Name: Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer primaire celculturen bereiden uit Drosophila embryo's voor RNAi en celbeeldvorming. Deze methode maakt effectieve genfunctie-analyse en immunofluorescentie-microscopie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JB werd gesteund door de Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ werd ondersteund door NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02. NP is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.

1. Voorbereiding van de fly kooien <ol><li> Grow Drosophila (wild-type stammen, zoals Oregon-R of een genotype) in handige verpakkingen zoals een 32-oz insect cups. </li><li> Overdracht nieuw eclosed vliegt naar grote embryo-collectie kooien of vliegen de bevolking kooien. </li><li> Verplaats de kooien in een kamer met een temperatuur van ~ 25 ° C en de luchtvochtigheid ~ 65% in een lichte 12-h en een donkere 12-h-cyclus met het verzamelen van synchrone embryo's te vergemakkelijken. </li><li> Houden de vliegen in de kooien door ze gedood gist plakken strepen op melasse platen. Wijzig de melasse platen (met gist gedood pasta) eenmaal per dag voor 2-3 d. </li></ol> 2. Verzameling van synchrone embryo's <ol><li> Op de dag van de primaire-celpreparaat, voeden de vliegen WTH verse platen gecoat met gedood gist pasta voor een 1-2 uur pre-lay periode. </li><li> Net voor de 12-h donker cyclus, vervang dan de pre lagen borden met verse melasse platen strepen met een minimale hoeveelheid gist pasta. Gooi de pre lag collectie, die asynchroon oudere embryo's bevat. </li><li> Verzamelen van embryo's voor een periode van 1-2 uur </li><li> Verwijder de platen met de relatief synchrone bevolking van embryo's en bewaren bij 25 ° C gedurende 5-6 uur Embryo's zal op de geavanceerde gastrulastadium op dit moment. </li></ol> 3. Inzameling en het wassen van embryo's <ol><li> Draai de embryo's van de platen met een natte kwast, en spoel grondig af met lauw leidingwater door middel van een gestapelde reeks van zeven, zodat de embryo's in de fijnste zeef halen aan de onderkant. Spoel een paar minuten te verwijderen zoveel gist en vliegen puin mogelijk te maken. </li><li> Tip van de zeven, zodat de embryo's zich ophopen aan de ene kant, en zacht was ze af van de zeef in een dechorionation mand. </li><li> Ga naar de weefselkweek kap ruimte zonder dat de embryo's uitdrogen. </li></ol> 4. Homogenisatie van embryo's en plating van cellen <ol><li> Steriliseren en dechorionate de embryo's door ze onder te dompelen in 50% (vol / vol) bleekmiddel voor 5-10 minuten. Spoel de embryo's van de muur van het mandje met 70% (vol / vol) ethanol. Als alternatief, was het bleekmiddel uit embryo's met gedistilleerd water voordat ethanol behandeling. Vanaf dit punt embryo's moet worden behandeld in steriele omstandigheden en in de weefselkweek kap. </li><li> Spoel de embryo's om het bleekmiddel en / of ethanol verwijderen met geautoclaveerd gedestilleerd water. </li><li> Tijdens de dechorionation stap, vul een Dounce homogenisator met de juiste hoeveelheid van de kamertemperatuur M3 medium gebaseerd op de hoeveelheid van embryo's. De verhouding tussen het volume van de embryo's en die van de media mogen niet meer dan 0,5 ml embryo's: 40 ml media (of ~ 100-200 embryo / ml). </li><li> Plaats de gespoeld embryo's in een gesteriliseerd beker met het bedrag van de M3 media genoeg is om onder water de embryo's. Laat de embryo's laten weken gedurende 2-5 minuten. </li><li> Demonteer de dechorionation mand en dep de Nitex mesh droog met keukenpapier gesteriliseerd. </li><li> Breng de embryo's in de homogenisator met een gesteriliseerde penseel. </li><li> Homogeniseren voorzichtig met korte slagen met behulp van een losse stamper zonder het bereiken van de bodem van de buis totdat alle embryo's opgeschort. Dan voorzichtig, maar stevig, gehomogeniseerd met acht volle slagen. Draai niet aan de stamper als het beweegt op en neer. </li><li> Breng de homogenaat in een steriele 50 ml conische centrifugebuis hetzij door gieten of pipetteren, en de dop op de tube. