Name: Antigen Specifieke In Vivo Killing Assay met behulp van CFSE Labeled doelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer een CFSE-gebaseerde in vivo cytotoxiciteitsassay om de functionele kwaliteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen in muizen te meten via flowcytometrie. Deze methode onderscheidt T-celhoeveelheid van cytotoxische capaciteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ik wil Bianca Mothe, Carla Oseroff, en Marie-France DelGuercio bedanken voor de invoering van mij om immunologische assays en muis hanteren. Werken in het lab van GA Splitter wordt gefinancierd door NIH subsidie ​​1-RO1-AI-073558, GLRCE subsidie ​​1-U54-AI-057153, en BARD VS-3829-06.

1. Uitlokken van Target-specifieke CTL's Effector door immunisatie (Day 0) <ol><li> Voordat u begint, beslissen over een specifieke effector: target-systeem. In dit voorbeeld van een klassieke in-vivo-CTL-test, zullen we gebruik maken van een gezuiverd peptide immunisatie specifieke CD8 + T-cellen te lokken. Hetzelfde peptide zal worden gebruikt om de syngene doelcellen pols, het creëren van een specifieke effector: target-systeem. Als alternatief kunt u ervoor kiezen om hele pathogeen of eiwit te gebruiken om uw specifieke effectoren en doelstellingen te verkrijgen. </li><li> Ontsmet het werkoppervlak binnenkant van een bioveiligheid kap om de steriliteit van de injecties te verzekeren. Bereid de peptide immunisatie door eerst 50 ug van gezuiverd peptide in 100 pi 10% DMSO in PBS / muis in een 2 ml buis. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid van zeer koud Incompleet Freund's adjuvans en tot aan de 0,2 ml markering met 1 mm kralen voor het mengen. Vanaf dit punt, blijf immunogeen op ijs tot injectie. Veilig deksel met Parafilm. </li><li> Gebruik een kraal beater op maximum toerental aan de emulsie gedurende 3 minuten mengen, meteen het plaatsen van de emulsie weer op het ijs na het mengen. De resulterende emulsie dient van een vergelijkbare consistentie mayonaise. Laat emulsie te zitten bij 4 ° C gedurende de nacht als de tijd het toelaat (tot een week), mengen verder als een scheiding wordt opgemerkt. </li><li> Gebruik een 1 ml spuit en 20 of 20,5 gauge naald te trekken emulsie en voorzichtig om niet trekken geen kralen (beads moet groter zijn dan gauge van de naald, maar nog steeds op de hoogte). </li><li> Veilige muis voor subcutane injectie aan de basis van de staart. We maken gebruik van een aangepaste plastic 50 ml conische buis om veilig en voorzichtig immobiliseren de muis voor injectie. Injecteer de muis met 0,2 ml emulsie. </li></ol> 2. Oogsten doelcellen (Dag 8) <ol><li> U moet naïeve syngene muizen voor uw doelgroep cellen. Euthanaseren naïeve muizen volgens AAALAC normen. </li><li> Desinfecteer de muis door het sproeien van 70% ethanol om de kans op besmetting van muis haar of andere externe verontreinigingen te minimaliseren. </li><li> Met behulp van dissectie schaar maken kleine knip door de huid aan de linkerkant van de muis. Trek de huid flap naar peritoneale sac en interne organen bloot te leggen. </li><li> Snip via het buikvlies, dat evenwel niet tot een van de onderliggende organen compromis. De milt is dicht bij het oppervlak en is vergelijkbaar in kleur naar de lever (donker rood), maar kleiner en nieren bonen in vorm. Geïnfecteerde muizen vertonen over het algemeen met name groter dan de milt niet-geïnfecteerde controle. </li><li> Trek de milt, en zorg ervoor dat zacht, zodat er geen de milt te breken in meerdere stukken om een ​​maximale cel aantallen te herstellen. Onmiddellijk plaats van de milt in een 15 ml conische met 10 ml van de bereide media op ijs. Ga verder met de resterende muizen. </li><li> Giet de inhoud van de 15 mL conische buis (media en milt) in een glas weefsel slijpmachine. Maal de milt met behulp van tal van bovenarm kracht. Als alle weefsel heeft zijn kleur verloren kun je ervan uitgaan dat u alle cellen teruggewonnen uit van het bindweefsel. </li><li> Giet de inhoud van de molen door een 70 um cel filter in een 50 ml conische buis. Spoel grinder met vers medium en giet door een zeef cel. </li><li> Centrifugeer bij 4 ° C, 1300 RPM voor 7 minuten. Giet af supernatant. </li><li> Resuspendeer in 10 ml van de bereide lyserend reagens en incubeer bij 37 ° C gedurende 7 minuten. </li><li> Voeg tot 50 ml met verse media en centrifuge, hetzelfde als hierboven. </li><li> Resuspendeer in 50 ml vers medium en de centrifuge, hetzelfde als hierboven (wasstap). * Opmerking: op dit moment kunt u een magnetische cel scheiding voor een bepaald celtype (dat wil zeggen macrofagen) uit te voeren als een pure doelcel bevolking is gewenst voor overdracht naar ontvangende muizen. Ook op dit moment kun je introduceren een experimentele behandeling in de cultuur om de effecten van die behandeling op het doden van cel-specifieke studie. </li><li> Tellen cellen en plaat 1 x 10 7 per putje in 100μL in een 96 ronde bodem goed weefselkweek behandeld plaat. * Dit is een hoge concentratie van cellen / putje, maar omdat de test is een snelle een, we hebben gezien geen verlies van de levensvatbaarheid van de cellen bij deze concentratie. </li></ol> 3. Behandeling en etikettering van doelwitcellen <ol><li> Pulse juiste cellen en repliceert met de pathogeen specifieke peptide of irrelevant peptide controle: Voeg 1 ug / ml peptide. