deze één dag oud zijn, maar het eigenlijke protocol start op de vijfde dag van de muggenontwikkeling.

Dit zijn de zwarte eitjes, die elk moment kunnen uitkomen tot larven. En dit is het voer voor de muggen. Voor de kweek van muggen gebruiken we gewoonlijk drie verschillende soorten voeding.

Voedsel A is in feite gemalen visvoer; we voegen dit voedsel toe bij de start van de muggenkweek, wanneer ze zich in het X-stadium bevinden, waarbij we dagelijks twee tabletten voedsel C toevoegen, wat kattenvoer is gekocht van Purina. Na acht of negen dagen vervangen we het water in de tray door vers water. Op dat moment voegen we, in plaats van voedsel A, een snufje voedsel B toe, wat niets anders is dan gemalen voedsel C (gemalen kattenvoer), samen met twee tabletten voedsel C, terwijl de eitjes uitkomen tot larven.

Er zijn drie verschillende stadia van de larven. Eerst in install, daarna in install, en ten slotte in install. Dit zijn trays waarin de larven zitten, welke vijf of zes dagen oud zijn.

Deze Ravi zijn in een veel later stadium, ongeveer 9 tot 10 dagen oud. In de tussentijd is het water ververst en is er vers water en vers voedsel toegevoegd. Deze tray bevat zowel de volwassenen als de ppe.

Dit zijn de volwassen exemplaren die, zoals u kunt zien, onder de muskietennetten vliegen. En aan de rand ziet u alle donkergekleurde poppen, die zullen uitkomen als volwassen exemplaren. Zodra de volwassenen er zijn, kunnen ze worden verzameld in een kooi, die er zo uitziet.

Het heeft aan de binnenzijde een voering van keukenpapier en een klein flesje met 10% superoplossing en een katoenen zeepbakje, dat als voedselbron voor de muggen zal dienen. We hebben het deksel afgedekt, en dit is de apparatuur, de aspirator, die is verbonden met de vacuümpomp waarmee de volwassen exemplaren uit deze trays worden verzameld. Dit deel van de aspirator is hier aangesloten en bevindt zich aan het andere uiteinde.

Aangesloten op het vacuüm. We plaatsen de kooi erin, waarin we de volwassenen in dit kleine doosje zullen verzamelen. Dit is een ander onderdeel van de aspirator, dat een lange buis heeft die in de muggenschaal wordt geplaatst.

De andere zijde wordt verbonden met de kooi. Zorg ervoor dat alles luchtdicht is gesloten, zodat het vacuüm goed werkt. We sluiten het deksel en controleren of alles goed aansluit.

Start het backend langzaam op. Zodra de installatie gereed is, plaatsen we deze lange buis langzaam in de muskiettenbak, waarbij we ervoor zorgen dat het net wordt gesloten zodat de muskietten niet kunnen ontsnappen. En zoals u kunt zien, worden de muskietten verzameld in de kleine kooi.

Beweeg de pijp langzaam overal om alle volwassen exemplaren te verzamelen. Nu ben ik bijna klaar. Alle volwassen exemplaren zijn verzameld en ze bevinden zich allemaal in deze kooi, zoals u kunt zien.

Vervolgens laten we langzaam het vacuüm los en demonteren we de opvangapparatuur. Dit zijn de volwassen Anopheles gambiae muggen, die enkele dagen in deze kooi zullen blijven. Ze krijgen 10% sucrose om van te voeden, en ze krijgen bloed wanneer we willen dat ze eieren leggen.

Ik heb zojuist laten zien hoe u met muggen werkt. Om muggen onder laboratoriumomstandigheden te kweken, zijn de belangrijkste stappen het voeren van bloed. Vervolgens worden de eibekers geplaatst, gevolgd door de eieren, en daarna doorlopen ze verschillende stadia zoals larven, poppen en volwassen exemplaren.

Ten slotte verzamelen we de volwassen exemplaren. Het belang van deze techniek is dat we de omstandigheden moeten nabootsen die buiten onder natuurlijke condities heersen, zodat we gezonde muggen hebben; vervolgens infecteren we ze met Plasmodium en voeren we verschillende soorten studies naar malaria uit, waarbij het hoofddoel is om malaria uit de wereld te helpen.