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 min bij 40g, kamertemperatuur pellet het weefsel puin, grote cel klonten en vitelline membranen. Breng de bovenstaande met de cellen en dooier met een schone buis en herhaal de centrifugatie stap voor 5 minuten. </li><li> Breng voorzichtig de supernatant door gieten of pipetteren in een schone buis en spin voor 10 min bij 360 g, kamertemperatuur pellet de cellen. Giet het supernatans af. Resuspendeer de cel pellet in 10 ml kweekmedium (serum-vrij medium voor RNAi experimenten). </li><li> Count levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer naar de cel dichtheid te schatten. Ondertussen, herhaalt u stap 4.10 tot pellet de cellen. </li><li> Resuspendeer de cellen om een ​​gewenste concentratie. Om te beginnen, probeer dan een bereik van 1 ~ 5 x 10 6 cellen / ml en uit op 1,7 tot 2,5 x10 5 cellen / cm 2 plaat. </li></ol> 5. Primaire cel RNAi voor cellen gekweekt op een 384-wells plaat <ol><li> Doseer 5 ul van dsRNA's in elk putje bij een uiteindelijke concentratie van ~ 250 ng per putje in een 384-wells plaat. </li><li> Gebruik een multi-channel pipet, afzien van 10 ml (1 ~ 4x106 cellen / ml) van primaire cellen per putje in een serum-vrij M3 medium in een 384-wells plaat met een andere dsRNA in elk putje. Als alternatief kunnen cellen worden gekweekt op een 8-goed glas kamer dia's voor confocale beeldvorming. </li><li> Centrifugeer de platen voor een min bij 300 g, kamertemperatuur. Cultuur van de cellen in serum-vrij medium bij 25 ° C voor 22 uur of bij 18 ° C gedurende 1-2 d. </li><li> Voeg 30 ml serum-bevattende kweekmedium aan elke well. </li> Centrifugeer de platen voor een min bij 300 g, kamertemperatuur. <li> Leg de platen in een vochtige kamer en de cultuur van de primaire cellen voor een extra 5 ~ 7 d bij 25 ° C. </li><li> Het imago van de cellen levend of na immunofluorescentiekleuring. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: In optimale omstandigheden, zal cellen in de cultuur van een gezonde look met een ronde morfologie. De cultuur zal weinig celresten, en worden 50 ~ 80% confluent na de eerste plating. Deze cellen zullen ondergaan morfologische veranderingen na gekweekt voor een langere periode van tijd. Het duurt meestal ongeveer 5-8 dagen voor cellen in de cultuur om ten volle worden onderscheiden bij 25 ° C. Goede kwaliteit primaire culturen worden doorgaans beoordeeld door hoe goed de cellen-of-interest worden onderscheiden in cultuur. Bijvoorbeeld, primaire spiercellen hebben vaak een tak-achtige morfologie en word meerkernige myotubes met streep-achtige myofibrillen bestaat uit een reeks van sarcomeren. Volledig gedifferentieerde myotubes zal meestal spontaan bewegen in de cultuur. In tegenstelling, gedifferentieerde primaire neuronen vormen clusters met hun cellichamen, en verbinden met andere clusters met hun axon kabels. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Primaire cellen ondergaan morfologische veranderingen na uitgeplaat in de cultuur (A) Een helder vlak beeld van primaire cellen direct na zijn uitgeplaat in een putje van een 384-wells plaat. De meerderheid van de cellen zijn rond en intact en goed gescheiden. (B) Een helder vlak beeld van de primaire celkweek 20 uur na plating. Primaire cellen zijn al opgenomen in clusters (grote pijlpunt) en de spieren met een tak-achtige morfologie (lange pijl) is te herkennen in dit stadium. (C) Een fase-contrast beeld van de primaire cultuur 5 dagen na de plating. De cultuur lijkt veel meer geavanceerd, met een neuronale extensies (kleine pijlen), neuronale clusters (grote pijlpunten) en spieren (middelgrote pijl). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeelden van primaire cellen behandeld met dsRNA's gekweekt in een 384-wells plaat Primaire cellen werden geïsoleerd uit de embryo's met Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP transgenen, waarin Dmef2-Gal4 en D42-Gal4 rijden expressie van mito-GFP in de spieren en motorische neuronen, respectievelijk. De cellen werden behandeld met dsRNA's gericht op zowel lacZ (AC) of opgeblazen (indien) (DF). Zowel primaire spieren en neuronen kan worden gezien door GFP (A, C, D, F). De witte pijlen wijzen naar de neuronale extensies. Phalloidin kleuring van actine (pijlpunten) toont een tak-achtige spier structuur in de cultuur die werden behandeld met lacZ dsRNA's (B en C), maar round-up spier morfologie in de cultuur die behandeld worden met als dsRNA's (E en F). In de samengevoegde foto's (C, F), zijn spieren gekleurd geel, maar rood negatieve shows neuronen en hun extensies (witte pijlen). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Confocale microscopie van de primaire spieren gekweekt op menselijke vitronectine gecoate afdekglas dia's Primaire spieren waren immunofluorescently gekleurd met anti-Drosophila titine (KZ) (rood in de samen te voegen) en met phalloidin voor actine (groen in de samen te voegen). De bovenste panelen zijn de wild-type controle spier-en onderkant daarvan zijn de Sals (CG31374) RNAi spier met verkorte sarcomeren.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