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1,5 uur. Ga naar 37 ° C incubator voor de laatste 30 minuten. Gedurende deze tijd voor te bereiden CFSE reagens. </li><li> Bereid CFSE volgens de specificaties van de fabrikant en verdun het tot een werkende concentratie tussen 0,5 en 25 uM. Maak "laag" concentratie 10x lager dan "hoge" concentratie CFSE. Bijvoorbeeld, voor [laag] 0,5 pi CFSE toe te voegen aan 10 ml PBS en voor [high], 5 ui CFSE toe te voegen aan 10 ml PBS. Warm bereid CFSE tot 37 ° C voor de etikettering. </li><li> Verwijder de plaat van cellen van de incubator en pellet in een hoge snelheid centrifuge bij kamertemperatuur, 1300 RPM voor 7 minuten. Flick te verwijderen supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in een van beide [laag] of [HIGH] CFSE door het toevoegen van 200 pi van de juiste reagens om de bijbehorende putten en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de plaat van cellen van de incubator en opnieuw pellet bij kamertemperatuur, 1300 RPM voor 7 minuten. Flick te verwijderen supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 ul / putje van opgewarmde verse media en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de plaat van cellen van de incubator en pellet bij kamertemperatuur, 1300 RPM voor 7 minuten. Flick te verwijderen supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul / well PBS. </li><li> Voor adoptieve overdracht, voeg een goed [laag] gelabelde cellen om een ​​goed [high] gelabelde cellen per muis. Resulterende injectie moet worden 50% van specifieke doelen en 50% irrelevant cellen in 0,2 ml. </li><li> Vergeet niet om vernietiging van een aantal gelabelde cellen als uw niet-overgedragen controles act tijdens de data-analyse en voor het rijden op de flowcytometer (zie figuur 1). </li></ol> 4. Adoptieve overdracht <ol><li> Verdoven eerder peptide geïmmuniseerde muizen (Van deel # 1 van dit protocol) volgens AAALAC normen. </li><li> Injecteer 0,2 ml van gemerkte doelcellen via retro-orbitale route in de ontvangende muizen. </li><li> Wacht 6 uur of een andere vooraf bepaalde optimale tijd voor euthanasie van de ontvanger muizen. </li></ol> 5. Oogsten gelabelde cellen * Opmerking: De stappen 5.1 tot 5.11 zijn hetzelfde als de stappen 2.1 tot en met 2.11 <ol start="12"><li> Tellen cellen en plaat uit op 1 x 10 6 per putje in 100 ul in 96 goed met ronde bodem weefselkweek behandeld plaat. </li><li> Fix herstelde en de niet overgedragen cellen door toevoeging van 100 ul 2% paraformaldehyde tot een uiteindelijke concentratie van 1% paraformaldehyde aan alle putjes. </li></ol> 6. Flowcytometrie en data-analyse <ol><li> Lopen monsters op een flowcytometer en de gegevens analyseren. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Een afnemende epitoop specifiek piek op de resulterende histogram is een indicator van de cel specifieke doden (figuur 1). Gebruik de volgende vergelijkingen (toegepast in tabel 1) om de werkelijke waarde van de cel specifieke lysis te bepalen: Ratio = Irrelevante Percentage: Epitoop bepaald percentage ([laag] peak: [hoog] piek), Percentage Specifieke Lysis = [1 - (Non-controle overgebracht ratio / Experimentele ratio)] x 100 <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. CFSE profiel van herstelde BALB / c muis splenocyten. Getallen geven het percentage van cellen van de hoge of lage CFSE fenotype. A) Niet-overgedragen controle. Alle [high] CFSE pieken vertegenwoordigen epitoop specifieke doelgroepen cellen, terwijl [laag] CFSE pieken bevat streefdata gepulst met irrelevante peptide. B) CFSE gelabelde cellen hersteld van PBS geïmmuniseerde ontvanger muis (Control). C) CFSE gelabelde cellen hersteld van twee verschillende peptide specifieke ontvanger muizen, let op de verminderde epitoop specifieke pieken. <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Grafische weergave van de geanalyseerde gegevens. Drie datapunten getoond voor elke groep van muizen, PBS, Peptide A en B. Peptide <table border="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td> CFSE HOOG% Epitoop Pulsed </td><td> CFSE LAAG% Irrelevant </td><td> Ratio Laag: Hoog </td><td> Procent Epitoop Specifieke Killing </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 42,8 </td><td> 57,2 </td><td> 1.34 </td><td> 16,97 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 43,1 </td><td> 56,9 </td><td> 1.32 </td><td> 15,94 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 44,3 </td><td> 55,7 </td><td> 1.26 </td><td> 11,74 </td></tr><tr><td> Peptide A </td><td> 39,7 </td><td> 60,3 </td><td> 1.52 </td><td> 32,56 </td></tr><tr><td> Peptide A </td><td> 38,6 </td><td> 61,4 </td><td> 1.59 </td><td> 35,61 </td></tr><tr><td> Peptide A </td><td> 40,6 </td><td> 59,4 </td><td> 1.46 </td><td> 29,99 </td></tr><tr><td> Peptide B </td><td> 38,7 </td><td> 61,3 </td><td> 1.58 </td><td> 24,68 </td></tr><tr><td> Peptide B </td><td> 38,5 </td><td> 61,5 </td><td> 1.60 </td><td> 25,32 </td></tr><tr><td> Peptide B </td><td> 39,3 </td><td> 60,7 </td><td> 1.54 </td><td> 22,76 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS NT Controle </td><td> 47,4 </td><td> 52,6 </td> 1.11 <td></td></tr><tr><td> Pep Een NT controle </td><td> 49,4 </td><td> 50,6 </td><td> 1.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pep B NT Controle </td><td> 45,6 </td><td> 54,4 </td><td> 1.19 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Analyse van representatieve gegevens. "NT" is niet overgedragen.

