Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Het algemene doel van het volgende experiment is het microfabriceren van apparaten die worden gebruikt om cellen in twee- en driedimensionale kweekomgevingen mechanisch te stimuleren. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een meerlaagse sandwich-giet- en stapeltechniek om een array van verticaal aangestuurde micropalen te produceren. In een tweede stap wordt de array van verticaal aangestuurde micropalen aangepast om een kweekfilm uit te rekken, waardoor goed gecontroleerde rekspanningen worden uitgeoefend op cellen die op de film zijn gekweekt.

Als alternatief kan de array worden aangepast om micropatroon-biomateriaalconstructen samen te persen om mechanische stimulatie op cellen toe te passen. Wanneer er wordt gekweekt in een array van driedimensionale hydrogelen, worden resultaten verkregen die de simultane toepassing van een reeks tweedimensionale echo-biaxiale en driedimensionale compressierekkingen over de array laten zien, gebaseerd op beeldanalyse van fluorescerende referentiemarkers. Hallo, ik ben Chris Mariahs van de laboratoria van Craig Simmons en U Sun van de afdeling Mechanical and Industrial Engineering en het Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering aan de Universiteit van Toronto.

Vandaag laten we u een procedure zien om micro-apparaten te vervaardigen die worden gebruikt om cellen mechanisch te stimuleren. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe cellen reageren op verschillende mechanische krachten in in vitro culturen. Laten we beginnen.

Het proces van de vervaardiging van de sandwichvorm omvat het plaatsen van een overheadtransparantie op onuitgehard polydimethylsiloxaan of PDMS op een SU-8 master. De sandwich wordt in een stapel van schuimglas en metaal geplaatst en onder compressie in een oven uitgehard. Tot slot wordt de stapel gedemonteerd en de transparantie afgepeld, waarbij de gepatroonde PDMS-laag behouden blijft.

Om dit proces te beginnen, mengt u PDMS, monomeer en crosslinker grondig. Breng bij de standaardverhouding van 10 op 1 drie milliliter van het ongeharde PDMS-mengsel aan op een eerder vervaardigde SU-8 master en ontgas het polymeer in een vacuümkamer. Plaats vervolgens het schuimkussen en de SU-8 master op een basisplaat van plexiglas.

Plaats voorzichtig de gladde kant van een inkjet-transparantie op de niet-uitgeharde PDMS, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen worden ingesloten. Plaats vervolgens een gesiloïseerde glasplaat bovenop de transparantie, onder het tweede schuimkussen en een bovenplaat van plexiglas. Klem de sandwich samen met een C-klem.

Hard het PDMS-sandwich uit in een oven bij 80 °C gedurende ten minste vier uur. Verwijder na het uitharden het sandwich uit de oven en laat het afkoelen. Verwijder zodra het is afgekoeld de klem en demonteer het sandwich.

Pel de transparantie voorzichtig los van de SU-8 master, terwijl de gepatenteerde PDMS-film behouden blijft. Trim de randen van de patroonfilm om overtollig PDMS te verwijderen en bewaar de patroonlagen in een stofvrije omgeving tot ze klaar zijn voor gebruik. Het volgende gedeelte van dit protocol betreft de constructie van een microgefabriceerde array van verticaal aangedreven posts.

Een meerlaags fabricageproces is vereist om de array van micropalts te maken. De onderste gepatteerde PDMS-laag wordt geprepareerd via sandwich-mallenfabricage. Voor deze experimenten werden cirkelvormige patronen gebruikt met een diameter variërend van 600 tot 1.200 microns.

Om de PDMS-laag over te brengen naar een schoon glazen objectglas, gebruikt u een corona-ontladingsunit om de PDMS- en glasoppervlakken te behandelen met zuurstofplasma. Breng vervolgens de twee oppervlakken met elkaar in contact. Plaats de stapel gedurende 10 minuten op een warmteplaat bij 80 °C om het bondingsproces te voltooien.

Pel de transparante folie eraf en gooi deze weg. Dit proces zorgt ervoor dat de gepatroneerde PDMS-film nooit wordt losgekoppeld van een star substraat, wat krimp van de individuele lagen voorkomt. De tweede sandwich-gevormde laag wordt gevormd als een negatieve replicatiematrijs van het gewenste diafragma en de poststructuur.

In deze demonstratie werden cirkelvormige palen met een diameter van 500 microns gebruikt om deze laag te vormen. Bevestig eerst de negatieve replica-mal tijdelijk aan een glasplaat met dubbelzijdige tape en siloïseer in een vacuümdesiccator; breng ongebonden PDMS aan op de sandwich-mal-laag, ontgas en spin-coat gedurende 45 seconden bij 1000 omwentelingen per minuut, wat resulteert in een actuatiediafragma van 60 microns dik. Laat de spin-gecoate PDMS-laag gedeeltelijk uitharden bij 80 °C gedurende ongeveer 20 minuten, of totdat de PDMS plakkerig is maar niet permanent vervormt bij aanraking. Verwijder de glasplaat en de dubbelzijdige tape van de gedeeltelijk uitgeharde PDMS-laag en de transparante film, bevestig deze aan een paar glazen hanteerplaten en behandel met plasma.