De ontwikkeling patroon van primaire culturen van Drosophila-cellen kan sterk variëren, mogelijk als gevolg van de verschillende variabelen tijdens de primaire cel voorbereidingsproces. Allereerst vliegen gebruikt voor eieren leggen moet worden jonge (binnen een week oud) en gezond (vrij van virale of bacteriële infectie). Onbevruchte of geïnfecteerde embryo&#39;s moet worden vermeden, want ze zijn nutteloos en cellen afkomstig van die embryo&#39;s niet kan onderscheiden en zal alleen overleven voor 1-2 dagen. ...

<table><tbody><tr><td>Shields and Sang M3 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>Insuline uit runderpancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Grote kooien voor embryoverzameling</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>#25 US standaard testzeef</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>#45 US standaard testzeef</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>#120 US standaard testzeef</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Dounce weefselmaler, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Dounce weefselmaler, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Dounce weefselmaler, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 384-well plaat</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

primaire celculturen van drosophila gastrula embryo&#39;s

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Hier beschrijven we een methode voor het bereiden en het kweken van primaire cellen los te zien van Drosophila gastrula embryo&#39;s. Kortom, een grote hoeveelheid geënsceneerde embryo&#39;s van jonge en gezonde vliegen zijn verzameld, gesteriliseerd en vervolgens fysiek gescheiden in een enkele celsuspensie met een glazen homogenisator. Na te zijn uitgeplaat op kweekplaten of kamer dia&#39;s op een passende dichtheid in een kweekmedium, kunnen deze cellen verder te differentiëren in verschillende morfologisch-verschillende soorten cellen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun specifieke cel-markers. Daarnaast presenteren we de voorwaarden voor de behandeling van deze cellen met dubbelstrengs (ds) RNA&#39;s tot gen knockdown te lokken. Efficiënte RNAi in Drosophila primaire cellen wordt bereikt door simpelweg het wassen van de cellen in dsRNA-bevattende kweekmedium. De mogelijkheid om uitvoering van een doeltreffend RNAi verstoringen, samen met andere moleculaire, biochemische, cell imaging analyses, zal een groot aantal vragen worden beantwoord in Drosophila primaire cellen, in het bijzonder die met betrekking tot gedifferentieerde spier-en neuronale cellen.

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los van<em&gt; Drosophil</em&gt; Een embryo&#39;s. De mogelijkheid om het uitvoeren van de effectieve RNAi verstoring, samen met andere moleculaire, biochemische en cell imaging methoden zal een aantal vragen die moeten worden aangepakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Primaire cellen.