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Wisconsin-Madison in te stellen.

Deze test kan worden aangepast aan de proliferatieve capaciteit van de cellen, met inbegrip klonale expansie te onderzoeken, omdat CFSE verdeelt relatief gelijkelijk over nageslacht 10,11. Het is ook mogelijk om CFSE labeling gebruiken om celmigratie 6,12 onderzoeken, maar er zijn ook andere cel tracing methoden die kunnen meer passend zijn, afhankelijk van uw hypothese, bijvoorbeeld tetrameren en bioluminescentie 13, die ook kan worden gecombineerd met CFSE labeling. <p class="jove_...

<table><tbody><tr><td>glazen kralen van 1 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>celzeef van 70 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Adjulite Incomplete Freund&amp;rsquo;s Adjuvans</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>FC 500 Flowcytometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kontes glazen weefselmaler</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PharmLyse lysisreagens</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFSE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

antigen specifieke in vivo killing assay met behulp van cfse labeled doelcellen

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFSE) kan worden gebruikt om eenvoudig en snel het etiket een cel populatie van belang zijn voor in vivo onderzoek. Deze etikettering is klassiek is gebruikt om de proliferatie en migratie te bestuderen. In de hier gepresenteerde methode, hebben we verkort de tijdlijn na adoptieve overdracht om te kijken naar overleving en doden van epitoop specifieke CFSE gelabelde doelcellen 4-6. Het niveau van specifieke doden van een CD8 + T-cel-kloon kan duiden op de kwaliteit van de reactie, aangezien hun hoeveelheid kan misleidend zijn. Specifieke CD8 + T-cellen kunnen functioneel uitgeput raken na verloop van tijd met een daling van de cytokine productie en het doden van 7,8. Ook kunnen bepaalde CD8 + T cel klonen niet zo goed als anderen te doden met verschillende TCR specifieke 9. Voor een effectieve cel gemedieerde immuniteit (CMI), moet antigenen worden geïdentificeerd die produceren niet alleen een voldoende aantal te reageren T-cellen, maar ook functioneel robuuste reageren T-cellen. Hier beoordelen we het percentage celspecifieke moord op twee peptide specifieke T-cel klonen in BALB / c muizen.

Veel infecties roepen een sterke CTL-respons, maar af en toe, de hoeveelheid cellen die reageren niet correleren met de controle van de ziekteverwekker<sup&gt; 1</sup&gt;. Een maat van CTL kwaliteit is hun vermogen om specifiek te doden<sup&gt; 2</sup&gt;. CFSE labeling van target cellen kunnen worden gebruikt om deze CTL-respons kwaliteit te onderzoeken<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