Behandel de gedeeltelijk uitgeharde PDMS, keer de PDMS vervolgens om en plaats deze in een op maat gemaakte uitlijner. De uitlijner bestaat uit een vacuümspanplaat die is gemonteerd op een micromanipulator. Behandel vervolgens de eerste PDMS-laag met plasma en plaats deze op een rotatietafel onder de vacuümspanplaat.

Observeer de uitlijning tussen de twee lagen met een machine vision-systeem van een avatar met 12x vergroting. Lijn de lagen uit met behulp van de manipulator en breng ze voorzichtig in contact. Oefen met een vinger lichte druk uit om de lagen aan elkaar te plakken.

Verwijder vervolgens de sandwich uit de uitlijner. Verwijder de glazen hanteerslides en zorg ervoor dat de lagen volledig contact met elkaar maken. Uitharden in een oven bij 80 °C gedurende nog eens 30 minuten.

Na 30 minuten kan de transparante en gesiliconeerde replica PDMS-mal van het apparaat worden gepeld en weggegooid. Het apparaat wordt vervolgens volledig uitgehard bij 80 °C gedurende ten minste vier uur om experimenten uit te voeren met cellen die zijn gekweekt op een vervormend tweedimensionaal substraat. De micro-actuatorarray wordt aangepast door een derde PDMS-laag aan het apparaat te hechten.

De derde PDMS-laag bestaat uit een tweelaagse structuur. De onderste cirkel komt overeen met de grootte van de actuatieholte onder de geactueerde micropalen. De diameter van de bovenste cirkel is 100 microns groter dan de diameter van de laadpalen.

Een microkanaal van 200 micron breed verbindt deze kenmerken met een aansluitingsgebied en zal worden gebruikt om de laadpalen en de cultuurfilm te smeren. Om het apparaat aan te passen voor 2D-cultuur, moeten eerst de connectoren worden gefabriceerd en aan het apparaat worden gebonden zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Breng vervolgens via spin-coating een laag PDMS van 10 tot 15 micron aan op de gladde zijde van een transparantie en laat deze uitharden.

De dunne PDMS-film bij 80 °C gedurende ten minste vier uur. De volgende stap is om een vacuüm aan te leggen bij de actuatoren en de PDMS-laag aan het apparaat te hechten. Om dit te bereiken.

Pas eerst een laag vacuüm toe op de actuatoren om de array van posts plasma treat and bond te laten zakken. Breng de spin-coated PDMS-film aan op het geactueerde micro-apparaat zoals beschreven in het schriftelijke protocol; de posts en de cultuurfilm blijven gedurende korte tijd hydrofiel. Sluit vervolgens de spuit met smeermiddel aan op het apparaat en vul de smeerkanalen met een oplossing van 90% glycerol in gedeïoniseerd water.

Naast smering behoudt deze formulering de hydrofiliteit van het PDMS onbeperkt, waardoor de wrijvingscoëfficiënten worden verlaagd. Plaats het apparaat op een warmteplaat bij 40 °C en blijf smeermiddel in het kanaal injecteren, waardoor een kleine drukverhoging ontstaat. Na enkele minuten zijn de luchtbellen door het PDMS gediffundeerd en zullen alle oppervlakken gesmeerd zijn.

Verwijder voor de laatste stap de negatieve druk en maak de palen los met een scalpel. Snijd rondom de dunne PDMS-film. Pel de transparante achterzijde voorzichtig los van de plasmaverbinding van het apparaat.

Een met de hand gesnedene PDMS-pakking rond het kweekgebied van het device. Steriliseer het device door het vijf minuten in 70% ethanol te weken, gevolgd door een behandeling onder een kiemdodend UV-licht in een biologische veiligheidskast gedurende 45 minuten. Behandel het oppervlak met plasma en incubeer het gedurende de nacht bij vier graden Celsius met 100 µg/mL collageen.

Na een incubatie van een nacht wordt het apparaat gewassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en worden cellen gezaaid met een dichtheid van 10 tot 15.000 cellen per vierkante centimeter. Volgens standaardprotocollen voor celkweek kan de micro-actuatorarray worden aangepast om experimenten uit te voeren met cellen die zijn gekweekt in driedimensionale, fotopatroon-hydrogelconstructen. Eerst wordt een meerlaags platform op basis van PDMS gefabriceerd.