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo&#39;s

Hier beschrijven wij een methode voor het prepareren en kweken van primaire cellen die zijn gedissocieerd uit gastrula-embryo's van Drosophila. Kort samengevat wordt een grote hoeveelheid gestageerde ...

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe primaire cellen, gedissocieerd uit drosophila-embryo's, kunnen worden voorbereid voor RNAi- en celbeeldingsanalyse. Dit wordt bereikt door eerst vliegenkooien voor te bereiden. Vervolgens worden synchrone embryo's verzameld, gewassen en gehomogeniseerd om de cellen te dissociëren.De primaire cellen worden vervolgens geplate en getransfecteerd met RNAi-constructen. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen via immunofluorescentiemicroscopie die de effecten van RNAi op gedifferentieerde primaire cellen tonen. Mijn naam is Namo.Ik ben professor aan de afdeling Genetica van de Harvard Medical School en onderzoeker bij het Overuse Medical Institute. Vandaag gaan ik, Jonathan, een fellow in het laboratorium, samen met een voormalig pro-fellow in het laboratorium, u de techniek introduceren voor het genereren van primaire cellen uit oph-gas of embryo's. Deze techniek is belangrijk voor een aantal toepassingen in de cel- en ontwikkelingsbiologie en, zoals Janu een paar jaar geleden liet zien, kan de methodologie in het bijzonder worden gebruikt voor genoombrede AI-screens in primaire spiercellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de analyse van gevestigde geïmmortaliseerde cellijnen, is dat primaire celkweek de biologie van het organisme nauwkeuriger weerspiegelt. Over het algemeen zullen personen die deze methode toepassen er moeite mee hebben, omdat verschillende stappen niet eenvoudig kunnen worden geleerd door het protocol te lezen. Om gedode gistpasta te bereuren, moet men eerst korrelvormige, levende gist met een koffiemolentje tot een fijn poeder malen, dit vervolgens in een bekerglas plaatsen en autoclaveren met een droge cyclus van 20 minuten. Direct na het autoclaveren.Voeg voldoende steriel heet water toe aan de gist om een pasta met de consistentie van tandpasta te maken. Om primaire cellen te prepareren die gedissocieerd zijn uit vliegenembryo's, kweek een wild-type stam van Drosophila, zoals Oregon R, in verse vliegenflesjes en breng pas uitgekomen vliegen over naar grote kooien voor embryoverzameling of vliegenpopulatiekooien. Verplaats de kooien vervolgens naar een ruimte van ongeveer 25 °C en 65% luchtvochtigheid met een licht-donkercyclus van 12 uur en voer de vliegen dood voer, om de verzameling van synchrone embryo's te vergemakkelijken.Gistpasta uitgestreken op melasseplaten. Vervang de voedingsplaten eenmaal per dag gedurende twee tot drie dagen. Voed de vliegen op de dag van de primaire celpreparatie met verse platen voor een pre-lay-periode van één tot twee uur.Vlak voor de 12-uurs donkere cyclus worden de pre-leg platen vervangen door verse melasseplaten, geënt met een minimale hoeveelheid gistpasta. Verwijder de eerdere collectie, aangezien deze asynchrone oudere embryo's bevat.Verzamel de embryo's gedurende een periode van één tot twee uur. Verwijder de platen die de relatief synchrone populatie embryo's bevatten en bewaar deze vijf tot zes uur bij 25 °C. Op dit moment bevinden de embryo's zich in het gevorderde gastrulatiestadium om te worden verzameld.Gebruik na de incubatie van vijf tot zes uur een natte kwast om ze los te maken van de platen. Plaats ze vervolgens in een reeks gestapelde zeven en spoel ze grondig af om zoveel mogelijk gist en vliegenresten te verwijderen, zodat de embryo's zich in de onderste zeef verzamelen.Kantel de zeef zodat de embryo's zich aan één zijde ophopen en spoel ze voorzichtig van de zeef af in een decoratiemandje. Steriliseer en coat de embryo's vervolgens door ze vijf tot 10 minuten te laten incuberen in 50% volume per volume bleekmiddel.Vul de homogenisator aan met medium op kamertemperatuur. Gebruik drie volumes medium om een concentratie te bereiken van maximaal 0,5 milliliter embryo's per 40 milliliter medium. Spoel vervolgens de embryo's van de wand van de mand af met 70% volume per volume ethanol.Spoel de embryo's grondig af met in de autoclaaf gedestilleerd water om het bleekmiddel en/of ethanol te verwijderen. Dompel de afgespoelde embryo's vervolgens onder in M3-medium. Laat de embryo's twee tot vijf minuten weken in een gesteriliseerde beker terwijl de embryo's incuberen; demonteer de decoratiemand en dep het NYX-gaas droog met gesteriliseerde papieren handdoeken.Nadat de embryo's in M three medium hebben geweekt, worden ze met een gesterild penseel overgebracht naar de homogenisator. Homogeniseer voorzichtig met korte slagen met een losse stamper en voorkom dat deze de bodem van de buis raakt; wanneer alle embryo's zijn gesuspendeerd, worden ze voorzichtig maar grondig gehomogeniseerd met acht volledige slagen. Draai de stamper niet terwijl deze op en neer beweegt. Breng het homogenizaat over in een steriele conische centrifugebuis van 50 milliliter, door te gieten of te pipetteren, en sluit de buis. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 40 cheese bij kamertemperatuur om het weefselresidu, grote celklonters en fetale membranen te pelletteren.Breng het supernatant met de cellen en het eigeel over naar een schone buis en herhaal de centrifugatiestap gedurende vijf minuten. Draag vervolgens het supernatant voorzichtig over door het in een schone buis te gieten of te pipetteren en centrifugeer 10 minuten bij 360 Gs bij kamertemperatuur om de cellen te pelletteren; gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 10 milliliters serumvrij kweekmedium voor RNAi-experimenten.Om de celdichtheid te schatten, telt u de levensvatbare cellen met een hemocytometer. Pelleteer vervolgens de cellen opnieuw bij 360 ×g. Resuspendeer de cellen in serumvrij M3-medium op een concentratie van 1 tot 5 × 10⁶ cellen per milliliter en zaai deze uit op 1,7 tot 2,5 × 10⁵ cellen per centimeter² in elke put van een 384-wells plaat.Dispenseer vijf µL dubbelstrengs RNA in de wellplaat tegen een eindconcentratie van ongeveer 250 ng per well. Gebruik een meerkanaals pipet om 10 µL van een suspensie van één tot vier × 10⁶ primaire cellen per mL in serumvrij M3-medium in elke well van de 384-wells plaat aan te brengen. Als alternatief kunnen cellen worden gekweekt op glazen chamber slides met acht wells voor confocale beeldvorming.Centrifugeer de platen gedurende één minuut bij 300 Gs bij kamertemperatuur. Bewaar de platen 22 uur bij 25 °C of één tot twee dagen bij 18 °C. Voeg aan elke plaat nog eens 30 µL serum toe dat M three kweekmedium bevat.Centrifugeer de platen vervolgens gedurende één minuut bij 300 Gs bij kamertemperatuur. Incubeer de primaire cellen nog vijf tot zeven dagen bij 25 °C in een vochtige kamer. Maak tot slot beelden van de cellen, hetzij levend, hetzij na immunofluorescentiekleuring.Onder optimale omstandigheden zullen de cellen en de cultuur er gezond uitzien. Met een ronde morfologie zal de cultuur weinig celresten bevatten en 50 tot 80% confluent zijn. Na het initiële uitplaten zullen de cellen morfologische veranderingen ondergaan en na ongeveer vijf tot acht dagen in cultuur bij 25 °C volledig gedifferentieerd zijn; deze brightfield-opname toont een voorbeeld van primaire cellen direct na het uitplaten.De meeste cellen zijn rond, intact en goed gescheiden 20 uur na het uitplaten. De primaire cellen vormen al clusters en spieren met een vertakte morfologie kunnen in dit stadium worden herkend. In deze fase zien contrastbeelden van primaire cellen die vijf dagen zijn gekweekt er veel verder ontwikkeld uit, met neurale uitlopers, neurale clusters en spieren.In deze voorbeelden werden primaire cellen geïsoleerd uit embryo's die de DMF two GAL four D 42 G four- en UAS mito GFP-transgenen bevatten, waarbij DMF two G four en D 42 G four respectievelijk de expressie van MIT GFP in spieren en motorneuronen aansturen; de cellen werden behandeld met dubbelstrengs RNA gericht tegen LA C of inflated. Deze fluorescentieafbeelding toont zowel gedifferentieerde primaire spieren als neuronen die GFP tot expressie brengen in de cultuur getransfecteerd met controle-dubbelstrengs RNA gericht tegen LA C; de witte pijl wijst naar neuronale uitlopers, terwijl de pijlspits wijst naar een vertakte spierstructuur. Wanneer de gedifferentieerde spier wordt gekleurd met Phin, vertoont meer dan de helft van de spieren een vertakte structuur, terwijl de rest een afgeronde morfologie vertoont.In de samengevoegde afbeelding zijn de spieren geel gekleurd en de neuronale structuren groen. Deze fluorescentie-afbeelding toont zowel gedifferentieerde primaire spieren als neuronen die GFP tot expressie brengen in de cultuur die dubbelstrengs RNA's bevat gericht tegen inflated; de witte pijl wijst naar neuronale uitlopers terwijl de pijlkop naar spieren wijst bij visualisatie met phin-kleuring. In tegenstelling tot de wildtype-controles die enkele vertakte spieren hebben, zijn alle spieren hier afgerond; in deze samengevoegde afbeelding zijn de spieren geel gekleurd terwijl de neuronale structuren groen zijn.Let op dat in deze cultuur, behandeld met dubbelstrengs RNA, slechts een afgeronde spiermorfologie te zien is. Hoewel de neuronale uitlopers vergelijkbaar lijken met die in wildtype-controles, tonen deze beelden primaire spiercellen die fluorescentieel zijn gekleurd met anti-drosophila titan in rood en Phalloidine dat actine in groen labelt. Deze panelen tonen wildtype-controle-spieren en deze representeren RNAi-behandelde spieren, die zich ontwikkelden tot spieren met verkorte sarcomeren.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het protocol consistent te volgen om vergelijkbare resultaten over uw experimenten te verkrijgen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen twee tot vier uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte Drosophila Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Dit protocol beschrijft de dissectie en cultivatie van intacte testikels en kiembaan-cysten uit Drosophila melanogaster poppen. Deze methode maakt microscopisch waarnemen van spermatogenese ex vivo mogelijk. Verder beschrijven we een farmacologisch assay van het effect van remmers op specifieke stadia van kiembaan-celontwikkeling in de testikels van de pop.