Antigen Specifieke In Vivo Killing Assay met behulp van CFSE Labeled doelcellen

Carboxyfluoresceïne-diacetaat-succinimidylester (CFSE) kan worden gebruikt om eenvoudig en snel een celpopulatie van belang te labelen voor in vivo onderzoek. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de functionele kwaliteit van CD8-positieve T-cellen in reactie op een specifiek antigeen te beoordelen door hun vermogen om doelcellen in vivo te doden te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst antigeenspecifieke effector CD8-positieve T-cellen op te wekken door recipientmuizen te immuniseren. Als tweede stap krijgen primaire doelcellen specificiteit of worden ze op een andere manier behandeld, waarmee de creatie van het specifieke effector-doelsysteem wordt voltooid.Vervolgens worden de doelcellen via retro-orbitale adoptieve transfer toegediend aan de recipiënte muizen. Om de effector-killing in vivo te onderzoeken, zijn resultaten verkregen die aantonen of de effectoren doelcellen hebben gedood, op basis van flowcytometrische analyse van CF SE-gekleurde cellen. Hoi, mijn naam is Marina Ward.Ik ben een promovendus in het laboratorium van Gary Splitter aan de University of Wisconsin Madison. Deze methode biedt inzicht in CTL-killing en kan ook worden toegepast op celproliferatie en overleving. De procedure voor adoptieve transfer wordt gedemonstreerd door Dr. Jerome Harms, een wetenschapper uit mijn laboratorium. Begin strategisch door een specifiek effector-doelsysteem te definiëren.Bijvoorbeeld, in een klassieke in vivo CTL-assay wordt een gezuiverde peptide-immunisatie gebruikt om specifieke CD8-positieve T-cellen op te wekken; gebruik hetzelfde peptide om de syngene targetcellen te pulseren, waardoor er een specifiek effect-target-systeem ontstaat. Decontamineer het werkoppervlak van een veiligheidskast om de steriliteit van de injecties te waarborgen. Bereid de peptide-immunisatie voor door deze eerst in een buisje van 2 ml te plaatsen.50 micrograms gezuiverd peptide in 100 microliters 10% DMSO in PBS per muis. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid zeer koude, incomplete vrije unju toe met beads van één millimeter voor het mengen. Sluit het buisdeksel af met parafilm en bewaar het immunogeen op ijs tot de injectie.Gebruik een bead beater ingesteld op het maximale aantal omwentelingen per minuut om de emulsie gedurende drie minuten te mengen, waarbij de emulsie direct na het mengen terug op ijs wordt geplaatst. De resulterende emulsie moet een consistentie hebben die vergelijkbaar is met mayonaise. Laat de emulsie een nacht of tot een week bij 4 °C staan; meng de emulsie opnieuw indien er scheiding wordt waargenomen op het moment van immunisatie.Identificeer de muizen voor dit deel van het experiment. Gebruik een spuit van one milliliter en een naald van 20 gauge om de emulsie op te zuigen. Zorg ervoor dat er geen kraaltjes worden opgezogen, teneinde de doelcellen voor te bereiden.Naïve syngene syngene muizen worden gebruikt om deze naïve muizen te eutanaseren, conform de door A-A-A-L-A-C goedgekeurde standaarden. Spray het relevante gebied van de muis met 70% ethanol om de kans op contaminatie door muis, haar of andere externe verontreinigingen te minimaliseren. Maak met dissectieschaars een kleine snede door de huid aan de linkerzijde van de muis.Trek de huidflap opzij om de peritoneale zak en de interne organen bloot te leggen. Snijd door het peritoneum, waarbij u er zorg voor draagt dat de onderliggende organen niet worden beschadigd. Lokaliseer de milt, die zich dicht bij het oppervlak bevindt en donkerrood van kleur is.Verwijder voorzichtig de milt en plaats deze onmiddellijk in een conische buis van 15 milliliter die 10 milliliter voorbereid RPMI-medium op ijs bevat. Herhaal dit voor de overige muizen. Overbreng de milt en het medium naar een