Nadat het basisplatform met een meth is bedekt, wordt een bijbehorende hydrogel-precursoroplossing voor dekglasplaatjes geïnjecteerd. Vervolgens wordt een fotopolymeer reserveerbaar biomateriaal in het array gemicro-gepatteerd en wordt de resterende precursoroplossing weggespoeld. Het array van verticaal aangedreven belastingspalen kan vervolgens worden gebruikt om compressieve mechanische krachten uit te oefenen op cellen die zijn gekweekt in driedimensionale biomaterialen, waarbij stukjes schilderstape de gebieden rond de palen maskeren om het apparaat te coaten met paraline C in een PDS 2010 lab COTER two-systeem.

Dit zal de polymerisatiekinetiek voor het biomateriaalsysteem verbeteren. Verwijder het apparaat na het coaten uit het coatingsysteem en trek de plakband eraf, zodat er een conforme laag paryleen C over de posts achterblijft. Methacrylateer vervolgens het ACRL-glasdekglaasje door onderdompeling in een 2% volume/volume oplossing van trimethoxy(propyl)silaan-methacrylaat in 95% ethanol gedurende twee minuten.

Spoel het dekglas. Dompel het in 100% ethanol en bak het vervolgens bij 100 °C, zodat er methacrylaatgroepen op het oppervlak achterblijven. Giet een 200 micron dikke PDMS-afstandhouder.

Bekleed een Petrischaal met folie en snijd deze in kleine secties. Bond vier van deze kleine secties met plasma rond de rand van het meac-gerelateerde dekglas. Bond vervolgens de tussenruimtes met plasma aan de PDMS-gebieden van het device dat de Lene C-coating bedekt.

Steriliseer tot slot het apparaat door het te wassen in 70% ethanol en stel het gedurende 45 minuten bloot aan een kiemdodend middel of UV-licht in een biologische veiligheidskast. Om de celhoudende PEG-hydrogels via fotolithografie in de apparaten te patrooneren, bereidt u de precursor- en foto-initiatoroplossingen voor zoals beschreven in het geschreven protocol en mengt u deze grondig om een oplossing te verkrijgen met een concentratie van 0,4% gewicht per volume foto-initiator.

Filter het mengsel door een spuitfilter van 0,45 micron om te steriliseren en particulaten te verwijderen, trypsiniseer de celculturen en bereid een celsuspensie in kweekmedium voor met een tweemaal zo hoge celconcentratie als de gewenste eindconcentratie. Meng vervolgens de celsuspensie en de gefilterde hydrogel-precursor fotostarteroplossing in een verhouding van één-op-één. Injecteer de oplossing in het micro-apparaat met behulp van een lange naald van gauge 25.

Voorkom zorgvuldig dat er luchtbellen in het apparaat gevangen raken. Lijn een geprinte transparante masker uit op de uitlijnmarkeringen op het oppervlak van het apparaat. Stel een UV-belichtingssysteem in om een UV-dosis met een golflengte van 365 nanometer van 17,5 milliwatt per vierkante centimeter op het oppervlak van het apparaat te leveren.

Bestraal de hydrogel door het masker gedurende 195 seconden na de initiële belichting. Was de niet-gepolymeriseerde hydrogelprecursoroplossing weg met PBS en vervang de PBS door cultuurmedium; activeer de belastingspalen om de hydrogelconstructen samen te persen. Hier wordt een voltooid voorbeeldapparaat voor 2D mechano-stimulerende cultuur getoond.

Rode kleurstof wordt gebruikt om de kanalen voor de toevoer van actuatiedruk te markeren en blauwe kleurstof wordt gebruikt om de smeerkanalen voor rekkarakterisering te markeren. Experimenten kunnen worden gebruikt om toegepaste rekvelden te bepalen door de beweging van fluorescente kraaltjes op de substraten te volgen. Rode stippen vertegenwoordigen de oorspronkelijke positie van de kraaltjes, terwijl groene stippen de vervormde posities vertegenwoordigen.

Een voorbeeldapparaat voor driedimensionale compressie-experimenten is hier te zien, waarbij groene kleurstof is gebruikt om de actuatiedrukkanalen te markeren. Het bovenaanzicht van de micro-post array onthult het hydrogelconstruct dat bovenop de posts is gepatroneerd, samen met gereconstrueerde beelden van fluorescente beads in het hydrogelconstruct vanaf de zijkant van de posts. De beelden bij rust en bij actuatiedrukken van 55 kilo pascal demonstreren het proces van rekkarakterisering in een driedimensionaal cultuursysteem.

We hebben zojuist aangetoond hoe u apparaten kunt vervaardigen die worden gebruikt om cellen mechanisch te stimuleren in zowel twee- als driedimensionale culturesystemen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u uw apparaten zo schoon en stofvrij mogelijk houdt en geduldig bent, vooral tijdens de uitlijningsstappen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.