Ex vivo cultuur van Drosophila Pupal testis en Single Man Germ-lijn Cysten: Dissection, Imaging, en farmacologische behandeling

Hier beschrijven we een procedure om live beelden te maken van Drosophila gastrulatie. Dit heeft ons in staat gesteld om de apicale constrictie die betrokken is bij vroege ontwikkeling beter te begrijpen en verder mechanismen te analyseren die cellulaire bewegingen regelen tijdens modificatie van weefselstructuur.

Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Drosophila cellijnen zijn belangrijke reagentia voor zowel fundamenteel als biomedisch onderzoek. Dit artikel bevat de protocollen voor ontdooien, subcultuur en cryopreservatie van veelgebruikte Drosophila cellijnen aan onderzoekers helpen om het gebruik van deze reagentia in hun onderzoek op te nemen.

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Een langdurige conserveringsmethode voor Drosophila-stammen als alternatief voor de frequente overdracht van volwassen vliegen naar flesjes met vers voedsel is zeer wenselijk. Dit protocol beschrijft de cryopreservatie van Drosophila primordiale kiemcellen en de heropleving van stammen via hun transplantatie naar agametische gastheerembryo's.

Primordiale cryopreservatie van kiemcellen en heropleving van Drosophila-stammen

Leer primaire celculturen bereiden uit Drosophila embryo's voor RNAi en celbeeldvorming. Deze methode maakt effectieve genfunctie-analyse en immunofluorescentie-microscopie mogelijk.

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo's

Meer video's verkennen