glazen weefselhomogenisator.Maal de milt totdat al het weefsel zijn kleur heeft verloren. Giet de gehomogeniseerde producten door een celzeef van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter. Spoel de homogenisator één keer met vers medium en voeg dit toe aan het milt-homogenaat door het door de filter te gieten; centrifugeer de monsters bij vier graden Celsius en 1.300 toeren per minuut.Decanteer en gooi het supernatant na zeven minuten weg. Resuspendeer de celpellet in 10 milliliters lysisreagentia en incubeer gedurende zeven minuten bij 37 degrees Celsius. Vul aan tot 50 milliliters met vers medium en oogst de cellen door centrifugatie.Herhaal deze wasstap. Tel de cellen en verdeel 10 miljoen cellen per putje in een 96-wells ronde bodem weefselkweekplaat.Incubeer gedurende anderhalf uur bij 4 °C. Verplaats de monsters voor de laatste 30 minuten naar de incubator bij 37 °C. Bereid vers CFSE-reagens volgens de instructies van de fabrikant en verdun dit tot een werkconcentratie van tussen 0,5 en 25 µM.Maak twee CFSE-oplossingen met een concentratie die tienvoudig verschilt. Equilibreer deze CFSE-oplossingen met lage en hoge concentratie naar 37 °C vóór het labelen. Haal de 96-wells plaat met doelcellen uit de incubator en pellet de cellen door centrifugatie.Tik bij kamertemperatuur tegen de plaat om het supernatant te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 200 µL van de CFSE-oplossing (lage of hoge concentratie) en incubeer deze gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 °C. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij kamertemperatuur, tik tegen de plaat om het supernatant te verwijderen en resuspendeer de cellen in 200 µL vers medium; incubeer deze vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C. Pelleteer de cellen opnieuw door centrifugatie, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 50 µL PBS. Zet een deel van de gelabelde cellen apart als controles voor niet-transfer tijdens de data-analyse en voor gebruik in de flowcytometer voor de adoptieve transfer.Voeg per muis één well met CFSE-gelabelde cellen in lage concentratie toe aan één well met CFSE-gelabelde cellen in hoge concentratie. De resulterende injectie bestaat zo uit 50% specifieke targets en 50% irrelevante cellen in 0,1 milliliter. Om de adoptieve transfer te vergemakkelijken, worden de met peptide geïmmuniseerde muizen geanestheseerd, waarna 0,1 milliliter gelabelde targetcellen via een retro-orbitale route in de ontvanger wordt geïnjecteerd.Euthanaseer de ontvanger-muizen na zes uur voor het oogsten van cellen, isoleer de milt van de muis en zuiver de celpopulatie volgens hetzelfde gebruikte protocol. Bij het voorbereiden van de doelwit miltcellen, plaatst u cellen in een dichtheid van 1 miljoen per well in een 96-wells ronde bodem weefselkweekplaat, fixeert u de teruggewonnen en niet overgedragen cellen met paraformaldehyde, analyseert u de monsters met een flowcytometer en analyseert u de gegevens. De typische presentatie van de resultaten van cel-specifieke doding wordt op twee manieren weergegeven.Een verminderde epitoo-specifieke piek op het fax-histogram en de berekende waarde vormen de cel-specifieke lysis. Hier geven de getallen het percentage cellen van het hoge of lage CFSE-fenotype aan in niet-getransfereerde controle-CFSE-gelabelde cellen herwonnen uit een met PBS geïmmuniseerde recipientmuis en CFSE-gelabelde cellen herwonnen uit twee verschillende peptide-specifieke recipientmuizen. Let op de verminderde epitoo-specifieke pieken die wijzen op cel-specifieke doding.Als alternatief kunnen de resultaten grafisch worden weergegeven om de celspecifieke lysis voor elke groep muizen aan te geven: PBS, peptide A en peptide B. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u uw eigen in vivo CTL-killing assay met muizen kunt ontwikkelen.

antigen-specific-in-vivo-killing-assay-using-cfse-labeled-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

CFSE labels covalent langlevende intracellulaire moleculen met de fluorescente kleurstof, carboxyfluoresceïne. Als zodanig, als een CFSE-gelabelde cel zich deelt, zijn nakomelingen hebben de helft van de fluorescentie, die daarmee kan worden gebruikt om de celdeling te beoordelen. Dit artikel beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor het labelen muis lymfocyten met CFSE.

Het gebruik van carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFSE) om lymfocytproliferatie Monitor

Een eenvoudige protocol voor het bereiden van extracten van menselijke weefsels worden gebruikt als bron van antigenen in functionele T-cel-assays beschreven. Deze methode laat T-cel responsen op weefsel afgeleide antigenen te...

Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen

The video showcases a flow cytometry-based assay for assaying immunodominance in cytotoxic T lymphocytes or CTL responses. Injected fluorescent target cells exhibit varying fluorescence corresponding to immunogenic epitopes. Post-spleen collection and sorting reveal a reduction in high-intensity fluorescent cells, confirming immunodominance in CTL responses.

An Assay to Evaluate Immunodominance in Cytotoxic T Lymphocyte Responses

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die&gt; 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

Het doel van dit protocol is dat voor de opsporing van in vivo antigeen-specifieke doden van een cel in een lymfkliertest model.

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Gepresenteerd hier is een protocol voor het meten van prolifererende CD4+ T cellen in reactie op antigene eiwitten of peptiden met behulp van kleurstof verdunning. Deze bepaling is bijzonder gevoelig voor zeldzame antigeen-specifieke T-cellen en kan worden gewijzigd om het klonen van antigeen-specifieke cellen te vergemakkelijken.

Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer een CFSE-gebaseerde in vivo cytotoxiciteitsassay om de functionele kwaliteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen in muizen te meten via flowcytometrie. Deze methode onderscheidt T-celhoeveelheid van cytotoxische capaciteit.

Antigen Specifieke In Vivo Killing Assay met behulp van CFSE Labeled doelcellen

Meer video's verkennen